免疫印跡雜交

1、1. 免疫印跡雜交(Westernblot)(050302A)儀器(1) 制膠模具(2) 跑膠及轉(zhuǎn)膜裝置(3) 大小玻板(4) 電泳電源2. 電磁爐試劑：(1) Trisbase、(2) SDS(3) BSA(購自Biotech)(4) Bis-acrylamide(亞甲雙丙烯酰胺)(5) Acrylamide(丙烯酰胺)(6) Glycine(7) DTT(8) NaCl(購自BBI)(9) APS(購自Amresco)3. Tween-20(溫州清明化工廠)溶液配制:(1)4xsampleBuffer終濃度Stock液10ml工作液0.25MTris-HCl,pH6.82.5M1ml8%S

2、DS20%4ml0.2MDll1M2ml30%glycerol100%3ml少量的漠酚蘭1ml/管分裝，-20C保存。4上樣緩沖液0.5mol/LTris-HCl(PH6.8)2.5ml1mol/LDM1ml甘油1.5mlSDS400mg漠酚藍5mg混勻后-20C貯存?zhèn)溆谩?0%儲備膠溶液丙烯酰胺(Acr)29.2g亞甲雙丙烯酰胺0.8g混勻后加ddH2O2,37C溶解，定容至100ml,棕色瓶存于4C。分離膠緩沖液1.5MTris-HCL(pH8.8)18.15gTris溶于適量的ddH2O2,用HCL調(diào)節(jié)pH8.8,定容至100ml,4C保存。濃縮膠緩沖液0.5MTris-HCL(pH6.

3、8)6.05gTris溶于適量的ddH2O2,用HCL調(diào)節(jié)pH6.8,定容至100ml,4C保存。10%SDS稱取10gSDS,加入雙蒸水并定容至100ml,攪拌過夜，置于室溫防止析出。10%APS稱取0.2gAPS,加蒸儲水2ml,-20C保存。電泳緩沖液(RunningBuffer,5)Tris15gSDS5gGlycine72g調(diào)節(jié)pH8.3，定容至1L臨用時用雙蒸水稀釋成1X,可重復(fù)使用3-4次(可根據(jù)電泳的速度決定下次是否使用)。轉(zhuǎn)移緩沖液(TransferBuffer,5)Tris15.15gGlycine72gSDS2.5g調(diào)節(jié)pH8.18.5,定容至1L,臨用時雙蒸水稀釋，80

4、0ml1消勺轉(zhuǎn)移緩沖液加200ml甲醇TBST緩沖液(10X)Tris-HCl(pH7.6)30.28gNaCl80.15gTween-2010ml定容至1L,臨用時雙蒸水稀釋成1X,可重復(fù)使用2-3次。封閉液10.5mgBSA溶于10ml1TBST中，攪拌均勻。封閉液210g脫脂奶粉溶于100ml的1XTBST(2) 疊氮鈉存儲液4. 一抗稀釋液上樣前準備：(1) 稀釋樣本一確定要加的每孔樣本體積(l)及上樣量(g)-計算樣本需要稀釋的終濃度-確定每個樣本需要稀釋的總體積(l),4X上樣緩沖液的體積為總體積/4(l)-根據(jù)已經(jīng)測定好的蛋白濃度計算需要的蛋白量(l)一總體積一蛋白量一4外樣緩沖

5、液=需要加的ddH2O一以下表為例樣本編號蛋白濃度樣本量4xsampleddH2O體積終濃度加樣量加樣本量(ug/ul)llll(g/ul)lgA15.0314.917.57.59302.501230A26.626.0445.96162.501230A33.6910.8341.17162.501230A44.339.2442.76162.501230A53.5011.4240.58162.501230A65.467.3344.67162.5012304.實驗步驟：(1)制膠及安裝：按照如下方式安裝，安裝好之后用水加滿以檢驗是否安裝正確。(2)做膠及安裝：將水倒干凈，按照配方配置-定量的分離膠溶

6、液(8ml)和濃縮膠溶液(5ml),過硫酸俊和TEMED在用前加入。分離膠溶液充分混勻后從一側(cè)加入灌膠模具，上方留約1.5-2cm用于加濃縮膠，小心的在分離膠的表面加一層水(或水飽和的異丙醇)，封住膠面，以促使聚合并保持膠面平整。室溫放置40分鐘到1小時后，可以看到一個界面，去掉上層覆蓋液，然后灌制濃縮膠，并插入與模具大小相同，凝膠厚度相當?shù)氖嶙?。靜止放置40-60分鐘使凝膠聚合，按照如下方法放入電泳槽中(圖中未插入梳子)。安裝好制膠模具(根據(jù)廠家說明書安裝)按下表配方灌制分離膠(SeparatingGel)，分離膠濃度視目的蛋白的大小確定(7.5-15%)(為兩塊膠用量)7.5%10%12%

7、12.5%15%DdH2O3.83ml3.2ml3.35ml2.4ml1.83ml30%丙烯酰胺2ml2.64ml4ml3.36ml4ml1.5MTris-HClpH<8.82ml2ml2.5ml2ml2ml10%SDS80l80l100l80l80l10%APS80l8050l80l80lTEMED8l8l5l8l8l總體積8ml8ml108ml8ml分離膠上覆蓋去離子水或0.1%SDS,使分離膠與空氣隔絕待分離膠聚合后棄上層水相，用去離子水洗，吸水紙吸干按下表配方灌制濃縮膠(StackingGel)4%4%6%ddH2O3.05ml4.8ml2.5530%丙烯酰胺0.67ml1.06

8、4ml1.20.5MTris-HClpH6.81.25ml2ml1.2510%SDS50l80l5010%APS50l80l50TEMED5l16l5總體積5ml（兩塊膠）8ml（四塊膠）5然后馬上插上10孔或15孔梳子，待濃縮膠聚合后，小心拔掉梳子蛋白樣本在100C煮35min使蛋白完全變性，用臺式離心機稍離心把凝膠裝在電泳裝置上，內(nèi)外槽均加入1runningbuffer,然后加樣加樣順序應(yīng)該根據(jù)實驗設(shè)計，以有利于論文發(fā)表的順利，并記錄加樣的編號如：marker、A1、A2、A3、A4、A5、A6加的樣本盡可能在中間，兩邊如有加樣孔多余，可加1X上樣緩沖液，以減少跑膠邊緣效應(yīng)100V電泳直到

9、漠酚藍條帶到分離膠底部剪下一塊與凝膠同樣大小的硝酸纖維素膜（大小可根據(jù)經(jīng)驗），放在transferbuffer中平衡在硝酸纖維素膜右上角以圓珠筆做一個標記（如“2表示不同的膠）卸膠（小心，防止膠的破碎及玻片的損傷），以硝酸纖維素膜外面的紙做標記將膠修切成一樣大小在膠的左上角（加樣開始的那端）切一個小口標記方向（不能影響樣本）把膠放在transferbuffer中平衡片刻取一容器，容器中倒入一定量的transferbuffer,在容器中安置好轉(zhuǎn)移裝置，在陰極面（黑色面）放上泡沫墊，然后放三層濾紙，把凝膠放在濾紙上，硝酸纖維素膜蓋在凝膠上，然后依次放好三層濾紙，泡沫墊，扣好轉(zhuǎn)移裝置，加入冷卻冰盒后

10、開始轉(zhuǎn)膜操作。轉(zhuǎn)膜可采用恒流，常用200300mA,一般時間約為60-120分鐘（根據(jù)目標蛋白的分子量大小而決定電壓及時間）。也可以進行預(yù)實驗，轉(zhuǎn)膜一定時間后以考馬斯亮蘭染色膠，觀察是否有殘留的樣本。所有的層面之間必須保證沒有氣泡，膠和膜必須完全吻合膠左上角的小切口與膜右上角的標記應(yīng)對在一起轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出硝酸纖維素膜或PVDF膜，在1TBST緩沖液中短暫漂洗放入封閉液中，溫和振蕩30-60分鐘把膜放入第一抗體中，溫和振蕩30分鐘后放入4C冰箱過例或室溫下反應(yīng)2小時回收第一抗體，在TBST中洗膜30分鐘，中間更換TBST23次把膜置于第二抗體(HRP標記)中，溫和振蕩12小時在TBST中洗膜2

11、3小時，中間更換4次以上依據(jù)膜的大小，取一定量的ECL溶液A液和B液，將膜在溶液中準確溫浴1分鐘瀝干膜，用保鮮膜包裹后，置暗盒中，曝光2秒-60分鐘顯影，定影5. 或者(這兩塊請補充細化)把膜置于第二抗體(熒光標記)中，溫和振蕩12小時在TBST中洗膜23小時，中間更換4次以上數(shù)據(jù)分析：X光片用掃描儀掃描，然后用MetaMorph軟件讀integratedOD值注意點：(1) 在使用4Xsamplebuffer時，應(yīng)使緩沖液充分融解再使用，不能有沉淀；(2) 建議蛋白樣品小份分裝，用一次取一份，避免反復(fù)凍融和煮樣品，如需第二次使用已用過的樣本，應(yīng)同樣用100C水煮，時間為1min;加樣時每塊膠

12、應(yīng)有相應(yīng)的蛋白分子量標準和對照，并保持對照的始終一致。在抗原非常熟悉以后，可以適當減少蛋白分子量標準的使用以降低成本；(3) 加runningbuffer時內(nèi)外槽不能貫通；做電轉(zhuǎn)移時，泡沫墊、濾紙、凝膠、硝酸纖維素膜之間不能留有氣泡，每加一層都要趕氣泡。第一次做電轉(zhuǎn)移，對于轉(zhuǎn)移時間不能確定時，可將轉(zhuǎn)移后的膠進行考馬斯亮蘭染色，如染不出蛋白條帶，說明轉(zhuǎn)移已完全，否則需延長轉(zhuǎn)移時間；(4) 膜與膠的大小必須一樣，否則影響轉(zhuǎn)移效率；(5) 所有反應(yīng)時間應(yīng)根據(jù)溫度的高低適當調(diào)整；(6) 曝光及顯影的時間可根據(jù)條帶及背景的情況適當調(diào)整；(7) 第二抗體反應(yīng)以后洗膜一定要徹底。(8) 在加過硫酸鉉和TEM

13、ED之前溶液最好抽氣，防止溶解在溶液里的分子氧在聚合時產(chǎn)生氣泡使膠不均一。(9) 過硫酸鉉和TEMED的量應(yīng)根據(jù)室溫和聚合情況而定。(10) 分離膠聚合后最好在4oC放置12小時后再使用，以使凝膠充分聚合，改善電泳時的分辨率。(這一步有爭議，有人認為4oC可以使SDS析出，影響分離結(jié)果)(11) 上樣體積不要太多，否則會影響旁邊泳道的最終結(jié)果。6. 問題與對策Westernblot實驗過程比較簡單，但在整個實驗過程可以受到多個環(huán)節(jié)的影響，導(dǎo)致沒有結(jié)果或者條帶較弱，也可以出現(xiàn)背景過高，影響結(jié)果分析，我在此拋磚引玉，希望大家能夠根據(jù)自己的經(jīng)驗對我的內(nèi)容進行補充，以便于大家都能做好，但最重要的是做每

14、一步實驗時都要非常仔細。(1)沒有條帶或者條帶弱：-蛋白樣本：?蛋白在提取可能被降解：此時可以在膠上負載不同濃度的樣本，跑膠后以考馬斯亮蘭染色，正常時條帶很多，呈現(xiàn)梯子一樣的條帶，如果蛋白被降解，階梯狀條帶不明顯，并且可在條帶上出現(xiàn)連續(xù)的片狀(如掃把掃過)。?加樣時漏出，加樣不足：可請經(jīng)驗豐富的人加同樣的樣本作為對照。?目的蛋白表達過低，此時可用陽性對照樣本，如腦內(nèi)表達較低的目的蛋白可以尋找表達較高的組織用于對照。一轉(zhuǎn)膜不完整：?在轉(zhuǎn)膜過程中由于試劑或者轉(zhuǎn)膜電流、時間等因素導(dǎo)致轉(zhuǎn)膜不完整：可在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后對膠進行考馬斯亮蘭染色，觀察是否有蛋白留在膠上。一一抗、二抗效價過低?由于一抗的效價過低導(dǎo)致

15、沒有結(jié)果，此時可檢測一抗的效價，將一抗以推薦濃度作為中間濃度，往高、低各稀釋成不同的濃度，如1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000等，取稀釋液10l直接滴在硝酸纖維素膜上，做好標記(如下圖)，等干燥后進行封閉洗膜二抗孵育洗膜顯影。觀察哪個濃度可以出現(xiàn)較好的顯影，可取稍高的濃度用于實驗。1:2001:5001:10001:200015000?由于二抗的效價過低導(dǎo)致沒有結(jié)果，此時可檢測二抗的效價，同上將二抗以推薦濃度作為中間濃度，往高、低各稀釋成不同的濃度，如1:200、1:500、1:1000、1:2000、1:5000等，取稀釋液10l直接滴在硝酸纖維素膜上，做好標記

16、，等干燥后進行洗膜顯影。觀察哪個濃度可以出現(xiàn)較好的顯影，可取稍高的濃度用于實驗。ECL、顯影液、定影液?如果懷疑ECL失效或者敏感性降低，可選擇熒光顯影進行比較；?如果懷疑顯影液、定影液，可以進行GAPDH等在暗室內(nèi)可肉眼看到明顯熒光的目的蛋白進行排除。另外：ECL顯影和熒光顯影可以相互交叉進行，使結(jié)果更加漂亮。(2) 背景過高：一蛋白加樣量過高：此時可選擇一個樣本，加不同的蛋白量，如2、5、20、30、50g/孔，取一個合適的加樣量。一一抗、二抗?jié)舛冗^高，此時可以參考點膜的結(jié)果。一洗膜時間過短，可延長洗膜的時間。-封閉不夠完全，可增加脫脂奶粉或者BSA的濃度，或者在脫脂奶粉與BSA之間重新選擇，或者增加封閉的時間。-洗膜不均勻，尤其是在同一個容器內(nèi)有多張膜時，容易疊加，相互影響，可以在洗膜時多做觀察，以確保每張膜都洗得比較充分，或者分開在不同容器內(nèi)洗膜。7. 主要參考文獻：(1) LuoJH,WangY,YasudaRP,DunahAW,WolfeBB.ThemajorityofN-methyl-D-aspartatereceptorcomplexesinadultratcerebralcortexcontainatleastthreediffere