第一章基因和基因組及基因工程概念

1、第一章基因和基因組及基因工程概念九、目的基因的高效表達(dá)（一）、基因表達(dá)的基礎(chǔ)知識（一）、基因表達(dá)的基礎(chǔ)知識（二）、原核生物基因表達(dá)的基本特點（二）、原核生物基因表達(dá)的基本特點（三）、提高目的基因高效表達(dá)的途徑（三）、提高目的基因高效表達(dá)的途徑 （四）、目的基因高效表達(dá)規(guī)律（四）、目的基因高效表達(dá)規(guī)律（一）、基因表達(dá)的基礎(chǔ)知識（一）、基因表達(dá)的基礎(chǔ)知識1 概念： 1-1 以mRNA為模板的蛋白質(zhì)合成過程稱為翻譯或轉(zhuǎn)譯1-2 mRNA： 從DNA到蛋白質(zhì)的信息傳遞載體1-3 遺傳密碼： 3個堿基編碼一個氨基酸，這三個堿基被稱為三聯(lián)體密碼或密碼子2 核糖體：合成蛋白質(zhì)的“工廠”核糖體由兩個亞基構(gòu)成，

2、一個較大，一個較小原核生物原核生物核糖體30S亞基50S亞基21種蛋白質(zhì)16SrRNA34種蛋白5SrRNA23SRNA真核生物核糖體40S亞基60S亞基30多種蛋白質(zhì)18SrRNA50多種種蛋白5SrRNA28SRNA3.蛋白質(zhì)的合成機(jī)理（以原核生物為例）肽鏈延伸的方向：N末端C末端mRNA的翻譯方向：53方向tRNA識別密碼子，并轉(zhuǎn)運氨基酸合成的起始：大腸桿菌中被翻譯的第一個密碼子往往是5端的第25個核苷酸以后，起始密碼子：AUG，偶有GUG，在上游約10個bp的地方往往有一段富含嘌呤的序列（SD序列），它與16SrRNA3端互補(bǔ)。合成的步驟：新進(jìn)入的酰胺-tRNA結(jié)合到核糖體上肽鏈的形成

3、移位合成的終止：識別終止信號： UAG，UAA，UGA4-1 信號肽：在真核生物中，當(dāng)某一種多肽的N末端剛開始合成不久，這種多肽的取向就被決定，這是因為受這個N末端的信號肽的控制。 在細(xì)菌中，也存在類似情況，新生肽的N末端也有一段信號肽結(jié)構(gòu)，有時也叫引導(dǎo)肽4 多肽合成后的定向加工與轉(zhuǎn)譯后加工4-2 多肽的修飾： N末端信號肽的切除 二硫鍵的形成 線性多肽呈現(xiàn)出一定空間結(jié)構(gòu) 多肽鏈的糖基化等 原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)識別原核細(xì)胞的啟動子，催化所有RNA的合成。 原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。 由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的（二）、原核生物基因

4、表達(dá)的特點（二）、原核生物基因表達(dá)的特點 原核基因一般不含有內(nèi)含子，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。 原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。 在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S核糖體RNA 3，末端堿基互補(bǔ)的序列，即SD序列，而真核基因則缺乏此序列。（三）、提高目的基因高效表達(dá)的途徑（三）、提高目的基因高效表達(dá)的途徑一個含有目的基因的受體細(xì)菌能否高效表達(dá)，將一個含有目的基因的受體細(xì)菌能否高效表達(dá)，將取決于基因的結(jié)構(gòu)特征、宿主菌、載體構(gòu)建取決于基因的結(jié)構(gòu)特征、宿主菌、載體構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng)等多個方面。對于原核生物的細(xì)和細(xì)

5、胞培養(yǎng)等多個方面。對于原核生物的細(xì)菌等受體來說，提高目的基因表達(dá)效率主要菌等受體來說，提高目的基因表達(dá)效率主要從以下幾個方面考慮：從以下幾個方面考慮：1.目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面2.目的產(chǎn)物本身目的產(chǎn)物本身3.宿主菌改造方面宿主菌改造方面4.宿主菌培養(yǎng)方面宿主菌培養(yǎng)方面1、目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面、目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯方面1-1啟動子對表達(dá)效率的影響啟動子對表達(dá)效率的影響 影響外源DNA轉(zhuǎn)錄的主要因素是啟動子的強(qiáng)弱。 啟動子是宿主細(xì)胞的RNA聚合酶轉(zhuǎn)移結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的合成mRNA的部位。大多數(shù)外源的特別是真核細(xì)胞的啟動子不能被細(xì)菌（大腸桿菌）RNA聚合酶識別，因此必須將外源基因

6、置于大腸桿菌啟動子控制下。 啟動子的強(qiáng)弱必須適合，太強(qiáng)不利于宿主菌的正常生長代謝，太弱則目的基因轉(zhuǎn)錄太少，不利于目的產(chǎn)物的表達(dá)。 1-2 轉(zhuǎn)譯起始序列對翻譯水平的影響轉(zhuǎn)譯起始序列對翻譯水平的影響 翻譯水平的影響外源基因的表達(dá)的重要因素是翻譯起始區(qū)。翻譯是在核糖體上進(jìn)行，SD序列對翻譯是必須，而且它也能影響到翻譯的效率。 1-3 充分考慮宿主菌對密碼子的偏愛性 大腸桿菌不同密碼子的偏愛性問題，將64組密碼子分為強(qiáng)、中、弱密碼子。2 目的產(chǎn)物方面目的產(chǎn)物方面2-1 目的基因不溶性的高效表達(dá)過程：目的基因編碼的真核蛋白質(zhì)與宿主基因編碼的原核多肽或或其它基因編碼的具有其它功能的多肽和結(jié)合在一起，這種結(jié)

7、合在一起的形成的不溶性無活性的包涵體，又叫為融合蛋白。舉例：胰島素與-半乳糖苷酶形成包涵體優(yōu)點：避免細(xì)菌蛋白酶破壞，提高目的基因表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量。缺點：需要經(jīng)過溶解和復(fù)性才能獲得有活性的適合：不需要翻譯后修飾的蛋白質(zhì)產(chǎn)物2-2目的基因的高效可溶性表達(dá) 概念：不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白。 這種蛋白質(zhì)或者能夠抵抗蛋白酶的水解，或者是在蛋白酶缺失的條件下生成。 優(yōu)點： 無需經(jīng)過融合蛋白階段，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。 缺點：容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。 適合：需要蛋白酶缺陷菌作為宿主菌或這改變啟動子強(qiáng)度、或者改變宿主菌的培養(yǎng)條件。 舉例：大腸桿菌蛋白

8、酶的合成主要依賴次黃嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受體菌，則使大腸桿菌蛋白酶合成受阻，從而使目的基因的表達(dá)產(chǎn)物得到保護(hù) 2-3目的基因的高效分泌表達(dá)概念：目的蛋白分泌到細(xì)胞周質(zhì)和目的蛋白轉(zhuǎn)運到細(xì)胞周質(zhì)后再分泌到細(xì)胞外優(yōu)點： 防止宿主菌對表達(dá)產(chǎn)物的降解；有利于蛋白質(zhì)正確折疊，形成天然構(gòu)象減輕宿主細(xì)胞代謝負(fù)荷有利于分離需要在質(zhì)粒設(shè)計時加入一段信號肽基因3 宿主菌改造宿主菌改造3-1 改造受體菌的遺傳性減少或消除乙酸的生產(chǎn)。乙酸的大量累計會嚴(yán)重抑制菌體生長和目的基因的表達(dá)。遺傳工程改造途徑如圖減少酶1活性，減少病痛酸的合成減少酶7活性，減少乙酸的形成克隆酶3基因，使反映向乙偶姻的方

9、向合成3-2 遺傳改造工程菌的輸氧能力，不再使貧氧成為工程菌限制因子。因為，在一般情況下，溶解氧是菌體生長的限制因子。4 .宿主菌培養(yǎng)方面宿主菌培養(yǎng)方面 影響重組菌表達(dá)效率的的生理代謝和培養(yǎng)條件 重組菌的質(zhì)粒丟失傾向 重組菌的能量分流現(xiàn)象 目的蛋白往往是異源蛋白質(zhì)，會宿主菌有危害 細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會產(chǎn)生乙酸等抑制性有機(jī)酸41提高工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性1）在質(zhì)粒構(gòu)建時，比如加入抗性基因，在培養(yǎng)中就加入抗生素，就會抑制不含質(zhì)粒的細(xì)胞比例創(chuàng)造了條件2）在工程菌培養(yǎng)過程中： 適當(dāng)降低菌體的生長速率 細(xì)胞生長期和誘導(dǎo)表達(dá)分段培養(yǎng)策略42重組體的高密度培養(yǎng)（1）宿主菌和培養(yǎng)基 選擇合適的宿主均。因為不同的宿主

10、菌或同一宿主菌的不同種或亞種不僅對外源蛋白的表達(dá)有很大影響，而且還影響相應(yīng)的重組菌的高密度培養(yǎng) 培養(yǎng)基的成分也影響到重組宿主菌的高密度培養(yǎng)。比如大腸桿菌的高密度培養(yǎng)，常采用半合成培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的各組分的濃度和比例要恰當(dāng)。（2）流加（補(bǔ)料）發(fā)酵實現(xiàn)高密度重組菌培養(yǎng)（3）減少乙酸等抑制性副產(chǎn)物的形成大腸桿菌、枯草桿菌和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)時分別會產(chǎn)生乙酸、丙酸及乳酸等移植性產(chǎn)物危害：影響細(xì)胞生長，抑制產(chǎn)物表達(dá)改進(jìn)措施（以大腸桿菌為例）： 降低比生長速率 降低培養(yǎng)溫度 限制性的加葡萄糖 基因工程菌培養(yǎng)和乙酸分離耦合過程 （四）、目的基因高效表達(dá)規(guī)律（四）、目的基因高效表達(dá)規(guī)律1.目的蛋白無須變形和復(fù)性就

11、具有生物活性的表達(dá)方式2.對于翻譯后需要修飾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，能夠進(jìn)行目的蛋白結(jié)構(gòu)修飾的表達(dá)方式3.能夠?qū)⒛康牡鞍追置诘郊?xì)胞周質(zhì)、特別是分泌到細(xì)胞外的分泌型表達(dá)方式4.降低不含目的基因細(xì)胞的比例，保持目的基因的穩(wěn)定性，使目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)長時間超持和表達(dá)5.通過選擇好的培養(yǎng)方法和能夠進(jìn)行高密度培養(yǎng)的細(xì)胞，提高細(xì)胞密度6.在宿主細(xì)胞選擇、質(zhì)粒構(gòu)建、培養(yǎng)基設(shè)計都應(yīng)該考慮有利于產(chǎn)物的分離提純十、基因工程的應(yīng)用（一）基因工程制藥1、概述：利用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物 生物技術(shù)的核心是基因工程，基因工程技術(shù)最成功的成就就是用于生物治療的新型生物藥物的研制第一個基因重組產(chǎn)品，也是第一個基因工程藥物人胰島素

12、于1982年在美國問世我國第一個基因工程藥物干擾素-1b 于1989年上市2、基因工程藥物 激素和多肽類：缺乏天然內(nèi)源性蛋白所引起的疾病，如人胰島素、人生長激素、降鈣素和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子 酶類：利用催化反應(yīng)，達(dá)到治療目的，如tPA, 尿激酶和鏈激酶等 重組疫苗：防止病毒引起的人和動物傳染性疾病疫苗。 單克隆抗體：既可用于疾病診斷，也可用于治療。3 舉例：糖尿病、胰島素與基因工程 關(guān)于糖尿?。禾悄虿∈且环N常見的內(nèi)分泌疾病, 是因胰島素絕對或相對不足或靶細(xì)胞對胰島素敏感性減低引起以糖代謝紊亂為主, 繼發(fā)脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)代謝障礙?？煞譃橐葝u素依賴型糖尿病(又稱 型) 和非胰島素依賴型糖尿病(

13、又稱型)胰島素的結(jié)構(gòu)和作用結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)：胰島素，有AB兩條肽鏈組成，它們中間通過3個二硫鍵結(jié)合起來，其中A鏈21個氨基酸，B鏈30個氨基酸。功能功能：胰島素最顯著的生理功能是：一方面提高組織攝取葡萄糖的能力；另一方面抑制肝糖元分解，并促進(jìn)肝糖元及肌糖元的合成。在生物體內(nèi)，胰島素是在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體上合成的，其合成過程是：前胰島素原 胰島素原 胰島素胰島素原，它可以看成是有一條連接肽（簡稱C肽）的一端通過兩個堿性氨基酸（第62、63位）與胰島素A鏈的N末端相連，另一端通過與另外兩個堿性氨基酸殘基（第31、32位）與B鏈C末端相連。不同種屬動物的C肽不同，例如人的31肽，豬的29，牛的26。胰島素原

14、保證了胰島素折疊卷曲，保證了三個位置正確的二硫鍵的形成。前胰島素原，它比胰島素原的末端上多一段肽鏈，即信號肽，含20個氨基左右，其中多是疏水側(cè)鏈殘基。生成過程：前胰島素原在信號肽的引導(dǎo)下進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。待肽鏈進(jìn)入腔后，立即被信號肽酶切去“前”順序。形成的胰島素原后，又被運輸?shù)礁郀柣w然后貯存在貯存顆粒中，并在特異肽酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚砸葝u素，肽酶催化胰島素原的二個特定肽鍵的斷裂，釋放出一段中間的肽鏈，這個端肽鏈又在肽酶的作用下從鏈的兩端各除去2個氨基酸殘基而生長C肽。 關(guān)于胰島素在體內(nèi)的合成胰島素的化學(xué)合成u1965年我國科學(xué)工作者完成了牛胰島素的全合成。他們合成牛胰島素的主要途徑是先分別合成A

15、鏈21肽和B鏈30肽，再將A、B兩條肽鏈經(jīng)還原、氧化連接成牛胰島素、u美國的Merrifield等人報導(dǎo)，他們利用固相多肽合成的方法，合成了胰島素的A鏈和B兩條鏈，A鏈全部用了8天時間，B鏈用了11天時間。獲得基因途徑1：Itakura等人提出的，通過化學(xué)合成胰島素基因再重組表達(dá)，即先幾十個DNA片段，然后連接起來分別得到A鏈和B鏈基因，然后把這兩個基因分別表達(dá)，再組合成人胰島素。但這個方法，二硫鍵正確配比率比較低，后來有人就合成簡化的C肽基因，再連接A、B鏈構(gòu)成胰島素原基因。基因工程生產(chǎn)胰島素獲得目的基因途徑2：將前胰島素原的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在大腸桿菌中表達(dá)途徑：在大腸桿菌中表達(dá)途

16、徑2：在酵母中表達(dá)基因治療糖尿病基因治療：是指在基因水平上將正常有功能的基因或其他基因通過基因轉(zhuǎn)移的方式將目的基因?qū)氚屑?xì)胞并使之有效表達(dá)相應(yīng)的產(chǎn)物,從而達(dá)到治療某種疾病的目的。轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞根據(jù)轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞不同分為生殖細(xì)胞基因治療和體細(xì)胞基因治療兩種途徑。生殖細(xì)胞基因治療是，將目的基因直接轉(zhuǎn)入受精卵內(nèi)。因轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞的隨機(jī)整合性和可傳代性, 以及其對人類長期影響不能完全預(yù)知, 并還涉及倫理學(xué)的問題, 因此目前尚不考慮生殖細(xì)胞基因治療途徑。體細(xì)胞胰島素基因轉(zhuǎn)移可分為體外和體內(nèi)兩種。前者是先從體內(nèi)取出部分靶細(xì)胞, 經(jīng)體外培養(yǎng), 基因轉(zhuǎn)入, 篩選出目的基因所表達(dá)的細(xì)胞, 再植回體內(nèi); 后

17、者則是經(jīng)靜脈或門靜脈系統(tǒng), 直接將有轉(zhuǎn)染能力的重組基因顆粒轉(zhuǎn)入活體內(nèi)的靶細(xì)胞, 這些研究表明體細(xì)胞胰島素基因轉(zhuǎn)移治療糖尿病是有希望的。 目的基因的轉(zhuǎn)入方式有理化方法和生物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法, 而后者占目前已運用的80% , 其中逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)較為成熟, 應(yīng)用廣泛, 在基因治療中起主導(dǎo)作用。作為基因載體的病毒, 必須首先進(jìn)行改建, 使其能攜帶目的基因, 并能定向與特異靶細(xì)胞結(jié)合, 將目的基因整合到靶細(xì)胞的染色體并產(chǎn)生表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體具有可轉(zhuǎn)染的靶細(xì)胞種類多、轉(zhuǎn)染效率高、目的基因可精確地整合到靶細(xì)胞的基因組中等優(yōu)點。目的基因的導(dǎo)入但是, 逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)也存在著弊端, 即攜帶

18、基因不能長于8kb, 僅能轉(zhuǎn)染分裂繁殖的靶細(xì)胞, 最引起人們重視的是其安全性問題3: (1) 逆轉(zhuǎn)錄病毒基因隨機(jī)插入可能引致抑癌基因失活或原癌基因的激活, 但可能性極小。(2) 逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)可能發(fā)生同源重組, 從而產(chǎn)生有復(fù)制能力的逆轉(zhuǎn)錄病毒, 誘發(fā)其他疾病。因此, 科學(xué)家們正致力于構(gòu)建新的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體4, 使其更具安全性。選擇型糖尿病體細(xì)胞基因治療的靶細(xì)胞時應(yīng)考慮到: 有利于胰島素基因表達(dá)和具有加工胰島素原為成熟胰島素能力的組織特異性表達(dá)細(xì)胞。目前 型糖尿病基因治療僅停留在動物實驗水平, 用于糖尿病鼠基因治療研究的主要有三類靶細(xì)胞: 一類為胸苷激酶缺乏(Ltk2) 的鼠成纖維細(xì)胞; 一類來

19、自鼠垂體前葉的ACTH 瘤細(xì)胞(A tT 220); 第三類為鼠肝細(xì)胞。而肝細(xì)胞具有細(xì)胞類似的一些組織細(xì)胞特點, 除參與葡萄糖代謝和蛋白質(zhì)合成外, 還表達(dá)細(xì)胞分泌胰島素所需的特異性葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(GLU T 2 ) 和葡萄糖激酶(GK)。其特殊的解剖部位和血液循環(huán)特點, 使靜脈或腹腔途徑移植轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞較易進(jìn)入肝、脾等內(nèi)臟, 而且可以通過這兩條途徑直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移, 因此肝細(xì)胞是糖尿病基因治療非常有前途的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞選擇 目前, 目的基因的導(dǎo)入體內(nèi)并在靶細(xì)胞中表達(dá)看來并不十分困難, 但是要使其表達(dá)調(diào)控達(dá)到生理或預(yù)想的治療水平則并不容易。 型糖尿病基因治療中, 胰島素的合成和分泌需要有精確的調(diào)控。分泌水平過高則造成低血糖死亡, 分泌水平過低又不能滿足治療要求。胰島素的基因表達(dá)是一個十分復(fù)雜的問題, 也是基因治療的一個關(guān)鍵問題。困難（二）基因組工程1 概念基因組：是表示某物種單倍體的總基因組：是表示某物種單倍體的總DNA，對于二倍體高等