時(shí)間分辨技術(shù)的原理最新資料全

1、時(shí)間分辨技術(shù)的原理目前最先進(jìn)的免疫檢測(cè)技術(shù)：1、時(shí)間分辨原理：用三價(jià)稀土離子及其鰲合劑作為示蹤物，代替熒光物質(zhì)、同位素或酶，標(biāo) 記蛋白質(zhì)、多胎、激素、抗體、核酸探針或生物流行性細(xì)胞，當(dāng)反應(yīng)體系發(fā)生 后，用時(shí)間分辨儀器測(cè)定最后產(chǎn)物中熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度或相對(duì)熒光強(qiáng)度 比值，來(lái)判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達(dá)到定量分析之目的。2、時(shí)間分辨原子標(biāo)記物的特點(diǎn)：發(fā)射光和激發(fā)光有較大的 STOKE位移一一高特異性 長(zhǎng)壽命熒光，降低其他物質(zhì)的熒光干擾一一高靈敏度 半衰期長(zhǎng)達(dá)幾十萬(wàn)年，試劑受干擾小高穩(wěn)定性原子標(biāo)記與大分子標(biāo)記物的對(duì)比原子標(biāo)記物大分子標(biāo)記物標(biāo)記位點(diǎn)多個(gè),可達(dá)20個(gè)只有1個(gè)對(duì)被標(biāo)記物蛋白活性的影響

2、影響小，基本無(wú)影響影響大,經(jīng)常影響蛋白活性對(duì)被標(biāo)記物空間結(jié)構(gòu)的影響無(wú)影響,保證穩(wěn)定性影響大，造成試劑的不穩(wěn)定受環(huán)境因素的影響影響小影響大,溫度影響3、波長(zhǎng)分辨：標(biāo)記離子的熒光激發(fā)光波長(zhǎng)圍較寬，發(fā)射光光譜圍較窄，是類(lèi)線(xiàn)光譜，有利 于降低本底熒光強(qiáng)度，提高分辨率。激發(fā)與發(fā)射光之間有一個(gè)較大的 STOKE位移，有利于排除非特異熒光的干擾， 增強(qiáng)測(cè)量的特異性。4、時(shí)間分辨: 標(biāo)記離子螯合物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度高，壽命長(zhǎng)，有利于消除樣品及環(huán)境中熒光 物質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。每一秒名檢測(cè)樣品1000次，取其中不受干擾的400次的均值作為測(cè)定值，有 利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。時(shí)間分辨技術(shù)取代酶免、放免是免疫檢測(cè)技術(shù)發(fā)展

3、的必然趨勢(shì)！RIA （放免）放射性（1251），對(duì)環(huán)境和身體的危害，已經(jīng)為重視環(huán)保的國(guó)家逐步取消，如 整個(gè)歐洲僅尚存幾個(gè)放免試驗(yàn)室。125I半衰期短，導(dǎo)致試劑的有效期短，需每次定標(biāo)，造成很大的浪費(fèi)。由于標(biāo)記物（125I ）的不斷變化，帶來(lái)藥盒批間、批較大的變異，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)無(wú) 法保存?zhèn)溆谩LESA（酶免）靈敏度、重復(fù)性不及放免，易造成漏檢和假陽(yáng)性。酶的純度和反應(yīng)過(guò)程容易受環(huán)境因素影響，導(dǎo)致穩(wěn)定性、重復(fù)性不好。與其它技術(shù)的相對(duì)優(yōu)勢(shì)：（1）、是現(xiàn)有的免疫檢測(cè)方法中靈敏度最高的（2）、是現(xiàn)有的免疫檢測(cè)方法中穩(wěn)定性最好的（3）、多標(biāo)記檢測(cè)是目前所有免疫檢測(cè)技術(shù)中獨(dú)一無(wú)二的TRF技術(shù)與電化學(xué)發(fā)光的比較時(shí)間

4、分辨熒光電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物四種原子：Eu,Sm,Te,Dy一種原子：釘多標(biāo)記技術(shù)有無(wú)科研項(xiàng)目能（1000多種科研項(xiàng)目）無(wú)試劑種類(lèi)58種臨床,24種科研,共82種40種臨床，無(wú)科研試劑價(jià)格低高TRF與化學(xué)發(fā)光的比較時(shí)間分辨熒光化學(xué)發(fā)光發(fā)光效率95%1%重復(fù)檢測(cè)可無(wú)數(shù)次重復(fù)不可重復(fù)本底噪聲零本底干擾大靈敏級(jí)數(shù)10-1910-15標(biāo)記物原子大分子化合物標(biāo)記位點(diǎn)每個(gè)抗體可達(dá)20個(gè)1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)穩(wěn)定達(dá)一年以上穩(wěn)定2到4周多標(biāo)記有,最多可達(dá)四標(biāo)記無(wú)科研開(kāi)發(fā)有無(wú)時(shí)間分辨熒光免疫定量分析簡(jiǎn)介時(shí)間分辨熒光分析（Timeresolved Fluoroimmu noassay,TRFIA是一種非同位素免疫分 析技術(shù)，它

5、用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè) 量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非異熒光的干擾，極提高 了分析靈敏度。解離增強(qiáng)鑭元素?zé)晒饷庖叻治鍪菚r(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié) 構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體抗原分子上的自由氨基連接，形成EU 標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過(guò)免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非 常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使Eu3+從復(fù)合物上解離下來(lái)，自由Eu3+同增強(qiáng)劑中的另一種螯 合劑螯形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百 萬(wàn)倍

6、。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱(chēng)為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥Ｒ腋尾《荆℉BV標(biāo)記物的檢測(cè)方法常用測(cè)定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物，由0年代末 70年代初的瓊脂擴(kuò)撒法，依次發(fā)展為血凝法-酶聯(lián)免疫吸附（ELISA、同位素免疫標(biāo)記（RIA） -化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記和0年代中建立的稀土離子熒光標(biāo)記 （時(shí)間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，其方法每 發(fā)展一步，乙肝標(biāo)記物檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性都得到不同的提高。時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRF為近年新研制成功的用三價(jià)稀土離子作為示蹤物，以單克 隆抗體包被支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入有銪E

7、U標(biāo)記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)，可大大 降低一般同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)性，TRF法檢測(cè)乙肝 病毒標(biāo)記物較其他方法靈敏度高、特異性好，干擾因素少TRF為目前檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物最 理想的方法。TRF定量檢測(cè)乙肝病毒“兩對(duì)半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分析HBV感染情況、療效的觀察和轉(zhuǎn)歸等情況的分析，至少可對(duì)下列情況更具有獨(dú)特的診斷價(jià)值:1治療前進(jìn)行病毒定量檢測(cè)，可以指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、治療后定量間接判斷體病毒數(shù)量，有助于療效的觀察。3、懷孕前進(jìn)行定量測(cè)定，有助于選擇有利于的懷孕時(shí)機(jī)。乙肝孕婦進(jìn)行定量檢查，有助于使 部分病人得到及時(shí)的正

8、確的診斷目前我科已正式開(kāi)展了乙肝二對(duì)半的TRFIA定量分析，其每一項(xiàng)的正常值圍均是由我國(guó)衛(wèi) 生部根據(jù)美國(guó)雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定其靈敏度，準(zhǔn)確度,及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA法， 乙肝兩對(duì)半的定量制定將給臨床提供一個(gè)關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。1 極提高了檢測(cè)的靈敏度時(shí)間分辨熒光免疫定量技術(shù)（TRFIA檢測(cè)HbsAg靈敏度可達(dá)0.2ng/ml,而酶標(biāo)（EIASA檢測(cè)的靈敏度是2ng/ml,極提高檢測(cè)的靈敏度。因此，在急性乙肝 早期能及早檢出HbsAg確證HBV感染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低濃虔bsAg攜帶者；在 部分慢性乙肝患者中，由于機(jī)體缺乏對(duì)HBV包蟆蛋白的免疫應(yīng)答

9、,HbsAg表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測(cè) 可出現(xiàn)HbsAg和HbsAb勻陰性的情況，TRF技術(shù)則可避免這些情況的發(fā)生，為正確判斷病情提 供依據(jù)。2、能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情1）定量分析HBsA研口 HBsA的濃度變化,可預(yù)見(jiàn)急性乙肝是否處于恢復(fù)期如HBsAg 濃度降低，HBsAI濃度逐漸升高，可說(shuō)明病情正往恢復(fù)期發(fā)展；反之，BsAg濃度處于較高水 平或上升趨勢(shì)，而HBsAt一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。2）定量分析HBeA丙口 HBeA的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測(cè)定能 明確檢測(cè)HBeA和 HBeA轉(zhuǎn)換的時(shí)期，即表現(xiàn)為HBeA濃度下降和HBeA升高的過(guò)程。高濃 度的HB

10、eA還可間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)具有較高傳染性。高濃度的HBeA一方面提示病情好轉(zhuǎn)而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)3）HBcAb濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)。高濃度的抗Hbc提示乙肝性感染，恢復(fù)期濃度降低。慢性乙肝呈抗& Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗&Hbc 般為恢復(fù)期或既往感染。4）有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性或非活動(dòng)性的判斷。非活動(dòng)性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定， 活動(dòng)性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。3、TRFIA和定量PCR技術(shù)可互相補(bǔ)充血清HB DN熒光定量PC測(cè)定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)具有很多臨床應(yīng)用價(jià)值， 但不能完全反映病毒復(fù)制靜息期肝細(xì)胞

11、HBV病毒狀態(tài)。HBDNA陰性并不完全代表體HBV2被 清除，結(jié)合“兩對(duì)半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體HBV病毒狀態(tài)。4、HBsA 的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用HBsAb的定量測(cè)定能夠?qū)贵w是否真正具有“中和”BV勺免疫力作出正確評(píng)價(jià)，對(duì)乙肝的 預(yù)防起到監(jiān)督作用。HBsAb的含量在10mlU/ml以上病人ELISA檢測(cè)即可呈陽(yáng)性結(jié)果，但并不提 示機(jī)體都一定具有免疫力，而HBsAb勺含量在10100mlU/ml之間的樣本，定性雖為“陽(yáng)性” 但此時(shí)機(jī)體對(duì)HBV勺免疫力較弱，甚至不能預(yù)防HBV感染。只有HBsAt的含量達(dá)到100mlU/ml 以上時(shí)才可確定具有抵抗HBV入侵的作用。作定量檢測(cè)，

12、可根據(jù)HBsA啲含量判斷機(jī)體對(duì)HBV 的免疫狀態(tài)及乙肝苗的免疫效果。因此定量測(cè)定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危人群預(yù)防免疫 具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。乙肝兩對(duì)半定量的臨床意義1、乙肝表面抗原(HBsA)定量能極早地檢出HBsAg確證乙肝感染，幾乎能與)reSI同時(shí)檢測(cè)出。在乙肝病程大縮短 了窗口期的時(shí)間。由于機(jī)體常缺乏對(duì)包膜蛋白的免疫應(yīng)答，BsA表達(dá)較低，可出現(xiàn)HBsAg An ti-HBs均 陰性的情況，定量檢測(cè)HBsA則可避免這些情況的出現(xiàn)。病毒發(fā)生變異后，病毒表達(dá)量較低，甚至“定性”檢測(cè)不出抗原?？蓹z測(cè)HBsAg并 極有可能同時(shí)檢測(cè)出HBsAg Anti-HBs。國(guó)外學(xué)者

13、研究表明HBsA®勺細(xì)胞免疫應(yīng)答與肝細(xì)胞損傷有一定關(guān)系。血清中HBsAc含 量和病人對(duì)HBsA/田胞免疫成反比關(guān)系，而肝功能改就則與此種細(xì)胞免疫成反比。而定量 檢測(cè)HBsA是反映這一關(guān)系的唯一手段。一般來(lái)說(shuō)，慢性肝炎HBsAgCOffi對(duì)恒定：而活動(dòng)性肝炎HBsAgC(往往較高且不穩(wěn)定。2、乙肝表面抗體(An ti-HBs)定量Anti-HBs的定量檢測(cè)能夠地機(jī)體是否真正具有“中和HBV免疫力作為正確評(píng)價(jià)，避 免誤誤導(dǎo)病人，對(duì)乙肝的預(yù)防起到監(jiān)督作用。An ti-HBs含理在10-1OOIU/L之間的樣本，乙肝兩對(duì)半定性的結(jié)果為陽(yáng)性，但此時(shí)機(jī) 體對(duì)HB并無(wú)中和作用，仍有感染HBV勺危險(xiǎn)

14、。只有定量檢測(cè)An ti-HBs在100UI/L以上時(shí) 才具有抵抗HBV入侵的作用。因此，定量檢測(cè)乙肝兩對(duì)半對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和高危 人群預(yù)防具有重要意義。3、乙能e抗原(HBeA)定量HBeA是乙肝病毒在肝細(xì)胞在繁殖時(shí)出現(xiàn)的IC/C基因的產(chǎn)物，經(jīng)蛋白酶水解后HBeg 白質(zhì)以非顆粒形式分泌入血清中。在急性HBV感染時(shí)，血清中可出現(xiàn)HBeAg但維持可測(cè)水 平的時(shí)間很短暫（數(shù)天一數(shù)周）HBeAg日性一般是提示有大量病毒存在，是急性乙肝恢復(fù) 期的首選血清學(xué)指標(biāo)。由前C基因突變HBV感染所致的急性或慢性乙肝，始終不出HBeAg但HBV-DNS行性 復(fù)制。HBeA亦在高CO水平波動(dòng)。與前者HBeA陽(yáng)

15、性慢性乙肝類(lèi)型中的轉(zhuǎn)換期比較，兩對(duì) 半定性均表現(xiàn)為小三陽(yáng)，但后者主要表現(xiàn)在哥BeAgC（值，忽高忽低的ALT值和HBV-DNA 始終陽(yáng)性。4、乙肝e抗體（An ti-HBe定量由HBV野型株感染所引起的急性或慢性乙型肝炎，其自然史分為HBeAg陽(yáng)性期和 Anti-HBe陽(yáng)性期。定量監(jiān)測(cè)能明確出HBeA向Anti-HBe換的時(shí)期，即表現(xiàn)為HBeAgCOI 降（含量降低）和Anti-HBeCO下降（含量升高）的過(guò)程。因此,Anti-HBe定量與HBeAg 定量聯(lián)合檢測(cè)對(duì)監(jiān)測(cè)HBV感染的病程及藥物的療效觀察有很好的實(shí)際意義。由前C基因突就株HBV感染所致異型慢性乙肝，由于患者始終不出珊BeAg因此，

16、長(zhǎng) 期監(jiān)測(cè)患者An ti-HBe含量對(duì)判斷其預(yù)后和轉(zhuǎn)歸具有十分重要的價(jià)值。5、乙肝核心抗體 Anti-HBc）定量乙肝病毒由外殼HBsA和核HBeA組成。乙肝病毒感染期間，一般會(huì)產(chǎn)生An ti-HBc, 在HBeA出現(xiàn)后即可從血清中檢測(cè)到。偶爾也有nti-HBe陰性的HBV感染者，多見(jiàn)于免疫 抑制的病人。在乙肝感染康復(fù)者HBsAg攜帶者中，Anti-HBe可長(zhǎng)期存在。因此，在特殊人群中開(kāi)展 An ti-HBe篩選試驗(yàn)對(duì)預(yù)防乙肝的傳播有重要參考價(jià)值。An ti-HBe定量懷其他HBV式驗(yàn)一同檢測(cè)有助于乙肝感染的診斷和監(jiān)測(cè)。在其他指標(biāo)缺 乏的情況下（如HBsA陰性），Anti-HBe定量可能是現(xiàn)存

17、HBV感染的唯一指標(biāo)時(shí)間分辨免疫熒光法檢測(cè)乙型肝炎病毒標(biāo)志物臨床工作中發(fā)現(xiàn)少部分經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)僅乙型肝炎表面抗原HBsA) 和抗HBc IgG陽(yáng)性的患者，病毒含量卻很高。為此，采用時(shí)間分辨免疫熒光分析法TRF對(duì) 34例此類(lèi)患者進(jìn)行乙型肝炎標(biāo)志物HBV M的檢查，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：一、資料與方法1. 病例選擇：為2002年2月至9月住院或門(mén)診患者，共34例，男21例，女13例，年齡 558歲，平均(29.2 ±18.7)歲。采靜脈血分離血清，用ELISA進(jìn)行HB標(biāo)志物(HBV M檢 測(cè)及HBV DN定量檢查。留取血清置30C保存。(1) HBsAg抗HBc IgG陽(yáng)性，

18、乙型肝炎e抗 原(HBeAg 抗-HBs 抗-HBcIgM陰性；(2) HBNDNA含量104拷貝/ml; (3)近3個(gè)月未使 用抗病毒藥物。每人進(jìn)行2次抗原抗體檢查，結(jié)果一致。2次HBV DN檢查，結(jié)果相差1個(gè)數(shù) 量級(jí)以下。2. 常規(guī)HBV M檢測(cè)：用ELISA法，試劑為科華生物工程股份產(chǎn)品，按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作。3. HBV DNA含理測(cè)定：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，試劑盒購(gòu)自醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因診斷中 心。儀器為美國(guó)Perkin Elmer公司Gene Amp E57型PCR儀。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，檢測(cè)靈 敏度為103拷貝/ml。4. TRF法檢查HBVM試劑為新波生物技術(shù)產(chǎn)品，采用Xnytest

19、2000時(shí)間分辨檢測(cè)儀。嚴(yán) 格按照說(shuō)明書(shū)操作。5. 統(tǒng)計(jì)分析：取HBV DN含量的對(duì)數(shù)值進(jìn)行成組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較，行檢驗(yàn)。二、結(jié)果1. HBV M :用TRF法檢查發(fā)現(xiàn),34例患者中HBsAgHBeAg抗-HBc陽(yáng)性者15例，HBsAg 抗-HBe抗-HBc均陽(yáng)性者14例，僅HBsAg 抗-HBc陽(yáng)性者5例。即用ELISA檢查時(shí)HBeAg 假陰性15例，抗-HBe假陰性14例(表1)。2. HBV DNA含量：HBeA及抗-HBc均陰性組、HBeA©日性組、抗HBc陽(yáng)性組HBV DN含 量的對(duì)數(shù)平均值分別為645±1.74、7.29±1.59、5.80

20、7;1.46。將前者與后兩組分別進(jìn)行成 組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn)，t值分別為1.005、0.816, P值均0.05,差異無(wú)顯著 性。三、討論HBV M勺變化是評(píng)估HBV感染后病情轉(zhuǎn)歸的重要依據(jù)，也是抗病毒治療的療效考核指標(biāo) 之一。通過(guò)TRF僉查發(fā)現(xiàn),大部分ELISA法檢測(cè)為HBsA抗-HBc陽(yáng)性模式的患者其實(shí)為HBeAg 假陰性（15/34, 44.12%及抗-HBe假陰性（14/34, 41.18%。僅少部分可能為病毒變異的 結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)，HBsAg 抗-HBc濃度顯著高于正常，ELISA及 TRF符全率為100%抗-HBs 濃度明顯低于正常，兩者符合率為00%而HBeAg抗HBe

21、濃度僅稍高于正常，因此ELISA 易出現(xiàn)假陰性。目前TRF主要用于激素的檢測(cè)。隨著儀器及試劑的國(guó)產(chǎn)化，檢測(cè)費(fèi)用的降低， TRF因其突出的高敏感性、特異性強(qiáng)、無(wú)放射污染等特點(diǎn)，在HBV M勺檢測(cè)中有著廣泛的應(yīng) 用前景。作者單位:410011中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心目前我院已正式開(kāi)展了乙肝二對(duì)半的時(shí)間分辨定量分析，其每一項(xiàng)的正常值圍均是由我 國(guó)衛(wèi)生部根據(jù)美國(guó)雅培的標(biāo)準(zhǔn)而制定，其靈敏度，準(zhǔn)確度，及精確度都有遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于一般的ELISA法，乙肝兩對(duì)半的定量制定將給臨床提供一個(gè)關(guān)于乙肝診斷及療效，預(yù)后判斷的更可 靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。時(shí)間分辨熒光免疫定量測(cè)定乙肝兩對(duì)半的臨床意義極提高了檢測(cè)的靈敏度時(shí)間分辨熒光

22、免疫定量技術(shù)TRFIA檢測(cè)HBsA靈敏度可達(dá)0.2ng/ml,而酶標(biāo)（EIASA 檢測(cè)的靈敏度是2n g/ml,極提高檢測(cè)的靈敏度。因此，在急性乙肝早期能及早檢出HBsAg確 證HBV感染，縮短窗口期；其次，可發(fā)現(xiàn)低濃度HBsA攜帶者；在部分慢性乙肝患者中，由 于機(jī)體缺乏對(duì)HBV包膜蛋白的免疫應(yīng)答,HBsAg表達(dá)較低，酶標(biāo)檢測(cè)可出現(xiàn)HBsAgffi HBsAb 均陰性的情況，TRF技術(shù)則可避免這些情況的發(fā)生為正確判斷病情提供依據(jù)。能動(dòng)態(tài)觀察療效和監(jiān)測(cè)病情1 ）定量分析HBsA丙口 HBsA的濃度變化，可預(yù)見(jiàn)急性乙肝是否處于恢復(fù)期。女HBsAg 濃度降低，HBsA濃度逐漸升高，可說(shuō)明病情正往恢復(fù)

23、期發(fā)展；反之HBsA濃度處于較高水 平或上升趨勢(shì)，而HBsA一直處于較低水平，則易發(fā)展為慢性乙肝或病毒攜帶者。2 ）定量分析HBeA和HBeA的濃度變化，可反映病情變化和治療效果。定量測(cè)定能明確 檢測(cè)HBeA向 HBeA轉(zhuǎn)換的時(shí)期，那表現(xiàn)為HBeA濃度下降和HBeA升高的過(guò)程。高濃度的 HBeA還可以間接提示病毒處于高復(fù)制狀態(tài)具有較高的傳染性高濃度的HBeA一方面提示 病情好轉(zhuǎn)，而在某些時(shí)候（如肝功能指標(biāo)很差）則可能與肝壞死、肝硬化、肝癌有關(guān)。3 ） HBsAI濃度的高低可反映病毒感染的狀態(tài)高濃度的抗-Hbc提示乙肝急性感染，恢復(fù) 期濃度降低。慢性乙肝呈抗Hbc持續(xù)高濃度。而低濃度的抗Hbc般

24、為恢復(fù)期或既往感染。4 ）有利于對(duì)慢性肝炎活動(dòng)性或非活動(dòng)性的判斷。非活動(dòng)性慢性乙肝各項(xiàng)指標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定, 活動(dòng)性往往呈現(xiàn)進(jìn)行性變化。 TRFIA和定量PCR技術(shù)可互相補(bǔ)充血清HBDNA熒光定量PCF測(cè)定可以直接反映血液中病毒復(fù)制狀態(tài)具有很多臨床應(yīng)用 價(jià)值,但不能完全反應(yīng)病毒復(fù)制靜息期細(xì)胞HBV病毒狀態(tài)°HBDNA陰性并不完全代表體HBV 已被清除，結(jié)合“兩對(duì)半”各項(xiàng)指標(biāo)更能客觀反映體HBV病毒狀態(tài)。 HBsA的定量測(cè)定能夠?qū)σ腋蔚念A(yù)防起到監(jiān)督作用嗎？HBsA的定量測(cè)定能夠?qū)贵w是否真正具有“中和HBV勺免疫力作出正確評(píng)價(jià)，對(duì)乙肝 的預(yù)防起到監(jiān)督作用。HBsA的含量在100mlU/ml以上

25、病人ELISA檢測(cè)即可呈陽(yáng)性結(jié)果，但 并不提示機(jī)體都一定具有免疫力，而HBsA的含量在10-100mlU/m之間的樣本，定性雖為 “陽(yáng)性”，但此時(shí)機(jī)體對(duì)HBV勺免疫力較弱，甚至不能預(yù)防HBV感染。只有HBsA的含量達(dá)到 100mlU/ml以上時(shí)才可確定具有抵抗HB入侵的作用。作定量檢測(cè)，可根據(jù)HBsA的含量判 斷機(jī)體對(duì)HBV勺免疫狀態(tài)及乙肝疫苗的免疫效果。因此定量測(cè)定對(duì)乙肝疫苗免疫力的評(píng)價(jià)和 高危人群預(yù)防免疫具有重要意義，特別是在少年兒童預(yù)防乙肝方面。時(shí)間分辨熒光免疫分析在乙肝的應(yīng)用中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院肝病研究中心教授：旭乙肝抗原體測(cè)定是診斷乙肝最常用的方法。酶聯(lián)免疫測(cè)定由于操作簡(jiǎn)便，成本低廉，

26、敏感性和特異性較好，80年代中期以來(lái)就成為乙肝抗原體檢測(cè)最主要的方法。但是本法只能定性， 作為定量測(cè)定的方法，其重復(fù)性很差。據(jù)觀察，不同乙肝感染者表面抗原的濃度相8差0倍,e 抗原的濃度相差100倍，僅用“陽(yáng)性”來(lái)表示，實(shí)在太粗糙，太不科學(xué)，難以滿(mǎn)足臨床的需要。 觀察指標(biāo)的量化是提高診斷水平的基本要求，也是科學(xué)發(fā)展的必然趨勢(shì)，因此，進(jìn)入0年代 以來(lái)，國(guó)外先后推出第四代檢測(cè)方法：化學(xué)發(fā)光法、電化學(xué)發(fā)光法。但是這兩個(gè)方法需要昂貴 的設(shè)備，試劑成本高，難以普遍應(yīng)用。為了滿(mǎn)足臨床的需要，根據(jù)國(guó)情和省情，我科瞄準(zhǔn)抗原抗體檢測(cè)發(fā)展的方向2002年 10月引進(jìn)具有世界先進(jìn)水平的時(shí)間分辨熒光免疫檢測(cè)儀在省率先

27、建交時(shí)間分辨熒光免疫分析（TRFIA檢測(cè)乙肝抗原抗體的新方法，我院也是國(guó)少數(shù)應(yīng)用本法檢測(cè)乙肝的醫(yī)院之一。時(shí)間 分辨熒光免疫分析的原理和通常的免疫測(cè)定方法基本相同，只是標(biāo)記物和測(cè)定方法不同。時(shí)間 分辨熒光免疫分析以三價(jià)稀土離子（常用的是銪）及其螯合劑代替同位素、熒光素或酶，作為 標(biāo)記抗原或抗體的示蹤物，檢測(cè)未知的抗體或抗原，用特制的時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定最后反應(yīng)產(chǎn) 物中熒光的強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度來(lái)判斷待測(cè)物質(zhì)的濃度。在免疫復(fù)合物中的稀土離子自身可產(chǎn) 生微弱的熒光信號(hào)，而當(dāng)加入增強(qiáng)液以后，稀土離子從免疫復(fù)合物中釋放出來(lái)，受到激發(fā)光照 射時(shí)，熒光強(qiáng)度可增強(qiáng)100萬(wàn)倍。稀土離子發(fā)出性熒光不僅光度強(qiáng)，而且壽命

28、長(zhǎng)。反應(yīng)系統(tǒng)中 許多物質(zhì)也可以發(fā)出熒光，但他們的熒光的壽命極短，因此，通過(guò)簡(jiǎn)單的延時(shí)檢測(cè)，就可以將 特異性熒光與非特異性熒光區(qū)別開(kāi)來(lái)，所以這個(gè)方法的名稱(chēng)冠以“時(shí)間分辨”時(shí)間分辨熒光 免疫分析是一種超靈敏的高度特異性的檢測(cè)技術(shù)，是今后抗原抗體檢測(cè)發(fā)展的方向，其靈敏度 比化學(xué)發(fā)光和電化發(fā)光高10倍100倍，比放免法和酶標(biāo)法高1000倍以上。據(jù)我科現(xiàn)場(chǎng)測(cè)評(píng)， 其特異性、敏感性和重復(fù)性均極強(qiáng)，幾乎沒(méi)有假陰性，假陽(yáng)性率低于.1%同一標(biāo)本連續(xù)20 次檢測(cè)C火1%同一批（10個(gè)）連續(xù)3天檢測(cè)CV=0.9%檢測(cè)后反應(yīng)板連續(xù)3天重復(fù)閱讀CV這一方法的建立必將極大的提高我科的乙肝診斷水平，使我們對(duì)乙肝感染者的病情

29、、預(yù) 后、病毒復(fù)制程度、抗病毒藥物的療效等的判斷更變科學(xué)。乙肝時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒 共5項(xiàng)，包括表面抗原、表面抗體、e抗原、e抗體和核心抗體，可任選1項(xiàng)或多項(xiàng)，全套需 備血3ml（不加抗凝劑），記賬后（每項(xiàng)45元）標(biāo)本送傳染科實(shí)驗(yàn)室，當(dāng)天下午出結(jié)果。時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定技術(shù)在HB M定量檢測(cè)及臨床應(yīng)用分析【摘要】目的研究乙肝病毒感染者血清免疫學(xué)標(biāo)志物，利用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)（TRFIA檢測(cè)其含量結(jié)果與ELISA法結(jié)果的任合程度、靈敏度、特異性；了解TRFIA測(cè)定 HBV-啲準(zhǔn)確性、可行性及臨床應(yīng)用價(jià)值。方法分別用TRFIA和ELISA法測(cè)定260例隨機(jī)血 清標(biāo)本HBV-M結(jié)果及含量

30、。結(jié)果HBsAg( ELISA)陽(yáng)性36例,TRFIA陽(yáng)性40例,x2=4,Pv0.05, 兩法符合率98.46%抗rHBs(ELISA陽(yáng)性性130性，TRFIA陽(yáng)性160例，x2=30, PV0.01，兩法 符合率88.5% HBeAg(ELIS陽(yáng)性 17例,TRFIA陽(yáng)性 18例,x2=1, P>0.05,兩法符合率99.6% 抗-HBe(ELISA陽(yáng)性性86例，TRFIA陽(yáng)性73例,x =6.76, PV0.01，兩法符合率90.4% 抗 -HBc(ELISA陽(yáng)日性 54例,TRFIA陽(yáng)性 72例,x2=15.6 , PV0.01,兩法符合率91.5% 結(jié)論TRFIA 法與ELIS

31、A法比較，特異性、敏感性都高,TRFIA乍用于HBV-M含量檢測(cè)可為臨床間接反映 病毒的感染狀況，同時(shí)也為臨床療效提供動(dòng)力學(xué)觀察及接種乙肝疫苗提供依據(jù)。關(guān)鍵詞HBV-時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1606-8106(2004 06-0486-02The time-resolved fluoroi mmuno assay TRFIA used in theHBV-M rati on test and the an alysis on cli nical applicati onCai Y iheDepartme nt of Laboratory,Chaozh

32、ou Cen tral Hospital,Gua ngdon g521021.【Abstract Objective to study the substanee of blood immunity HBV-M,Applyi ng,the tech no logy of TRFI-A to test the result and the n compare itwith the result of the ELISA in fixness,sensivity and specificity and to compre-hcnd the accuracy,feasibility and the

33、value of cli nical applicati onin testi ng HBV-M byTRFIA.Metfodsto deter-minate the result andcontent of260andHBV-My TRFIAandELISA2respectirely.Results HBsApositre is36by ELISA,and40byTRFIA,x=4,Pv0.05,the fix2rate is98.46%;anti-HBs positive is130by ELISA,and160by TRFIA, x =30, Pv0.01 ； the fix rate

34、is88.5%; HBeApositive is17by ELISA,and18byTRFIA,x2=1, P>0.05; the fix rate is99.6% ; Anti-HBe positive is86by ELISA,and73by TRFIA, x2=6.76, PvO.01, the2fix rate is90.4% ; Anti-HBc positive is54by ELISA,and72by TRFIA, x=15.6 , Pv0.01, the fix rate is91.5%.Con-clusion TRFIA has higher specificity a

35、nd sensitivity than ELISA,TRFIA in test ing HBV-M content may in directly n eflect the virus in fecti on in clinicaland offer dynamics observation in the clinical iffects and basis inino culatio n a-ga inst HBV.Key words HBV-M TRFIA ELISA時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定技術(shù)在HBV-M定量檢測(cè)及臨床應(yīng)用分析目前國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的乙型肝炎病毒H BV感染者的血清學(xué)標(biāo)志物檢

36、測(cè)主要靠ELISA法，由于ELISA法簡(jiǎn)單、方便、快速的優(yōu)點(diǎn)在臨床得到廣泛應(yīng)用，但受方法學(xué)本身的限制, 它不能提供HBV-的具體含量，只能作為陰陽(yáng)性判斷,故不可能完成HBV感染的動(dòng)力學(xué)觀察， 而時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)的出現(xiàn)提供了對(duì)HBV-M4行定量檢測(cè)的手段。本文采用TRFIA法對(duì) 260份血清標(biāo)本進(jìn)行HBV-M檢測(cè)，并與ELISA法結(jié)果進(jìn)行比較和分析?，F(xiàn)報(bào)告如下：1對(duì)象與方法1.1對(duì)象血清標(biāo)本均來(lái)自本院門(mén)診及住院病260例，無(wú)年齡性別要求。早晨空腹抽取 靜脈血，分離血清后產(chǎn)即檢測(cè)。1.2 檢測(cè)試劑ELISA試劑盒由榮盛生物技術(shù)提供°TRFIA試劑盒由市豐華生物工程提供。1.3 儀器E

37、L-312e酶標(biāo)儀。泰萊1時(shí)間分辨熒光分析儀°Egate231（全自動(dòng)洗滌。2510 變頻振蕩器。1.4 質(zhì)控物由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。1.5 方法ELISA法和TRFIA法測(cè)定HBV-M嚴(yán)格按照試劑操作規(guī)程操作，同時(shí)加入相應(yīng) 質(zhì)控物監(jiān)測(cè)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用配對(duì)X2檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1HBsAg ELISA法結(jié)果陽(yáng)性36例,陽(yáng)性率13.8%TRFIA法結(jié)果陽(yáng)性40例,陽(yáng)性率15.4% 兩法都陽(yáng)性36例，兩法都陰性220例，TRFIA陽(yáng)性而ELISA陰性4例，TRFIA陰性而ELISA 陽(yáng)性無(wú)，采用配對(duì)X2檢驗(yàn),x2=4,Pv 0.05,差異有顯著性，兩法比較符合率為256/260

38、=98.46% 其中 HBsAg含量 0.55ng/ml 占 4例,6 25ng/ml 占 7 例,2650ng/ml 占 8例,5150ng/ml 占8例，150ng/ml以上占13例。2.2 抗-HBsELISA法結(jié)果陽(yáng)性130例，陽(yáng)性率50%TRFIA法結(jié)果陽(yáng)性160例，陽(yáng)性率61.5% 兩法都陽(yáng)性130例，兩法都陰性100例，TRFIA陽(yáng)性而ELISA陰性30例，TRFIA陰性而ELISA 陽(yáng)性無(wú)，采用配對(duì)X2檢驗(yàn)，x2=30,Pv0.01，差異有非常顯著性，兩法比較符合率為230/260=88.5% 其中-HBs含量 H00mlU/ml占 79 例，10200mlU/ml占 16 例

39、，201 1000mlU/m 占 46 例，1000mIU/m 以上占 19 例。2.3 HBeSg ELISA法結(jié)果陽(yáng)性17例，陽(yáng)性率6.5% TRFIA法結(jié)果陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率6.9%兩法都陽(yáng)性17例，兩法都陰性242例，TRFIA陽(yáng)性而ELISA陰性1例，TRFIA陰性而 ELISA陽(yáng)性無(wú)，采用配對(duì)X2檢驗(yàn)，x2=1,P>0.05，差異無(wú)顯著性，兩法比較符合率為 259/260=99.6%其中 HBeS含量 0.030.1NCU/m占 1 例，0.11 0.5NCU/m占 4 例，0.51 2NCU/ml1 例，2.1 8NCU/ml1例。2.4 抗-HBeELISA法結(jié)果陽(yáng)性86

40、例，陽(yáng)性率33%TRFIA法結(jié)果陽(yáng)性73例，陽(yáng)性率28% 兩法都陽(yáng)性67例，兩法都陰性168例，TRFIA陽(yáng)性而ELISA陰性6例，TRFIA陰性而ELISA 陽(yáng)性19例，采用配對(duì)x2檢驗(yàn)，x2=6.76,Pv 0.01，差異有非常顯著性，兩法比較符合率為 235/260=90.4%其中抗-HBe含量 1.52NCU/ml1 例,2.1 5NCU/ml1例, 5.1 10NCU/ml23 例，20NCU/m以上24例。2.5抗-HBc ELISA法結(jié)果陽(yáng)性54例，陽(yáng)性率20.8% TRFIA法結(jié)果陽(yáng)性72例，陽(yáng)性率 27.7%兩法都陽(yáng)性52例，兩法都陰性186例，TRFIA陽(yáng)性而ELISA陰性

41、20例，TRFIA陰性 而ELISATO性2例，采用配對(duì)x2檢驗(yàn)，x2=15.6,Pv 0.01，差異有非常顯著性，兩法比較符合 率為 238/260=91.5%其中抗-HBc含量 0.1 0.5NCU/ml11例, 0.51 1NCU/ml1例, 1 5NCU/ml1 例，5.1 10NCU/ml3例, 10NCU/m以上 14例。3討論TRFIA法檢測(cè)HBV-M與 ELISA法相比，其特異性和敏感性都高，特別是能夠檢測(cè)低濃度 HBsA和 HBeAg對(duì)減少HBV感染漏診和誤診具有較高價(jià)值。因HBsA©日性是HBV感染的金標(biāo) 準(zhǔn)。有學(xué)者對(duì)血清呈低水平存在、血清HBsA約在5ng/ml

42、以下者做過(guò)研究，對(duì)象是非肝 炎患者住院人群，結(jié)果是占總?cè)巳旱?.34%占HBsA©日性人群的23.16%而本文只檢測(cè)出 1.5席口 10%此結(jié)果存在一定差異，有待進(jìn)一步探討。抗HBs是對(duì)HBV勺保護(hù)性免疫指標(biāo)， 有學(xué)者認(rèn)為仍有保護(hù)作用的最低抗HBs的濃度為10mlU/mJ提出基礎(chǔ)免疫后高度抗體滴度的 再接種方案，最后一次接種后4周，如抗-HBs<10mIU/m立即再接種；10100mlU/ml 3 6個(gè)月后必須再接種口。實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)抗HBs定量檢測(cè)對(duì)于監(jiān)測(cè)、指導(dǎo)肝移值中乙型肝炎 免疫球蛋白的應(yīng)用具有肯定作用。說(shuō)明了對(duì)抗HBs定量的檢測(cè)是很有必要的，同時(shí)也可了解 人體是否有抗-

43、HBs是否有足夠的量可抵御HBV勺侵襲。本文抗-HBs結(jié)果顯示，160例TRFIA 法陽(yáng)性79例，抗-HBs濃度值在10100mlU/m以，此量因無(wú)確切的抵御能力，建議加強(qiáng)預(yù) 防措施。對(duì)于抗HBs陰性的人群更應(yīng)做好預(yù)防，至于00mlU/m以上含量的人群，說(shuō)明他們 已有好的抵御能力。另外結(jié)果提示,ELISA法的抗-HBe陽(yáng)性率明顯高于TRFIA法，由于本身 方法學(xué)的限制，最好在發(fā)出報(bào)告時(shí)加以綜合分析或提高Cutoff值。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明HBV-M各項(xiàng)陽(yáng)性結(jié)果都顯示了不同的含量，說(shuō)明了人體感染HBV后, 病毒的復(fù)制程度或經(jīng)抗病毒藥物治療后,HBV-M含量也隨之變化，提示了動(dòng)力學(xué)關(guān)系。據(jù)所 掌握的資料

44、觀察，患都治療前及治療后HBV-M含量變化結(jié)果比較。見(jiàn)表 1。表1 2例病人HBV-I治療前后結(jié)果比較 略可以看出，HBsA和HBeA逐漸下降，而所有抗體逐步增高，這說(shuō)明抗病毒治療是有效 的，同時(shí)也給臨床預(yù)后判斷提供了依據(jù)。目前臨床上對(duì)檢測(cè)HBV-M勺血清常用方法是血清免疫學(xué)檢測(cè)，也就是檢測(cè)患者對(duì)病毒 侵染機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，因此免疫血清學(xué)指標(biāo)可間接反映病毒的感染狀況。隨著檢測(cè)水平 的不斷提高，TRFIA技術(shù)的問(wèn)世給免疫自身的研究和發(fā)展提供了新的手段。雖網(wǎng)NA是直接 反映病毒本身在機(jī)體的存在情況，而人們?cè)絹?lái)越意識(shí)到兩者既相關(guān)，又不盡一致，高靈敏準(zhǔn) 確的HBV-定量結(jié)果可與HBV-DN的檢測(cè)相互

45、印證，給臨床提供更客觀有效的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，臨 床上需要將兩者結(jié)合起來(lái)對(duì)患者進(jìn)行綜合診斷治療和預(yù)后等判斷。如果在沒(méi)有開(kāi)展HBV-DNA項(xiàng)目檢測(cè)的單位，HBV-M量檢測(cè)其本身也就是一個(gè)很好監(jiān)測(cè)病毒動(dòng)力學(xué)變化的輔助指標(biāo)。參考文獻(xiàn)1、紫榕，病毒性肝炎，：人民衛(wèi)生，2002 6, 191.2、瑜，鐘步云，徐根云，等低水平血清乙肝病毒表面抗原測(cè)定及臨床意義。中華檢測(cè)醫(yī)學(xué)雜志，2001, 24: 1.3、Klaus-peter Maier著，郝連杰等譯第四版；人民衛(wèi)生，1997, 8, 35。作者單位：521021省市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科關(guān)于乙肝病毒標(biāo)記物“兩對(duì)半”定量測(cè)定和肝功能（肝纖維化）檢測(cè)的通知各臨床科室：為

46、增加我院臨床診斷、治療和觀察病情的參考依據(jù),進(jìn)一步提高我院的醫(yī)療水平和我院 的綜合競(jìng)爭(zhēng)能力。我們要積極開(kāi)展應(yīng)用技術(shù)、新項(xiàng)目。最近檢驗(yàn)科在院領(lǐng)導(dǎo)的大力支持下引 進(jìn)了 WALLA公司生產(chǎn)的時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)該時(shí)間分辨熒光免疫分析系統(tǒng)可進(jìn)行多 種檢測(cè)（見(jiàn)附錄）其中對(duì)“乙肝兩對(duì)半”可進(jìn)行準(zhǔn)確的定量測(cè)定。歡迎各臨床科選用醫(yī)務(wù)科2002年 12月 25日一、兩對(duì)半定量測(cè)定乙肝病毒（HBV標(biāo)記物的檢測(cè)方法常用測(cè)定乙肝病毒的抗原、抗體標(biāo)記物，60年代末70 年代初的瓊脂擴(kuò)撒法，依次發(fā)展為血凝法T酶聯(lián)免疫吸附ELISA、同位素免疫標(biāo)記RIA T化學(xué)發(fā)光免疫分析、生物發(fā)光、電化學(xué)發(fā)光免疫標(biāo)記和80年代中建立

47、的稀土離子熒光標(biāo)記（時(shí)間分辨熒光免疫分析）等不同的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)的發(fā)展和檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，其方法 每發(fā)展一步，乙肝標(biāo)記物檢出的靈敏度和準(zhǔn)確性都得到不同的提高（其中IA為I012mol/L、 ECL 10為 10'19 mol/L、CLIA為 10'15m ol/L、ECL1為-17/L、TRF為 1019 mol/L ）。其中時(shí)間分 辨熒光免疫分析（TRF為近年新研制成功的用三價(jià)稀土離子作為示蹤物以單克降抗體包被 支持物與樣品中抗原反應(yīng)，再加入有銪EU標(biāo)記的抗體，進(jìn)行反應(yīng)檢測(cè)，可大大降低一般 同位素和熒光標(biāo)記受環(huán)境干擾缺點(diǎn)，提高了檢測(cè)的靈敏和準(zhǔn)性，該RF法檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記 物

48、較其他方法靈敏度高、特異性好，因干擾因素少可優(yōu)于以上各種方法，可與BV-DN的檢 測(cè)相比（未經(jīng)規(guī)化要求開(kāi)展的HBV-DN檢測(cè)，多年的臨床實(shí)驗(yàn)證明，假陽(yáng)性、假陰性率較高， 重復(fù)性差，且不能定量。TRF為目前檢測(cè)乙肝病毒標(biāo)記物最理想怕方法°TRF定量檢測(cè)乙肝 病毒“兩對(duì)半”為臨床診斷乙肝提供了新手段，有助于臨床客觀的分析BV感染情況、療效 的觀察和轉(zhuǎn)歸等情況的分析，至少可對(duì)一列情況更具有獨(dú)特的診斷價(jià)值：1、治療前進(jìn)行病毒定量檢測(cè)，可以指導(dǎo)選擇抗病毒藥物，避免盲目用藥。2、治療后定量間接判斷體病毒數(shù)量，有助于療效的觀察。3、懷孕前進(jìn)行定量測(cè)定，有助于選擇有利的懷孕時(shí)機(jī)。乙肝孕婦進(jìn)行定量檢查

49、，有助于使部分病人得到及進(jìn)的正確的診斷二、兩對(duì)半定量與定性組合測(cè)定今后檢驗(yàn)科對(duì)乙肝“兩對(duì)半”檢查，可給臨床提供兩種選擇，一種是乙肝病項(xiàng)定量 測(cè)定；另一種是定量與定性組合檢查,即在乙肝“兩對(duì)半”的五項(xiàng)檢查中,HbsA（表面抗原）、 抗-HBs（表面抗體、HbeAg（E-R抗原）此3項(xiàng)重要的指標(biāo)中必須有一項(xiàng)是定量的（其余4 項(xiàng)定性；也可選擇其中2項(xiàng)做定量，其余3項(xiàng)做定性）。任上臨床根據(jù)病人的經(jīng)濟(jì)情況選擇， 但如果臨床不注明，檢驗(yàn)科一律做HbsAgt量與其余4定性檢查。5項(xiàng)定量測(cè)定收費(fèi)105元， 1項(xiàng)定量與其余4項(xiàng)定性檢查收費(fèi)45元。此舉意義使“兩對(duì)半”檢查得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果與及更好解釋和發(fā)揮“兩對(duì)

50、半”檢查 的臨床意義；使臨床檢查“兩對(duì)半”有更多、更切合患者利益選擇，如病人經(jīng)濟(jì)許可，可 選擇5項(xiàng)定量測(cè)定，如果經(jīng)濟(jì)困難即可注明選擇其中項(xiàng)與其它4定性檢查。此種組合合 理，檢查意義大，符合國(guó)家循征醫(yī)學(xué)的要求。（“兩對(duì)半”定量檢查，收費(fèi)105元，如同時(shí)做生化全套，開(kāi)檢驗(yàn)單時(shí)請(qǐng)分開(kāi)單，如“兩 對(duì)半”為1項(xiàng)定量其余4項(xiàng)為定性檢查在一檢驗(yàn)單同時(shí)申請(qǐng)即可）醫(yī)學(xué)院論著甲胎蛋白、癌胚抗原時(shí)間分辨熒光法與化學(xué)發(fā)光法比較王桂蓮朱利國(guó)黃飚蔡剛明譚成金堅(jiān)單位：省江原醫(yī)院，241063關(guān)鍵詞：時(shí)間分辨熒光免疫分析；化學(xué)發(fā)光免疫分析；甲胎蛋白；癌胚抗原3+摘要DTPA法制備了 Eu標(biāo)單抗，采用夾心法建交了AFF和CEA

51、FMA它們的靈敏度分別為43ng/L和90ng/L；批CV為1.599吩口 1.36% 批間CV為7.1393和2.89%平均回收率為103.983和92.78%與CLIA進(jìn)行臨床應(yīng)用比較顯示結(jié)果高度相關(guān)(AFPr=0.9040,CEA r=0.9705)。中圖分類(lèi)號(hào)0657.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)1000-2057(2000)02-0159-01甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA是迄今較為肯定的腫瘤標(biāo)志物，憶廣泛用于臨床 腫瘤診斷，兩者的檢測(cè)已有RIA、EIA和IRMA等方法。近來(lái)發(fā)展的時(shí)間分辨熒光和化學(xué) 發(fā)光測(cè)量技術(shù)，信噪比較高，分析靈敏度超過(guò)了上述方法。我們?cè)谕瓿闪薃FP CEA 和I

52、RMA工作的基礎(chǔ)上，采用時(shí)間分辨熒光測(cè)量技術(shù)，建交了時(shí)間分辨免疫熒光分析(Time-resolved Immunofluormetric assay,IFMA),并與化學(xué)發(fā)光免疫分析 (Chemiluminescence Immunoassay,CL)A進(jìn)行比較。1材料與方法# #1.1試劑與設(shè)備抗CEA單抗G7和抗AFP單抗137和47由市第二制藥廠(chǎng)提3+3+供。Eu標(biāo)記盒(1244-302, Eu發(fā)光增強(qiáng)液(B118-110、AFF和CEA參考標(biāo)準(zhǔn)，EG &G-Wellac產(chǎn)品。二乙烯三胺五乙酸酐(DTP) Sigma產(chǎn)品。PD-10和Sepharose CL-6B,Pharmec

53、ia產(chǎn)品。CA-19-9 CA-12-5和 CA-15-3參考標(biāo)準(zhǔn)，AFP和 CEA CLIA 藥盒，CIBA-CORNING品。牛IgG自制。去離子超純水由本室采用Barnsteed公司超純水器(D7033制備。96孔微扎板，Nunc產(chǎn)品。BSA生物制品的產(chǎn)品。其他試 劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。全自動(dòng)IFMA檢測(cè)儀(Auto DELFIA1235為EGkG-Wellac產(chǎn)品。 全自動(dòng)CLIA檢測(cè)儀(ACS180、為CIBACORNING產(chǎn)品。1.2方法3+1.2.1 CEA IFMA ( 1)固相 C7 和 Eu -C50制備：將 C7 單抗用50nm ol/L,3+NaCQNaHC33Ph9.6

54、釋至10 mg/L。每孔加 200ul,4 C放置過(guò)夜。Eu -C50 制備參3+3+照Eu標(biāo)記盒進(jìn)行。每個(gè)C5olgG上連接了 13個(gè)Eu，產(chǎn)率達(dá)52.6% (2)測(cè)定方法：用含8mmol/LNaCI,0.1%BSA,0.2%牛 IgG, 50umol/LDTPA,0.1ml/LTween-80和 0.1%NaN 的 50mmol/L Tris-HCI ph7.8 為反應(yīng)沖液，以含 14.5 水 mmol/L NaCI,0.2ml/L Twee n-8和0.2%Na3的上述緩沖液為洗滌液采用固相二步順序夾心 法建立CEA-IFMA即在包被有G7的96孔微孔板上,每孔依次加入25ul CEA參

55、考標(biāo)準(zhǔn)或待測(cè)血清及200ul反應(yīng)緩沖液,37 C振蕩孵育2h后，用洗滌液洗4次。再加3200ul1:1000稀釋的Eu+-C5o, 37C孵育1h,洗滌6次，加入增強(qiáng)液200ul,370170 反應(yīng)5min,熒光檢測(cè)。全部過(guò)程在Auto DELFIA123上自動(dòng)完成。3+1.2.2 AFP IFMA (1)固相Ci7和Eu C137制備：方法同上，每個(gè)Ci3?IgG上連接3+一_了 7.52個(gè)Eu，產(chǎn)率達(dá)53.07% (2)測(cè)定方法：反應(yīng)緩沖液和洗滌液同上。采用 固相二步順序夾心法建交AFP-IFM, C47包被板每孔依次加入25ul AFP參考標(biāo)準(zhǔn)3+ 或待測(cè)血清及200ul反應(yīng)緩沖液，37

56、C孵育1h后，加200ul: 1000稀釋的Eu C50,孵育1h。后續(xù)方法同上。1.2.3 CEA和AFP CLIA參照藥盒說(shuō)明書(shū)，全部過(guò)程均在ACS18上自勸完成。2結(jié)果2.1CEAFMA以零劑量測(cè)量結(jié)果均值加上0.2S代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析,CEAIFMA的靈 敏度為90ng/L; AFP對(duì)本法無(wú)交叉反應(yīng)，CA-19-9的交叉反應(yīng)可達(dá)2.81%方法的批和批間CV分別為1.36%和 2.89%平均回收率為92.78%可測(cè)圍為1.45 508.9ug/L。2.2 AFP IFMA以零劑量測(cè)量結(jié)果均值加上0.2S代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析,AFP IFMA勺靈 敏度為43ng/L; CEA CA-12-5 C

57、A-15-3和CA-19-9對(duì)方法無(wú)交叉反應(yīng)；方法的 批和批間CV分別為1.599唏口 7.139%平均回收率為103.98%可測(cè)圍為4.221210ul/L2.3 IFMA與CLIA同步比較137例正常人經(jīng)CEAM和CLIA測(cè)量,結(jié)果高度相關(guān) (r=0.9705)。148例正常人經(jīng)AFP IFMA和 CLIA測(cè)量，結(jié)果相符(r=0.9040)。3討論以往超微量免疫分析技術(shù)應(yīng)用的普遍問(wèn)題是穩(wěn)定性難以滿(mǎn)足于臨床工作的需 要。鑒于放射性同位素示蹤劑自身衰變或保存條件苛刻及自分解變性失活等原因 ，對(duì)于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使單樣品檢測(cè)也必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相對(duì) 測(cè)量的依據(jù)oEIA本身方法學(xué)的

58、原因，不能完全定量。我們建立的AFF和CEAFMA 同批試劑連續(xù)5個(gè)月臨床應(yīng)用分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)基本重合，無(wú)明顯漂移?？梢杂猛?批試劑單次標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)作為今后分析的固定參考曲線(xiàn)。CIBA-CORNlNGCLIA試劑盒 也同樣可重復(fù)且穩(wěn)定。就IFMA和CLIA經(jīng)臨床同步比較，結(jié)果相關(guān)性好。同時(shí)我 們也與我們自己的IRMA比較，結(jié)果也高度相關(guān)，說(shuō)明上述兩種方法可取代以往的 AFF和CEA分析方法。從方法學(xué)的考核情況看，多數(shù)指標(biāo)與IRMA類(lèi)同，但方法學(xué) 穩(wěn)定性顯著優(yōu)于IRMA就IFMA與 CLIA臨床比較方面，后者檢測(cè)速度明顯優(yōu)于前 者，可作臨床急診診斷。而前者適合大批量的樣品檢測(cè)，穩(wěn)定性更高，可測(cè)圍更 寬，理論分