實驗室分子生物學實驗基本操作要求規(guī)范及注意事項

1、實驗室分子生物學實驗根本操作標準及考前須知一、酶與載體的分裝酶類與載體：T載體(50ng/叱1)用滅菌水稀釋4倍(12.5ng/仙l)后分裝成10(11或20n1;連接酶(solutionI)按5111分裝；dNTP(10mM分裝成50履；無菌水分裝成1ml；注意：(1)所有分裝都必須用已滅菌的管.(2)所有工具酶和載體的使用過程均在冰浴中進行.(3)工具酶、載體以及試劑盒等實驗室共用物品,用完后必須及時放回原處,以免耽誤他人使用.(4)當你發(fā)現你使用的是最后一管(盒)公用物品時,請馬上告知負責人購置,以免耽誤使用.(5)感受態(tài),氨葦青霉素和IPTG由研究生輪流負責制備.每人負責六個月.其他試

2、劑那么由第一位使用新包裝的同學分裝.由于分子實驗工具酶比擬容易失活,必須在冰上進行分裝.二、常見抗生素及IPTG的配置以氨葦青霉素為例：1 .準備足夠量的1.5ml的EP管、兩個100ml的離心管、0.22仙m水系濾器、注射器、蒸儲水,以上用品均要進行高壓滅菌.2 .潔凈工作臺紫外滅菌,然后進行以下操作.3 .稱取2g的氨葦青霉素粉末于離心管中,參加滅菌水至總體積為20ml,輕搖離心管,至氨葦青霉素粉末完全溶解,以免過濾時堵塞濾膜.4 .用注射器吸取配制好的溶液,然后把濾器安在注射器上,緩緩推動注射器活塞,把溶液經濾膜推至100ml的離心管中.注意：動作要緩和,使濾出液出口正對著離心管,還要預

3、防染菌.5 .把100ml離心管中已除菌的氨葦青霉素溶液分裝到1.5ml的EP管中,每管0.5ml0在EP管上做好標記,包括名稱、濃度、日期等.6 .把做好標記的盛有氨葦青霉素的EP管于-20C保存.注意：當你發(fā)現你使用的是最后一管抗生素時,請馬上告知有關人員及時配制,以免耽誤使用.表1.常見抗生素的儲存濃度及工作濃度名稱儲存濃度工作濃度氨卜青霉素(ampicillin)100mg/ml50心g/ml100心g/ml卡那霉素(kanamycin)10mg/ml10心g/ml50心g/ml氯霉素(chloramphenicol)25mg/ml12.5心g/ml25心g/ml鏈霉素(strepto

4、mycin)50mg/ml10心g/ml50心g/ml四環(huán)素(tetracyyline)10mg/ml10心g/ml50心g/mlIPTG1M0.05-0.6mM三、分子生物學實驗中各種試劑與溶液的配制分子生物學實驗中各種試劑與溶液的配制參見?分子克隆?四、總DNA勺提取具體步驟參測試劑盒說明書.注意：革蘭氏陽性菌DNAI取時需要加溶菌酶五、基因擴增1 .引物與合成：設計引物序列,發(fā)至生工公司進行合成jinansangon.2 .引物配制：合成后的引物先離心至管底,然后按說明書用無菌水稀釋至10-50pM,分裝至無菌EP管中,做好標記一定要標記濃度！后,于-20度保存?zhèn)溆?3 .PCR反響體系

5、配制：將所需各組分在冰浴中化開后,進行PC網應體系配制.反響體系及反響參數按不同聚合酶的說明書進行,以transgen的easyTaq酶擴增1kb基因序列為例,100口反響體系為：10xbuffer10口,dNTP10mM2,引物各2口10-50仙M,模板1口根據濃度加減體積,Taq酶1小,ddHO82口注意：參加順序為：水,buffer,dNTP引物,模板,酶.渦旋混勻,分裝至四-五管,瞬時離心.注意：假設反響時間較長在反響混合液的上層加10-20履的礦物油防止樣品在PCR勺過程中蒸發(fā).4 .將管放入PCRZ中,在PCRCZ上設置好PC阪應參數,例如：94C5min,94C40sec,Tm5

6、5c1min,72C2min,72C10min,16C1h,一般設30個循環(huán).待溫度降至16C后停止PCRZ,盡快取出樣品,不允許過夜.六、瓊脂糖核酸電泳1 .電泳緩沖液的配制：電泳緩沖液一般為TAE或TBE,其配制方法參見表2,先配制50X母液放于4度冰箱中,電泳時稀釋100倍使用.2 .將制膠模具和梳子沖洗干凈,架好梳子；3 .根據欲別離DNAt段大小用凝膠緩沖液配制適宜濃度的瓊脂糖凝膠表3:準確稱量瓊脂糖干粉,參加到配膠用的三角燒瓶內,定量參加電泳緩沖液；4 .放入到微波爐內加熱至膠粒全部熔化一般沸三次即好,冷卻片刻,倒入制膠模具中,待其凝固；a室溫下30-45分鐘后凝膠完全凝結,小心拔

7、出梳子,將凝膠安放在電泳槽內；b向電泳槽中倒入電泳緩沖液,其量以沒過膠面1mW宜,如樣品孔內有氣泡,應設法除去；c在DNA羊品中參加1/5-1/10體積的上樣緩沖液1%SDS,50附油,0.05%溟酚藍,混勻后,用槍將樣品混合液緩慢參加被浸沒的凝膠加樣孔內；5 .接通電源,紅色為正極,黑色為負極,切記DNA羊品由負極往正極泳動靠近加樣孔的一端為負.根據膠的長度設定電壓,一般5-8V/cm,電泳20-40min,澳酚藍跑完膠板的3/4左右即可；6 .電泳完畢,關上電源,戴上手套,將膠放入0.5ig/ml的澳化乙錠EB溶液中,室溫下染色5-10min.7 .蒸儲水中漂洗一下,置于紫外燈下或凝膠成像

8、儀上觀察電泳帶及其位置,并與核酸分子量標準Marker比擬被擴增產物的大小.如果要切膠回收,最好在觀察臺上鋪上塑料片觀察,預防污染以及紫外燈引起DNAASE.注意：澳化乙錠EB有劇毒,操作時應注意平安,戴手套操作.但是要預防污染染色池和切膠板以外的區(qū)域.操作完后手套和膠分別放入垃圾桶和回收桶.表2.電泳緩沖液TAE配方電泳緩沖液配方緩沖液使用液濃貯存液每升Tris-乙酸(TAE)0.5x:0.02mol/LTris-乙酸50X：242gTris堿0.0005mol/LEDTA57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)表3.瓊脂糖凝膠濃度與線形DNA的最正確分辨范圍瓊脂糖

9、凝膠濃度與線形DNA瓊脂糖凝膠濃度DNA的最正確分到W也圍bp0.5%1,00030,0000.7%80012,0001.0%50010,0001.2%4007,0001.5%2003,0002.0%502,000七、回收與連接1 .將切下的目的條帶根據回收試劑盒說明書進行產物回收；2 .連接前先電泳確定待連接載體與片段的濃度.稀釋好的T載體濃度為12.5ng/仙l,不用再確定濃度,每次用量為1回.3 .連接反響體系的配制1用SolutionI連接時,取一只分裝的SolutionI離心管含5仙lSolutionI,參加待連接的兩個DNA樣品：載體與片段載體與片段的mol比為1:3-5,加水補足

10、102用T4連接酶5回連接時,取一只滅菌PCRt,參加10X連接buffer1回,待連接的兩個DNA羊品：載體與片段載體與片段的mol比為1:3-5,T4連接酶1,加水補足10回.3連接至T載體時反響體系一般為：回收的PCRT物4l,solutionI5膜,4倍稀釋的pMD-18Ts隆載體12.5ng/小1回.注意：參加順序為：水,buffer,DNA羊品,酶4 .混勻樣品并短暫離心使樣品全部沉于管底.5 .將離心管置于16C孵育4h以上或過夜.八、E.coliDH5a和B121感受態(tài)細胞的制備采用CaC12制備法制備E.coliDH5a感受態(tài)細胞,步驟如下：1 .準備實驗：1準備LB固體培養(yǎng)

11、基和分裝于試管2-5ml和三角瓶100ml的液體培養(yǎng)基.2分別配制含15%T油的和不含甘油的0.1MCaC12.3準備干凈培養(yǎng)皿、非常干凈的100ml離心管2只,1.5mlEP管50只,1ml和200壯槍尖各一盒.4將以上培養(yǎng)基和物品高壓滅菌.2 .在LB平板上活化E.coliDH5a.將活化的E.coliDH5a單菌落接種于成含LB培養(yǎng)基的試管中,37c搖床過夜培養(yǎng).3 .第二天按1%8種量接種到含100mlLB培養(yǎng)基的三角瓶中,37c搖床培養(yǎng)至.展0=0.4-0.6約2h04 .冰浴10min,倒入滅過菌的100ml離心管中離心,4000rpm,10min,4C.5 .去掉上清,加20ml

12、配制好的已滅菌的0.1MCaCl2,將菌體打散后靜置20min,4000rpm離心10min,去掉上清.6,加1-2ml滅菌的0.1MCaCl2含15%T油制成感受態(tài)細胞.將制好的感受態(tài)細胞分裝成50履小份保存于-80C冰箱.7.E.coliBl21和BL21DE3的制備方法同上.注意：1所有操作均在冰上進行；2整個制備過程必須保證無菌操作；3E.coliBl21,BL21DE3,DH5a菌種每學期更換一次.九、轉化1,取50/感受態(tài)細胞于冰浴上融化.2.參加10/連接產物或3-5/純質粒,輕輕吹打混勻,冰浴20min.3,放入42C水浴中熱激90秒,立即放入冰浴中2-10min.4,參加0.

13、5ml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基,于37C培養(yǎng)1h.5,將培養(yǎng)物4000rpm離心3min,保存約200/上清于1沖,將菌體用無菌槍尖輕輕打散,均勻涂布于含100pg/mlAmp+的平板外表,平板于37c先正置1-2h,后倒置培養(yǎng)12-16h至菌落出現.十、重組子的篩選和鑒定從轉化平板上挑取白色菌落,轉接至含抗生素Amp100pg/ml的LB液體培養(yǎng)基,37c振蕩培養(yǎng)過夜.菌液可以用以下三種方法驗證是否是陽性轉化子.注意：同時培養(yǎng)陰性菌落作為對照！一酚抽驗證取1ml菌液12,000rpm離心1min收集菌體,盡量倒干凈上清后參加50/Tris飽和酚和50口水,漩渦震蕩5min充分混勻.12,0

14、00rpm離心10min后迅速取上清進行瓊脂糖凝膠電泳.二質粒酶切驗證1,根據質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取,用未插入片段的質粒作為陰性對照,進行瓊脂糖凝膠電泳.電泳后可根據質粒的大小初步判斷質粒中是否有插入片段,并推測質粒的濃度.2 .利用引物中設計的酶切位點或質粒上的酶切位點,對質粒進行酶切.根據待切質粒的濃度確定要加的體積,選擇適宜的限制性內切酶和配套Buffer.3 .在離心管中參加如下成分：10XBuffer2/待切樣品x/一M為5川左右酶1/10UU加滅菌水補足20/酶的多少并不是一成不變的,關鍵要看待切DNA的濃度,如果濃度較低,可以適當少加酶.不要在20M體系中參加超過2的酶,那樣容易產生星號活性.4、混勻樣品并短暫離心使樣品沉于管底.5、將離心管置于37c中溫育2h,假設待切樣品為PCFT物,那么可將反響時間適當延長.最長酶切時間要取決于是否會產生星號活性.如果50M體系參加1回酶,那么可過夜酶切一般不會出現星號活性.6、用未酶切的質粒作為對照,瓊脂糖電泳鑒定酶切結果.注意：當酶切樣品用于回收而不是鑒定時,可按