地高辛I中文翻譯

1、只用于生命科學研究，不能用于診斷程序僅用于體外實驗DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitI堿性磷酸酶底物顯色標記（NBT/BCIP顯色試劑盒），采用地高辛-dUTP進行隨機引物DN雨記，利用堿性不穩(wěn)定和酶聯免疫雜交檢測貨號：11745832910此試劑盒儲存條件：-15C到-25C。此試劑盒可對10ng-3ggDNAffi彳112次標記反應，可檢測10x10cm面積的雜交膜24張。指導手冊2009.11版1前言1.1 內容表1前言1.2 內容表1.3 試劑盒成分.介紹產品簡介.操作步驟和所需材料在你開始前地高辛標記DNA標記效率的確定DNA的

2、轉移和固定雜交免疫檢測DNA印記的洗脫和再雜交.結果典型結果.附錄故障排除參考文獻訂購信息1.2試劑盒的成分瓶號標記內容包括功能1DIG-舒效引物50dL地圖辛標記的圖效引物5X濃度的標記混合物：優(yōu)化的濃度的隨機引物，核甘酸，地高豐標記的dUTP（堿標記的），Klenow酶和緩沖液成分隨時可用澄清的粘液用于DNA的高效隨機引物標記2DIG標記的對照DNA20dL5科g/mL質粒pBR328DNA（用BamHI線性化）澄清溶液用于確定標記效率3DN廝釋緩沖液3管1mL50科g/mL魚精DNA,10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0在25c澄清溶液4抗地高*的堿性磷酸酶結合物50dL

3、750U/mL從羊中獲取的，Fab段，結合堿性磷酸酶澄清溶液5氮藍四口坐/5澳4氯3口引嚏基磷酸鹽6管1ml;50X濃度的存儲液（18.75mg/mlNBT和9.4mg/mlBCIP溶于67%（W/V）白勺DMSOK可顯現淡黃色與棕色；與堿性磷酸鹽反應澄清溶液6封閉液4X100mL10X濃度黃色，粘液7地圖辛雜交顆粒100mL地高辛雜交液共4瓶，用于DNA交P17（3.5配制）附加儀器與所需試劑除了上表中列出的試劑外，你必須準備一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要準備的設備概要。在每個操作程序的前面提供了詳細的信息。操作程序儀器設備試齊3.2DIG-DNA標記水浴火菌的雙蒸水0.2M

4、pH8.0火菌的EDTA3.3標記效率的半定量帶止電荷的尼龍膜*地高辛洗滌和封阻緩沖組合*或者TE緩沖液洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液，TE緩沖液3.4DNA轉移和固定紫外光盒或者商業(yè)化可用于紫外交聯的其他設備2XSSC或者10XSSC3.5雜交尼龍膜，帶止電荷*雜交袋*,或者耐熱的塑料袋或者滾筒瓶注意：當用地高辛雜交緩沖液工作時，/、要用開口的托盤。3.6免疫檢測耐熱的塑料袋或者滾筒瓶雜交袋*合適體積的容器用于雜交地高辛洗滌和封阻緩沖液組合*,或者TE緩沖液洗滌緩沖液馬來酸緩沖液檢測緩沖液，TE緩沖液3.7DNA斑點的脫色和重新標記探針大的托盤水浴10XSSC10%SDS0.2MNaOH標

5、記的產品可以從RocheAppliedScience獲得。.介紹產品概況實驗原則此試劑盒采用DIG（地高辛），一種管類半抗原，steroidhapten去標記DNA探針用于雜交和后續(xù)的免疫檢測1,2,3。步驟描述DNA標記根據隨機引物標記技術采用地高辛標記引物獲得了地高辛標記的DN琳針。地高辛標記的高效引物是一種專門生產的反應混合物，其中含有地高*dUTP,堿性標記（圖1）和所有的試劑，包括隨機引物標記所必須的酶，已預先混合優(yōu)化的5X濃度反應緩沖液。雜交根據標準方法，地高豐標記的探針可以與固定在膜上的核酸雜交。米用堿標記形式的地高辛-11-dUIP能夠更加容易和功效的被洗脫下來，使固定在膜上的

6、核酸可以與其他的地高辛標記探針再次雜交。免疫檢測雜交探針可以用抗地高辛的堿性磷酸酶進行免疫檢測，Fab段，然后與顯色底物NBT/BCIP發(fā)生顯色反應應用地高辛標記DNA探針可以用于:所有類型的濾膜雜交總基因組DNA中單拷貝基因的檢測，甚至對于高度復雜的生物體也可以進行檢測，如人，大麥和小麥。樣品材料至少100bp的DNA片段線性的質粒，cos質粒或者DNA超螺旋的DNA實驗時間此表格列出了每一步實驗所需的反應時間。步驟反應時間DNA記1小時-過夜雜交6小時或者過夜免疫檢測1.5小時底物顯色檢測0.516小時檢測數量一個試劑盒足夠用于：12個標準的標記反應，每個反應的膜板DNA超過3科g;并可以

7、檢測24張10X10cnf的雜交膜。質量控制根據操作步驟中的說明對未標記的對照DNApBR328進行標記，并按照下面的標準檢測操作方法在點雜交中用0.1pg同源DNAS過16小時顯色即可檢測到（或1pg的同源DNA經過1小時的顯色即可看到顏色）。試劑盒的儲存和穩(wěn)定性未開封的試劑盒在保質期內可以穩(wěn)定的存放在-15C到-25C（保質期印在標簽上）。在干冰中運輸。一旦開封，請根據下表選擇適宜的儲存條件。試劑盒成分儲存條件抗地高辛堿性磷酸酶結合物（4號管）2-8C穩(wěn)定。注意：不要凍存封阻液（6號管）未開封時15C-25c穩(wěn)定。一旦開封，應分裝并儲存在-15C到-25C或者無菌條件下2-8C間可以穩(wěn)定保

8、存1個月。工作溶液都應是新鮮配制的。NBT/BCIP(5儲存在28C在運輸過程中用干冰保存，易生成沉淀，經37c溶解即可。靈敏度和特異性采用southern雜交從0.3科g人胎盤DNA（經Bgln或EcoRi酶切）中檢測到單拷貝基因（組織纖溶酶原激活因子tPA）。注意：靈敏度取決于標記DNA勺濃度與顯色時間。優(yōu)點此表描述了這個試劑盒的優(yōu)點和特征優(yōu)點特征精確、快速預先已混好的地圖辛局效引物混合物減少了標記DNA時手動操作的時間，同時提高了產量，重復性好靈敏在復雜白總人DNA及植物基因組中能夠檢測到單拷貝基因。省時地高辛標記的探針可以至少儲存一年。雜交溶液可以重復利用3-5次，重復次數主要取決于每

9、次雜交中產生彳百號的標記探針的量。.實驗步驟和所需材料在你開始前主要的操作要求此表中描述了地高辛標記和檢測中主要的提示:要求指引在清潔的條件下進行操作局壓滅菌地高辛系統(tǒng)的試劑過濾火菌的溶液包括：SDS,吐溫20,并應該加入到已滅菌的溶液中。用干凈的孵育托盤每次使用前都要嚴格地清洗實驗托盤處理膜的要求帶無粉手套處理膜的時候，只能夠用干凈的鐐子夾膜的邊緣流程匿3.2部分地同辛標記DNA3.3部分標記效率的檢測3.4部分DNA固定3.5部分雜交13.6部分免疫檢測13.7部分洗脫和DNA0點與另一探針的雜交3.2地高辛標記DNA介紹隨機引物標記的DNA帶有地高辛-11-dUTP,這一標記采用的是地高

10、辛高效引物試劑，這是一種含有隨機六碳糖，dNTP混合物的5X濃度標記混合物，其中dNTP混合物包括堿性標記的地高辛-11-dUTP,標記級的Klenow酶和適合的反應緩沖液。附加設備和所需試劑水浴冰水混合物此表中列出了成分，儲存條件和除了試劑盒成分外所需試劑的用途。溶液成分儲存條件/穩(wěn)定性用途水高壓火菌的雙蒸水15-25C,穩(wěn)定稀釋DNAEDTA乙二胺四乙酸）0.2MEDTA,pH8.015-25C,穩(wěn)定終止標記反應模板DNA卜表中列出了模板DNA所需特征:特征詳細信息純度模板DNA該采用theHighPurePlasmidIsolationKit進行制備。當采用其他商業(yè)化的純化試劑盒進行純化

11、時，我們建議額外進次苯酚/氯仿抽提以去除殘余的蛋白質。在標記之前如果對模板進行限制酶切或者其他酶的修飾作用，那么此步驟也是需要進行的。大小為了獲得理想的結果，模板DNA應該線性化，且大小應該在100bp以上。如果模板DNA大于5kb,那么在標記之前應該采用限制性酶切序列為4個核甘酸的限制性酶（如Haem）對模板進行酶解。數量上面步驟描述原則上10ng-3pg的模板均可以標記上，然而請仔細查看在給定的表中，用于你的雜交實驗所需的探針?？梢愿鶕峁┑牟僮鞣椒ǚ糯罂傮w積和成分用量來獲得更大量的標記探針。J口果要檢測復雜基因組中的單拷貝基因，需標記的模板DNAK至少300ng（探針濃度：25ng/mL

12、雜交液）。標記從瓊脂糖凝膠上分離的DNA如果你想要完成基因組的southern雜交，你應該利用瓊脂糖凝膠電泳將插入載體的模板DNA從載體上分離出來。為了從凝膠中分離DNA你可以用瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒（theAgaroseGelDNAExtractionKit）進行大小在400bp-5kbp范圍內DNA片段的回收。這一試劑盒既可以用于標準瓊脂糖凝膠也可用于低熔點瓊脂糖凝膠。然后，不需要進一步Z化即可對DNA片段進行高效的地高辛標記。然后標記好的探針應該用高效的PCR產物純化試劑盒（HighPurePCRProductPurificationKit）進行純化，以去除殘留的瓊脂糖顆粒。步驟此步

13、驟用于標記10ng-3gDNA?？梢酝ㄟ^擴大所有成分和體積標記更大量的DNA（最tWj達10g）。步驟操作1向一個反應管仲中加入1科g模板DNA（線性或超螺旋）和高壓火菌的雙蒸水，終體積達16L。2沸水浴10分鐘以變性DNA然后迅速插入冰水混合物中。注意：完全變性對于標記的有效性是十分重要的。3充分混合DIG-HighPrime（1號管），并取4dL加入到變性DNA中，混合并簡單離心。37c孵育1小時或者過夜。注意：較長的孵育時間（最高達20小時）能夠提高地高辛標記DNA的）M（見卜表）4力口入2dL0.2MEDTA（pH8.0）和/或65C加熱10分鐘終止反應。注意：采用地高辛高效引物獲得的

14、地高辛標記片段的長度范圍可以從200bp到1000bp甚至更長，這主要取決于原始模板DNA的長度。標記反應的產量表1:此表向您展示了在適宜條件下地高辛高效引物標記的產量。在標準反應中每個實驗采用1科gDNA作為模板。1小時內，大約有15%勺核甘酸參與到了0.8科g新合成的地高辛標記DNA中。20小時后消耗了大約38%勺核甘酸可達到2ug。模板DNA1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng使用DIG-High-Prime溶液，增加不同模板

15、DNA勺量進行反應，并檢測反應1小時和反應20小時的差異。地高辛標記DNA的產量由放射線示蹤器進行測定，并通過斑點雜交進行證實（10個獨立標記實驗的平均值）。g35D。量成合and記標每個模版DN雨記反應量圖2來自于不同量模板DNA的地高辛標記DNA37c孵育1小時和20小時后的產量標記效率的確定介紹地高辛標記DNAT量的確定對于獲得最佳的，具有可重現性的雜交結果十分重要。在雜交混合物中探針濃度過高容易產生背景，而太低濃度則容易導致信號弱。實驗原則檢測標記探針質量的好方法是直接檢測法。步驟描述1將地高豐標記DNA勺一系列稀釋梯度點到一小塊帶正電荷的尼龍膜上。尼龍膜部分區(qū)域已經點好一系列稀釋梯度

16、的地高辛標記的對照DNA（2號管）作為標準。2米用anti-DIG-AP結合物（4號管）和預混的NBT/BCIP存儲液進行免疫檢測。以顏色深淺比較地高辛標記DNA對照DNA勺一系列稀釋點的強度。所需附加溶液的制備請找出下表中的成分和所需制備的試劑。下表中的緩沖液也可以在地高辛洗滌和封阻緩沖液無DNA酶和RNA®系列產品中獲得。請注意：標記效率確定實驗中檢測部分所需的試劑和工作試劑應與你的雜交實驗（請看章）中化學發(fā)光檢測使用的試劑一致。這些試劑可以大量制備，在第3.7章中也將用到。溶液成分/制備儲存/穩(wěn)定性用途洗滌緩沖液0.1M馬來酸；0.15MNaCl;pH7.5(20C)；0.3%

17、(v/v)Tween2015-25C,穩(wěn)定去除未結合的抗體馬來酸緩沖液0.1M馬來酸0.15MNaCl用NaOH固體)調節(jié)pH值到7.5(20C)15-25C,穩(wěn)定封阻液的稀釋檢測緩沖液0.1MTris-HCl;0.1MNaClpH9.5(20C)15-25C,穩(wěn)定調整pH值到9.5TE緩沖液10mMTris-HCl1mMEDTApH8.015-25C,穩(wěn)定終止顯色反應試劑盒工作溶液的制備卜表中列出試劑盒工作溶液的制備方法:溶液成分/制備方法儲存/穩(wěn)定性用途封阻溶液用馬來酸緩沖液按照1:10的比例將10X封阻液（6號管）稀釋成1X工作溶液一直新鮮制備封阻膜上非特異結合位點抗體溶液每次使用前將原

18、始管仲的anti-digoxigenin-AP（4號管）10000rpm離心5分鐘。然后從表面小心吸取所需用量。用封阻溶液按照1:5000（150mU/mD的比例稀釋anti-digoxigenin-AP2-8C,12h與地同辛標記的探針結合底物顯色液取40ulNBT/BCIP存儲液（第5號管）加入到2ml檢測緩沖液中注思：避光！一直新鮮制備抗體結合點顯色稀釋系列根據合成核甘酸的預期產量開始下面的的系列稀釋，標記的探針和地高辛標記的對照DNA（2號管）應該稀釋到1ng/科L。利用第3.3章中圖表可以最好的估計出在你的探針中地高辛標記DNA勺預期產量。產量取決于起始時的模板量和孵育時間。注意：表

19、1中給出的產量是采用高純度的DNA莫板在最佳條件下生產出的。按照下表中的描述對你標記的探針和你的對照DNA進行一系列的梯度稀釋。管DNA(dL)來自于管#DNA稀釋緩沖液（3號管）（）稀釋比例終濃度1稀釋的原液1ng/L2211981:10010pg/科L3152351:3.33pg/科L452451:101pg/科l553451:100.3pg/LL654451:100.1pg/L755451:100.03pg/lL856451:100.01pg/lL90-50-0操作步驟下面的步驟描述的是直接檢測。注意：在全部的步驟中，用足夠的緩沖液體積完全覆蓋膜。步驟操作1分別從你標記的探針和標記對照D

20、NA勺2-9號管中取出1L點在尼龍膜上2通過紫外交聯或者120c烘烤30分鐘的方法將核酸固定在膜上3將膜轉移到一個裝有20mL馬來酸緩沖液的塑料容器中在15-25C中振蕩孵育2分鐘4在10mL封阻液中孵育30分鐘5在10mL抗體溶液中孵育30分鐘6用10mL洗滌緩沖液洗滌兩次，每次15分鐘7在10mL檢測緩沖液中平衡2-5分鐘8將膜上帶有DNA的一面朝上，放在一個折疊夾上（或者雜交袋），向膜上加入2mL的新鮮配制的的底物顯色液。均勻的鋪平底物，且膜上不能有氣泡。保持膜靜止，避光。15-25C中孵育到有顏色出現為止。注意：可短時間打開看是否有斑點出現。9當出現斑點時，用50mlTE緩沖液浸泡膜5

21、分鐘，用滅菌去離子水也可達到同樣效果。將結果掃描或拍照保存。結果分析比較對照與你的標記反應產生的點的強度差異，并計算出地高辛標記DNA的量。如果你的探針稀釋后量達0.1pg的點與對照DNA勺點均可見，那么說明標記的探針達到了預期的標記效率（見第3.2章中表1）,能夠滿足雜交所需的探針濃度。孵育時間顯色濃度510分鐘30pg30分鐘3pgDNA的轉移和固定轉移方法和膜凝膠電泳的標準操作方法，膠的變性和中和均參照參考文獻中Sambrook等的文章。膠中不加入EB會更好，因為EB可能引起背景不均勻的問題。所有普通類型的DNA轉移方法都適用于后續(xù)的地高辛雜交實驗（4,5）根據我們的經驗，用20XSSC

22、采用毛細管轉印的方法使DNA專印到帶有正電荷的尼龍膜上可以獲得最好的結果。注意：堿性轉移（如在0.4MNaOH中）不適用于地高辛標記分子量marker的轉移。固定操作將DNA定到膜上可以通過下面的任何一種操作:如果你想采用那么紫外交聯的方法（尼龍膜）將膜放到已經用10XSSC浸透的Whatman3MM紙上。洗滌之前用紫外交聯這塊濕潤的膜紫外交聯后，將膜放入雙蒸水中簡單沖洗一下，然后自然晾干。120C,烘烤（尼龍膜）在2xSSCW單的洗滌一下膜將尼龍膜放在120c下烘烤30分鐘或者根據操作說明的要求進行操作。80C,烘烤（尼龍膜）在2XSSCW單的洗滌一下膜將尼龍膜放在80c卜真空烘烤2小時膜的

23、儲存請根據下表選擇膜的儲存方法。如果那么你想繼續(xù)實驗立即將這個膜進行預雜交如果你想稍后進行實驗那么將干燥的膜儲存于2-8C雜交需要的附加設備冰水浴震蕩水浴或雜交爐耐高溫的塑料或者玻璃盒，培養(yǎng)皿，滾筒瓶或者可密封的塑料袋注意：不要用敞口的容器盛放雜交緩沖液雜交工作溶液的制備分兩次小心的將64mL無菌雙蒸水加入到地高辛雜交顆粒瓶（7號瓶）中，然后立即在37c條件下攪拌5分鐘進行溶解。雜交溫度適宜的雜交溫度是根據GC含量和探針與靶片段的相似百分數計算獲得的，具體的公式如下：Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）I=能夠雜交上的片段的長度，以堿基對進行計算Topt.=Tm-（2025C）這一給出數字的方程式是根據雜交溶液中含有50%?酰胺的標準方程式計算得到的。用于地高辛雜交液進行雜交的實際雜交溫度Topt.要比計算出的Tm低20-25C。Topt.可以作為一個嚴謹的雜交溫度，允許探針和靶序列之間有18%勺錯配。當你的探針與靶序列的相似度低于80%寸，你應該相應的降低Topt（大約每1%勺錯配要降低1.4C）,同時相應的調整嚴謹洗滌步