蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定

1、蛋白質(zhì)等電點(diǎn)測(cè)定 及性質(zhì)實(shí)驗(yàn)、目的：了解等電點(diǎn)的意義及其與蛋白質(zhì)分子聚沉能力的關(guān)系。初步學(xué)會(huì)測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的基本方法，了解蛋白質(zhì)的性質(zhì)。、原理：固體顆粒在液體中為什么能夠帶電?當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體可以從溶液中選擇性吸附某種離子，也可以是固體分子本身發(fā)生電離作用而使離子進(jìn)入溶液，以致使固液兩相分別帶有不同符號(hào)的電荷，由于電中性的要求，帶電外表附近的液體中必有與固體外表電荷數(shù)量相等但符號(hào)相反的多余的反離子。在界面上 帶電外表和反離子 形成了雙電層的結(jié)構(gòu)。在兩種不同物質(zhì)的 界面上，正負(fù)電荷分別排列成的面層。對(duì)于雙電層的具體結(jié)構(gòu)，一百多年來不同學(xué)者提出了不同的看法。最早于1879年Helmhol

2、z提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chap man修正了平板型模型， 提出了擴(kuò) 散雙電層模型；后來 Stern又提出了 Stern模型。根據(jù)O.斯特恩的觀點(diǎn)，一部分反離子由于電性吸引或非電性的特性吸引作用例如范德華力而和外表緊密結(jié)合，構(gòu)成吸附層或稱緊密層、斯特恩層。其余的離子則擴(kuò)散地 分布在溶液中，構(gòu)成雙電層的 擴(kuò)散層或稱滑移面。由于帶電外表的吸引作用，在 擴(kuò)散層中反離子的濃度遠(yuǎn)大于同號(hào)離子。離外表越遠(yuǎn)，過剩的反離子越少， 直至在溶液內(nèi)部反離子的濃度與同號(hào)離子相等?；平缍⊿U1Q®）緊巒層（St«rn層SfEFIl擴(kuò)歆 雙電層模型反號(hào)離子溶列分子擴(kuò)散層緊密

3、層：溶液中反離子及溶劑分子受到足夠大的靜電力，范德華力或特性吸附力， 而緊密吸附在固體外表上。其余反離子則構(gòu)成擴(kuò)散層。滑動(dòng)面：指固液兩相發(fā)生相對(duì)移動(dòng)的界面，是凹凸不平的曲面?；瑒?dòng)面至溶液本體間的電勢(shì)差稱為Z電勢(shì)。固體顆粒帶電量的大小及測(cè)量方式？Z電勢(shì)只有在固液兩相發(fā)生相對(duì)移動(dòng)時(shí)才能呈現(xiàn)出來。Z電勢(shì)的大小由Zeta電位表示，其數(shù)值的大小反映了膠粒帶電的程度，其數(shù)值越高說明膠粒帶電越多，擴(kuò)散層越厚。一般來說，以pH值為橫坐標(biāo)，Zeta電位為縱坐標(biāo)作圖，Zeta電位為零對(duì)應(yīng)的pH值即為等電點(diǎn)。對(duì)于蛋白質(zhì)分子來說：蛋白質(zhì)分子的大小在膠粒范圍內(nèi)，約1100微米。大部分蛋白質(zhì)分子的外表都有很多親水集團(tuán)，這

4、些集團(tuán)以氫鍵形式與水分子進(jìn)行水合作用，使水分子吸附在蛋白質(zhì)分子外表而形成一層水合膜，具有親水性；又由于蛋白質(zhì)分子外表的親水集團(tuán)都帶有電荷，會(huì)與極性水分子中的異性電荷吸引形成雙電層。而水合膜和雙電層的存在， 使蛋白質(zhì)的分子與分子之間不會(huì)相互凝聚，成為比較穩(wěn)定的膠體溶液。如果消除水合膜或雙電層其中一個(gè)因素，蛋白質(zhì)溶液就會(huì)變得不穩(wěn)定， 兩種因素都消除時(shí)，蛋白質(zhì)分子就會(huì)互相凝聚成較大的分子而產(chǎn)生沉 淀。在生活實(shí)踐中，常利用蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)沉淀或別離蛋白質(zhì)。如做豆腐、肉皮凍就是利用蛋白質(zhì)的膠凝作用。蛋白質(zhì)分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關(guān)系，蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3

5、+而帶正電，在堿性溶液中羧基形成 -CO 0-而帶負(fù)電：C00-C00COOH/JH* H一卩 *+ 0H-px+ OH'、pH>plpH = plpH <龜場(chǎng)中：不c動(dòng)蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷為零時(shí)的pH值稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)PI。其定義為：在某一pH的溶液中，蛋白質(zhì)解離成陽離子和陰離子的趨勢(shì)或程度相等時(shí)，呈電中性，此時(shí)溶液的 pH稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。等電點(diǎn)的應(yīng)用：主要用于蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的別離、提純和電泳。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中不向任何一極移動(dòng)，而且分子與分子間因碰撞而引 起聚沉的傾向增加，所以這時(shí)可以使蛋白質(zhì)溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。蛋白質(zhì)在等

6、電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的測(cè)定各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點(diǎn)是，血紅蛋白等電點(diǎn)為，胰島素是，魚精蛋白是一個(gè)典型的堿性蛋白，其等電點(diǎn)在。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)在不同 pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時(shí)的pH值即為該種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)值， 這個(gè)方法雖然不很準(zhǔn)確， 但在一般實(shí)驗(yàn)條件下都能進(jìn)行， 操作也 簡(jiǎn)便。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)比較準(zhǔn)確的方法是采用等電聚焦技術(shù)加以準(zhǔn)確測(cè)定，但需一定的實(shí)驗(yàn)條件。等電聚焦電泳IEF， isoelectric focusing electrophoresis 利用特殊的一種緩沖液兩性電解質(zhì)在凝膠常用聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)制

7、造一個(gè)pH梯度，電泳時(shí)每種蛋白質(zhì)就將遷移到等于其等電點(diǎn)pl丨的pH處此時(shí)此蛋白質(zhì)不再帶有凈的正或負(fù)電荷，形成一個(gè)很窄的區(qū)帶。IEF的基本原理在IEF的電泳中，具有 pH梯度的介質(zhì)其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質(zhì)分子具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，這樣在堿性區(qū)域蛋白質(zhì)分子帶負(fù)電荷向陽極移動(dòng)，直至某一 pH位點(diǎn)時(shí)失去電荷而停止移動(dòng)，此處介質(zhì)的pH恰好等于聚焦蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)pl。同理，位于酸性區(qū)域的蛋白質(zhì)分子帶正電荷向陰極移動(dòng)，直到它們的等 電點(diǎn)上聚焦為止?？梢娫谠摲椒ㄖ校入婞c(diǎn)是蛋白質(zhì)組分的特性量度，將等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)混合物加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后

8、，各組分將分別聚焦在各 自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成別離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。沉淀反應(yīng)：蛋白質(zhì)在某種理化條件下，蛋白膠體溶液的水化層或者電荷層破壞，蛋白膠體相互聚集的現(xiàn)象。主要的沉淀現(xiàn)象有1鹽析：在蛋白質(zhì)水溶液中加入足量的鹽類如硫酸銨，可析出沉淀，稀釋后能溶解并仍保持原來的性質(zhì)，不影響蛋白質(zhì)的活性。這是一 個(gè)可逆的過程，可用于蛋白質(zhì)的別離與初級(jí)提純。2變性：在重金屬鹽、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、紫外線等作用下，引起蛋白質(zhì)某些理性質(zhì)改變和生物學(xué)功能喪失。這是一個(gè)不可逆過程。3加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質(zhì)分子爭(zhēng)奪水分子，破壞水化膜，短時(shí) 間內(nèi)是可逆反應(yīng)；4加入生物堿試劑含氮的堿性物質(zhì)：能使生物堿沉

9、淀或作用產(chǎn)生顏色反應(yīng)的物質(zhì)，稱為生物堿試劑。當(dāng)溶液的pH小于PI時(shí)，蛋白質(zhì)為陽離子，能與生物堿試劑的陰離子結(jié)合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白質(zhì)的主要成分，常溫下在水中可溶解 0.81.2% ,微溶于25度水和有機(jī)溶劑，溶于稀堿和濃酸中，能吸收水分。當(dāng)浸入水中則迅速膨脹。在牛奶中以磷酸二鈣、 三鈣或兩者的復(fù)合物形式存在。構(gòu)造極為復(fù)雜，沒有確定的分子式。分子量約為57000375000，在牛奶中約含 3%,占牛奶蛋白質(zhì)的 80%。三、器材及試劑：1 .器材： 試管x厘米X 9。 吸管1毫升X 2，2毫升X 2，10毫升X 2。 容量瓶50毫升X 2，500毫升X 1。 試管架。2. 試劑： L-1醋

10、酸溶液。 L-1醋酸溶液。 1 mol L-1醋酸溶液。 1 mol L-1氫氧化鈉溶液氫氧化鈉和醋酸溶液的濃度要標(biāo)定。 酪蛋白。四、操作步驟：1 .制備蛋白質(zhì)膠液1稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入 40C的蒸餾水。2加入50毫升1 mol L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質(zhì)完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉(zhuǎn)移到 500毫升容量瓶中，并用少量蒸餾水洗凈燒杯，一并倒入容量瓶。3在容量瓶中再加入 1 mol L-1醋酸溶液50毫升，搖勻。4加入蒸餾水定容至 500毫升，得到略現(xiàn)渾濁的，在0.1 mol L-1NaAC溶液中的酪蛋白膠體。2. 等電點(diǎn)測(cè)定按下表順序在各管中加入蛋白質(zhì)膠液，并準(zhǔn)確地

11、加入蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液， 加入后立即搖勻。管 蛋白質(zhì)出0mol L-1 mol L-1 1mol L-1pH觀 察號(hào)膠液（毫升）（毫升）HAC（毫升）HAC毫升HAC毫升0分鐘10分鐘20分鐘112131415161718191觀察各管產(chǎn)生的混濁并根據(jù)混濁度來判斷酪蛋白的等電點(diǎn)。觀察時(shí)可用+, +, +,表示渾濁度。3. 蛋白質(zhì)性質(zhì)實(shí)驗(yàn)1蛋白質(zhì)的鹽析在試管里加入12毫升蛋白質(zhì)的水溶液，然后逐滴加入硫酸銨飽和溶液，觀察現(xiàn)象，有無白色渾濁產(chǎn)生。滴加過程中不要搖動(dòng)試管，現(xiàn)象不明顯時(shí)，多加幾滴硫酸銨飽和溶液。2蛋白質(zhì)的變性在試管里加入 2毫升蛋白質(zhì)的水溶液，沸水浴加熱5分鐘，觀察現(xiàn)象。把試管里的下層物質(zhì)取出一些放在水里，觀察現(xiàn)象。在試管里加入3毫升蛋白質(zhì)的水溶液，加入 1毫升硫酸銅溶液，觀察現(xiàn)象。有無淡藍(lán)色絮狀渾濁沉淀產(chǎn)生。把少量沉淀放入盛有蒸餾水的試管里，觀察沉淀是否溶解。五、思考 題1、在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度為什么最低？請(qǐng)結(jié)合你的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)加以說明。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零（即正負(fù)電荷相等），此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱， 其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本實(shí)驗(yàn)中，酪蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)從溶