PCR污染防治手冊(cè)

1、PCR污染防治手冊(cè)一、為什么要如此重視防治PCR污染？聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法。擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增的DNA產(chǎn)量是呈指數(shù)上升的。PCR產(chǎn)物的濃度一般為1013拷貝/ml,而1mg人基因組DNA才含1.4*106拷貝的單拷貝基因片段，因此使得PCR擴(kuò)增反應(yīng)的敏感性非常高。正是由于PCR反應(yīng)具有強(qiáng)大的擴(kuò)增效率也導(dǎo)致其及易污染，極微量的PCR產(chǎn)物污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。在應(yīng)用HPV分型試劑盒的過程中，主要存在兩個(gè)污染源：標(biāo)本間的交叉污染；2.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。其中以第二個(gè)污染源為最為常見，通過下面一個(gè)例子便可認(rèn)

2、識(shí)到PCR產(chǎn)物污染的嚴(yán)重性。在100ml的反應(yīng)管中可產(chǎn)生1012拷貝個(gè)分子，若將這些分子在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)奧林匹克游泳池(50m*25m*2m)內(nèi)稀釋后，0.1ml稀釋液含有400拷貝的擴(kuò)增分子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了PCR擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限。因此，一定要注意產(chǎn)物殘留污染的問題，對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室尤應(yīng)如此。二、PCR污染的來源對(duì)于HPV分型檢測(cè)試劑盒來說，污染的來源主要是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，常見的污染途徑有兩種，一是氣溶膠污染，在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及受污染的進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污

3、染是一個(gè)值得特別重視的問題。二是PCR產(chǎn)物的粘帶污染，此類污染多是因?yàn)闆]有嚴(yán)格遵守分區(qū)規(guī)定，造成PCR產(chǎn)物擴(kuò)散到樣品抽提或PCR實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)大衣、手套、移液槍、槍頭、槍頭盒和試管架都是常見的粘帶污染源。污染發(fā)生時(shí)，這些地方是重點(diǎn)懷疑的地方。三、PCR污染的追蹤如果不慎發(fā)生或者懷疑有污染發(fā)生，可以設(shè)計(jì)一個(gè)簡(jiǎn)單的小實(shí)驗(yàn)以確認(rèn)污染源。用HPV勺PCR擴(kuò)增系統(tǒng)擴(kuò)增如下模板：A:水-作為陰性對(duì)照，如果此管擴(kuò)增出陽(yáng)性，則可以判定為試劑已經(jīng)污染或者是氣溶膠污染。B:陽(yáng)性樣品-作為陽(yáng)性對(duì)照，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功。C-X:-所要檢查的地方，用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源，0.1ml去離子水浸泡后作為模板。常

4、見的需要檢查的地方為各個(gè)實(shí)驗(yàn)臺(tái)面、移液槍、槍頭、槍頭盒、試管架、冰箱內(nèi)、冰箱把手、水浴鍋、抽提的相關(guān)試劑以及相關(guān)人員的辦公桌。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，可以在室內(nèi)加裝紫外燈管照射過夜且徹底通風(fēng)并停止幾天的實(shí)驗(yàn)。四、PCR污染的預(yù)防進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。1、劃分操作區(qū)：實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行，最基本的一個(gè)原則就是PCFT增及雜交檢測(cè)區(qū)的東西是屬于污染源，絕對(duì)不

5、可以帶到前兩個(gè)區(qū)去。A:樣品制備區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；B:PCR加樣區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增；C:PCRT增及雜交檢測(cè)區(qū)，雜交操作過程在這個(gè)地方完成。分區(qū)的注意事項(xiàng)：各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析產(chǎn)物處理。樣品的保存應(yīng)該在上述三個(gè)區(qū)以外單獨(dú)的區(qū)域。各個(gè)區(qū)域的物品及衣服必須嚴(yán)格遵守單向的原則。各個(gè)區(qū)域必須要自己?jiǎn)为?dú)的實(shí)驗(yàn)衣，實(shí)驗(yàn)時(shí)必須戴上手套。每個(gè)區(qū)域要有自己?jiǎn)为?dú)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。以下是常見的分區(qū)方式：PCR擴(kuò)增及雜交檢測(cè)PCR加樣樣品制備區(qū)PCR擴(kuò)增及雜交樣品制備及PCR檢測(cè)區(qū)加樣區(qū)-t-pl-緩沖間緩沖間圖三1V圖二PCR擴(kuò)增及雜交

6、檢測(cè)區(qū)樣品制備區(qū)走廊PCR加樣區(qū)圖四2、實(shí)驗(yàn)操作的注意事項(xiàng)：A:戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；B:使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；C:避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；D:操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；E:盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少應(yīng)經(jīng)常的

7、擦洗槍外表及槍管內(nèi)。3、嚴(yán)格對(duì)PCRT物的處理：PCR產(chǎn)物包括雜交產(chǎn)物，在讀數(shù)結(jié)束后，雜交產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物應(yīng)該用一次性密閉容器（垃圾袋、自圭寸袋）裝好后丟棄或者倒至1mol/LHCl溶液或1:25的84消毒液中，浸泡半小時(shí)以上后再行丟棄。如果有產(chǎn)物濺在了桌面或器具上，應(yīng)立即用1mol/LHCl溶液或1:25的84消毒液擦拭。4、根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況建立完善的日常PCRB治制度并嚴(yán)格執(zhí)行事在人為，制度執(zhí)行了才能達(dá)到它應(yīng)有的效果，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況建立制度后必須嚴(yán)格執(zhí)行，絕對(duì)不能因?yàn)閳D方便放松警惕。1. 五、PCR污染后的處理如果是器具的污染，可以對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸或者1:25的84消毒液擦拭

8、或浸泡。如果臺(tái)面污染，可能的話用紫外燈照射過夜。2. 如果是試劑污染請(qǐng)更換試劑，但試劑污染一般伴隨著器具污染，務(wù)必查找出污染源并及時(shí)處理。3. 對(duì)于被污染的區(qū)域，最好更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，可能的話應(yīng)加裝紫外燈照射過夜，實(shí)在不行也必須加強(qiáng)通風(fēng)幾天，并停止實(shí)驗(yàn)后檢測(cè)是否還有污染。六、實(shí)驗(yàn)室實(shí)例：1、分區(qū)情況：實(shí)驗(yàn)室分成兩個(gè)區(qū)，類似圖二所示。因?yàn)闂l件所限，沒有設(shè)置緩沖區(qū)，但兩個(gè)區(qū)相隔較遠(yuǎn)，可以有效避免汽溶膠的傳播。2、規(guī)章制度：A:定期監(jiān)測(cè)：使用棉簽涂抹的方法，一個(gè)月一次定期監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè)地點(diǎn)為：超凈臺(tái)桌面、超凈臺(tái)內(nèi)槍（包括槍吸孔內(nèi)和槍體）、超凈臺(tái)槍頭盒、超凈臺(tái)內(nèi)常用PE管架及PCR管架，冰箱冰柜把手（兩臺(tái)）、

9、冰箱內(nèi)部（每個(gè)冰箱3個(gè)棉簽包括冰箱內(nèi)部表面和隨機(jī)的冰箱內(nèi)試劑盒）、常用試劑試劑盒、試劑表面。抽提桌面、抽提區(qū)槍（包括槍吸孔和槍體）、抽提區(qū)常用試管架、抽提區(qū)槍頭盒、水浴鍋水、沸水浴鍋水，相關(guān)試驗(yàn)人員辦公室桌面、鼠標(biāo)、鍵盤。需要做的工作：安排指定人員每月進(jìn)行一次監(jiān)測(cè)。每次監(jiān)測(cè)填寫記錄表（見附表）。B:物流：嚴(yán)格單向物流，只允許從A區(qū)（樣品制備及PCR加樣區(qū)）到B區(qū)（PCR擴(kuò)增及雜交檢測(cè)區(qū)）的物品流動(dòng)。B區(qū)任何物品（PCR管架、PE管架）進(jìn)入A區(qū)前必須經(jīng)過處理（1:100）的84消毒液浸泡半小時(shí)）。各區(qū)物品單獨(dú)使用，不允許交叉使用。需要做的工作：A、物品A-B前處理（84浸泡后洗滌）C:人流：抽提

10、、PCR以及B區(qū)必須要有單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)服，進(jìn)入A、B兩區(qū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)必須穿上各自的實(shí)驗(yàn)服，不允許將實(shí)驗(yàn)服穿到另一個(gè)區(qū)。（注：如果進(jìn)入一個(gè)區(qū)不是為了實(shí)驗(yàn)，可以不穿實(shí)驗(yàn)服，但絕對(duì)不允許穿另一個(gè)區(qū)的實(shí)驗(yàn)服進(jìn)入）。實(shí)驗(yàn)服兩周洗滌一次，但切記兩個(gè)區(qū)的衣服不要在同一批洗，分成兩次洗，可以這周洗滌這個(gè)區(qū)的下周洗滌另一個(gè)區(qū)的。需要做的工作：指定一周輪一周洗滌衣服，各人衣服各人負(fù)責(zé)。D:實(shí)驗(yàn)規(guī)程：1、實(shí)驗(yàn)時(shí)必須戴橡膠手套或薄膜手套；抽提桌面實(shí)驗(yàn)完成后用84擦洗；PCR實(shí)驗(yàn)室每天（實(shí)驗(yàn)量少的話可減少）晚上用紫外照射；如果在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)有樣品（包括抽提前和抽提后）或PCR產(chǎn)物必須立即用84擦洗；在B區(qū)如果手接觸過桌面或者

11、其它有可能污染有PCR產(chǎn)物的地方（槍、Luminex儀器等）必須盡快洗手；定期處理：各區(qū)槍每周用1:25的84消毒液擦洗（不需要拆開，主要是槍體和吸樣孔內(nèi)）。各區(qū)試管架每周用1:25的84消毒液擦洗。各桌面每周用1:25的84消毒液擦洗。冰箱把手及外表每周用1:25的84消毒液擦洗。水浴鍋及沸水浴鍋每周換一次水。相關(guān)工作人員辦公桌每周用1:25的84消毒液擦洗需要做的工作：A、實(shí)驗(yàn)（特別是雜交檢測(cè)），發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)物濺出立即擦洗。B、勤洗手。C、PCRD、安排指定人員每周擦洗指定位置。E、PCR實(shí)驗(yàn)室做完實(shí)驗(yàn)打開紫外。E:PCR產(chǎn)物處理：準(zhǔn)備保鮮袋，每次的PCR產(chǎn)物（包括雜交產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物）丟棄前

12、必須用保鮮袋扎好后再丟棄；雜交檢測(cè)試驗(yàn)區(qū)準(zhǔn)備可以裝保鮮袋并有蓋子的垃圾桶，使用過的槍頭一律扎好后丟棄；電泳旁邊的冰箱為PCR產(chǎn)物臨時(shí)存放區(qū)，嚴(yán)禁PCR產(chǎn)物開蓋存放，定期（一個(gè)月）清理。需要做的工作：A:嚴(yán)格操作，把PCR產(chǎn)物作為高危險(xiǎn)物品小心處理。B:指定日期清理PCR產(chǎn)物。F:發(fā)生污染后的處理：如果懷疑有污染發(fā)生，執(zhí)行監(jiān)測(cè)程序，對(duì)于重點(diǎn)懷疑對(duì)象可以多作幾份。找到污染源后，桌面一用84擦洗后紫外照射一個(gè)晚上，槍一用84擦洗（拆開）后紫外照射過夜，槍頭盒、試管架一84擦洗后紫外照射過夜，槍頭一丟棄，試劑一丟棄，衣物一用84浸泡后洗滌干凈。冰箱把手-84擦洗后紫外照射過夜。冰箱內(nèi)部-84擦洗如果污

13、染嚴(yán)重的話流水沖洗后84擦洗，試劑盒-84擦洗或流水沖洗。處理完后執(zhí)行監(jiān)測(cè)程序檢查污染情況。精品文檔PCR污染情況監(jiān)測(cè)表試驗(yàn)日期試驗(yàn)人員序號(hào)編勺地點(diǎn)試驗(yàn)結(jié)果備注1超凈臺(tái)桌面2超凈臺(tái)槍槍吸孔內(nèi)和槍體3超凈臺(tái)槍頭盒4超凈臺(tái)內(nèi)EP管架及PCR管架5冰箱把手6冰柜把手7冰箱內(nèi)部18冰箱內(nèi)部29冰箱常用試劑試劑盒10冰柜內(nèi)部111冰柜內(nèi)部112冰柜常用試劑試劑盒13PCR試劑表面14抽提桌面15抽提區(qū)槍包括槍吸孔和槍體16抽提區(qū)常用試管架17抽提區(qū)槍頭盒18水浴鍋水19沸水浴鍋水20試驗(yàn)人員1辦公室桌面21試驗(yàn)人員1鼠標(biāo)、鍵盤22試驗(yàn)人員2辦公室桌面23試驗(yàn)人員2鼠標(biāo)、鍵盤24試驗(yàn)人員3辦公室桌面25試驗(yàn)人貝3阻標(biāo)、鍵盤26試驗(yàn)人員4辦公室桌面27試驗(yàn)人貝4鼠標(biāo)、鍵盤28試驗(yàn)人員5辦公室桌面29試驗(yàn)人貝5鼠標(biāo)、鍵盤30陽(yáng)性對(duì)照31陰性對(duì)照試驗(yàn)方法：準(zhǔn)備1.5m