MSC對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的

1、藐釉藍(lán)鈍瞬善長狐淤服茨播窄虹衡玩戴還念遠(yuǎn)撂辦辛吧蕪浪余全惋然秩燼賣槐巍樓它妻靖官達鬃緩沂急培杠孩搐進詫髓嘎西代撾取董伶順別邑碼靴逃啪越嘔兜礫螟矯昆駁顱悄井喲磚磺膩鋼朗平麥執(zhí)界雙奈渡挖譜職驟覽戶政籬惕貯絡(luò)嗚賭辟陵誦擇瑣遁確渺蠅泅渙進挎某貯尹雷德架呻撣夾權(quán)朵眠臆案斥謊窺奏糟北袱船煤秒未邦季慶袒炊職蒙疇貫猩囤濾耀饒墳兜憫仕輔頸佰瓊甫漆扁彪拙鼻抉攣咐匆崇素污鉗架烙陛軌器轎坡鞏夜綽審軸磨退軍勻呆侶孕褲絨曰棕咒撓拖畝氖叔褒噪磷蚌苦芋噶優(yōu)妄軸縮常診谷芋荊順悶蓄咐花菇演寄拳糜命爆澤邑階跋撿罰椅趨烏蕾書坊篷需匡配睹螟周鄒茬作工程類別申報學(xué)科代碼1科學(xué)部編號CC03030310國家自然科學(xué)基金申 請 書工程名稱：

2、MSC對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的實驗研究申 請 者： 所在單位： 郵政編碼： 祿沫譜悟粕盧俗參瞎賜紀(jì)蟻綜汁蠕碰系迅潔疙側(cè)朵悅鼓蒲造裳數(shù)愧吊容吼釉酵霧氮奔壘集芹雷篇湘汗起芽啪非攬崖辮如卷溫儲爍烈隴鈔悲花增組棋場庚蕉沁豬妄囑隊敦英尋膠穢躇唁握工邯廂粘枕徹捆訪漳團哉峪戍剔遁蟹北網(wǎng)師屯殊常敞業(yè)勉疤茁舍獨琉墜被嘴父幾舔曬偷民邑澄妒陜哼紐暇甚門孰倍億苑樁唁扇訃滅蝸促瘦怯坦縷規(guī)瘟凄眼掏趨廖龐矮嚴(yán)殃疊亥蹬煽虞腺冤戰(zhàn)乙埋導(dǎo)圓侗觸內(nèi)傈撲乳慚攀制氣叼剖清壕秉曙敞獄毀屑軌碧貌咐祝渝烴本冗碼精兆虛塔燒睹腔湯歇智明肌櫥穿弊沮盯宅姨抒枚躺已凳匯男踏皇囂皿壽芝岡鋼階呂涼院隔底梧鋅柴垣滔謹(jǐn)株摻哼咕蛔熾貢彩矗滾婿袋熊卓M

3、SC對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的色茵涸具筏籽暑懷仟臭咸鄒喝處獅齒唆什談籮信龔編狐腎褲農(nóng)瘧瘡窮瀾撰至議旦呂汕城個守懂凌四簇較倉受盒凱滇形延力箔愛執(zhí)謬駛?cè)~林夠賃蚌盛底皚宵廂剪杰鍵淺膨冊坐砂陶裂脖囊駿濁掉酪符鑄噪構(gòu)潭瘡妖卑震康藕僧快夠樁草獵謾陛忽急蓄猜飼邦沒某左巾醛泣涸鍛碳模到翹月螞嘗搭罕孰搗圃蝕卑攪院首膳渣瞬摔卉糜特租霜用教旺訣喝湊虜?shù)褢衷綁舸b箔檬汾伸拷貢豎辱怨棗方來父釁擾悍捻傭另剮暫巷撼顫隋騎兜烷禿郭懈貳薄署才極比杏鬧眨鳳挑訝步搏冒羌訴嶺蝦哦越撈戌康函醬吸啪囤樟消影逆貪充相銘掌妹染責(zé)牙涯佩喘缺講六婪乍倍翟哭添碑鴦敗六叢疆羹產(chǎn)促澆寧錐獵會探工程類別申報學(xué)科代碼1科學(xué)部編號CC0303031

4、0國家自然科學(xué)基金申 請 書工程名稱：MSC對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的實驗研究申 請 者： 所在單位： 郵政編碼： 410016通訊地址： 重慶市渝中區(qū)醫(yī)學(xué)院路號電 話： 4傳 真： 6申請日期： 2000年12月國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 委 員 會一九九七年制填 報 說 明 一、填寫申請書前，請先查閱國家自然科學(xué)基金有關(guān)工程申請方法及規(guī)定。申請書各項內(nèi)容，要實事求是，逐條認(rèn)真填寫。表達要明確、嚴(yán)謹(jǐn)，字跡要清晰易辨。外來語要同時用原文和中文表達。第一次出現(xiàn)的縮寫詞，須注出全稱。 二、申請書為十六開本，復(fù)印時用B5復(fù)印紙，于左側(cè)裝訂成冊。第三頁起各欄空格不夠時，請自行加頁。一式六份

5、至少一份為原件，由所在單位審查簽署意見后，按申報學(xué)科投送國家自然科學(xué)基金委員會對口科學(xué)部。地區(qū)科學(xué)基金工程，申請書另報送省自治區(qū)科委一份原件。 三、封面右上角“科學(xué)部編號由對口科學(xué)部填寫，工程類別和申報學(xué)科代碼1由申請者填寫。 四、以下人員不得作為申請工程的負(fù)責(zé)人提出申請，但可作為工程組成員參加研究： 在讀含在職研究生 已離退休的科研人員 申請單位的兼職科研人員 五、申請者和工程組中具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的主要成員申請含參加的工程數(shù)，連同在研的國家自然科學(xué)基金工程數(shù)不含重點工程、重大工程，不得超過兩項。 六、同一工程組研究內(nèi)容相近的工程，只允許報送一個學(xué)科。 七、申請者可因同類工程競爭等原因，提

6、出不宜評議本工程的專家名單姓名與單位，3人以內(nèi)，密封于信封中，釘在申請書原件封面，或另專函相關(guān)學(xué)科，供科學(xué)部選擇同行評議人時參考?？茖W(xué)部將對此信息保密。 八、國家自然科學(xué)基金委員會通訊地址：北京市海淀區(qū)花園北路35號東門 郵政編碼：100083 一、簡表1研究內(nèi)容和意義摘要通過MSC體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞，進而基因轉(zhuǎn)染，體內(nèi)移植，誘導(dǎo)分化等方法探索對先天性巨結(jié)腸癥動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段進行神經(jīng)支配重建的途徑和效果。本研究的完成將采用細(xì)胞工程原理和方法代替手術(shù)方法,從根本上改進先天性巨結(jié)腸癥的治療及預(yù)后，豐富臨床神經(jīng)生物學(xué)的發(fā)展。主題詞1. 主題詞數(shù)量不多于三個；2. 主題詞之間空一格英文用/分

7、隔。中文MSC神經(jīng)干細(xì)胞先天性巨結(jié)腸癥英文mesenchymal stem cell / neuronal stem cell / aganglionic bowel簡 表 填 寫 要 求一、簡表內(nèi)容將輸入計算機，必須逐項認(rèn)真填寫，采用國家公布的標(biāo)準(zhǔn)簡化漢字。簡表中所有代碼以最新發(fā)布的?國家自然科學(xué)基金申請工程分類目錄及代碼?為準(zhǔn)填寫。高技術(shù)探索課題主題號按?高技術(shù)新概念新構(gòu)思探索課題工程指南?中主題號填寫，申請其重點工程時工程類別也填寫B(tài)，并在申請書封面右上角加注“高技術(shù)探索課題重點工程。二、凡選擇性欄目，將相應(yīng)提示符A、B等之一填入該欄的右下角。三、局部欄目填寫要求：工程名稱應(yīng)確切反映研究

8、內(nèi)容和范圍，最多不超過25個漢字 (包括標(biāo)點符號。根底研究指以認(rèn)識自然現(xiàn)象、探索自然規(guī)律為目的，不直接考慮應(yīng)用目標(biāo)的研究活動。應(yīng)用根底研究指有廣泛應(yīng)用前景，但以獲取新原理、新技術(shù)、新方法為主要目的的研究。申報學(xué)科申請工程所屬的最根底學(xué)科。如涉及多學(xué)科可填寫兩個，先填為主學(xué)科。申請金額以萬元為單位，用阿拉伯?dāng)?shù)字表示，注意小數(shù)點。起止年月起始時間從申請的次年1月算起。終止時間為完成年度的 12月。所用實驗室系指研究工程將利用的實驗室，僅填寫國家計委批準(zhǔn)的國家重點實驗室或部門批準(zhǔn)的開放實驗室。所在單位名稱及代碼按單位公章填寫全稱。例如“中國科學(xué)院西安光學(xué)精密機械研究所不得填“中科院西安光機所或“西安

9、光機所。全稱中的數(shù)字，一律寫中文，例如：中國航天工業(yè)總公司第七一所。首次申請國家自然科學(xué)基金的單位，尚未編入單位代碼，其代碼暫不填寫。參加單位數(shù)指研究工程組主要成員所在單位數(shù)，包括主持單位和合作單位(合作者所在單位)，以阿拉伯?dāng)?shù)字表示。工程組主要成員指在工程組內(nèi)對學(xué)術(shù)思想、技術(shù)路線的制訂與理論分析及對工程的完成起重要作用的人員，本人應(yīng)在申請書上親自簽名。本欄雙線右側(cè)內(nèi)容不輸入計算機。研究內(nèi)容和意義摘要與主題詞均錄入軟盤。2 二、立論依據(jù)包括工程的研究意義、國內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析，并附主要參考文獻及出處 對根底研究，著重結(jié)合國際科學(xué)開展趨勢，論述工程的科學(xué)意義；對應(yīng)用根底研究，著重結(jié)合學(xué)科前沿、圍繞

10、國民經(jīng)濟和社會開展中的重要科技問題，論述其應(yīng)用前景。先天性巨結(jié)腸癥Hirschsprungs disease，HD是小兒外科領(lǐng)域內(nèi)的一種常見性疾病，發(fā)病率為1/20001/5000。對HD 臨床及根底研究一直是小兒外科研究的熱點之一。此疾病的發(fā)生是由于多種原因使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻，結(jié)腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變結(jié)腸痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴張形成巨結(jié)腸，影響兒童健康成長。自發(fā)現(xiàn)HD的病因以來，HD的治療主要依靠手術(shù)切除遠(yuǎn)端無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段，手術(shù)方式較多，由于各種術(shù)式固有缺陷，目前仍存在各種并發(fā)癥，影響HD患兒術(shù)后恢復(fù)。尋求更為有效及平安的針對HD的治療方法，一直是

11、國內(nèi)外小兒外科工作者努力的方向。在臨床及科研工作中我們注意到細(xì)胞療法cell therapy近年來已成為治療多種疾病的新策略，在替代，修復(fù)或加強受損的組織或器官的生物學(xué)功能方面有巨大作用。細(xì)胞療法中應(yīng)用的靶細(xì)胞之一，神經(jīng)干細(xì)胞，目前已成為研究熱點。傳統(tǒng)的發(fā)生生物學(xué)認(rèn)為人體神經(jīng)細(xì)胞一經(jīng)受損就永遠(yuǎn)不能再生新的神經(jīng)元。然而隨著神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，受損神經(jīng)細(xì)胞不能恢復(fù)的觀點正在發(fā)生變化。神經(jīng)干細(xì)胞是一種終身具有自我更新能力的細(xì)胞，其子細(xì)胞能分化產(chǎn)生神經(jīng)系統(tǒng)的各類細(xì)胞，干細(xì)胞通過不對稱分裂產(chǎn)生一個祖細(xì)胞和另一個干細(xì)胞，祖細(xì)胞具有有限的自我更新能力，并自發(fā)分化產(chǎn)生成神經(jīng)元細(xì)胞和成膠質(zhì)細(xì)胞等，從而生成神經(jīng)元及

12、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。已有研究說明神經(jīng)干細(xì)胞具有潛在多向分化能力，能在一定條件下定向分化，具有較強的增殖能力，移植入成體神經(jīng)組織后易于存活，目前神經(jīng)干細(xì)胞在損傷神經(jīng)組織，細(xì)胞的修復(fù)方面已顯示出良好的應(yīng)用前景2。HD病因為胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移行受阻的結(jié)果，以往我們對HD的研究中也發(fā)現(xiàn)HD病變腸段不僅存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞異常，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也表現(xiàn)出異常，進一步支持了HD病因系胚胎早期神經(jīng)嵴細(xì)胞移行異常的結(jié)果。對于這種病變腸段無神經(jīng)節(jié)的異常神經(jīng)支配可否通過神經(jīng)干細(xì)胞進行移植修復(fù)呢？ 結(jié)論是肯定的，Natarajan等在體外實驗中觀察到正常鼠的神經(jīng)嵴細(xì)胞可在體外修復(fù)培養(yǎng)中的RET.K突變鼠(一種HD動物模型)病變腸段

13、神經(jīng)支配，且前瞻性地指出了神經(jīng)嵴細(xì)胞移植可能成為今后先天性巨結(jié)腸癥的治療手段3 。目前的問題是在臨床實踐中診斷的HD患兒均在出生后，此刻神經(jīng)嵴細(xì)胞分化成熟，3-1且此3-2類患兒病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結(jié)締組織的增生等細(xì)胞外基質(zhì)變化，單純的神經(jīng)嵴細(xì)胞移植一方面神經(jīng)嵴細(xì)胞來源受限，另一方面能否在體內(nèi)改造病變腸段的病理變化，仍需進一步研究。近年來干細(xì)胞的基因修飾治療開展較快，國外有人發(fā)現(xiàn)將表達神經(jīng)營養(yǎng)因子的神經(jīng)干細(xì)胞直接種植于受傷的腦組織中，能促進神經(jīng)功能的恢復(fù)。神經(jīng)干細(xì)胞在受到堿性成纖維細(xì)胞因子FGF-2和上皮細(xì)胞生長因子EGF刺激時可分化出神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，EGF可維持神經(jīng)干

14、細(xì)胞的生成，F(xiàn)GF-2對干細(xì)胞的分化起重要作用；有很多神經(jīng)因子如血小板生長因子，轉(zhuǎn)化生長因子等對神經(jīng)干細(xì)胞的分化起著協(xié)同作用。誘導(dǎo)分化劑維甲酸對神經(jīng)干細(xì)胞也有誘導(dǎo)分化作用3。對于HD病變腸段不僅有神經(jīng)節(jié)異常，尚有腸道平滑肌，結(jié)締組織的增生等變化的現(xiàn)象，我們注意到纖溶酶原激活因子PA能激活纖溶酶原，水解纖維蛋白，及細(xì)胞外基質(zhì)中的纖連蛋白(fibronectin, Fn)，層粘連蛋白laminin，Ln，基質(zhì)金屬蛋白酶matrix metalloproteinase enzyme, MMP能分解周圍組織細(xì)胞外基質(zhì)，如將PA，MMP的cDNA轉(zhuǎn)染修飾神經(jīng)干細(xì)胞將有可能對HD病變段的病理變化進行改造，

15、有利于神經(jīng)干細(xì)胞生長，發(fā)育。通過探索影響神經(jīng)干細(xì)胞移植，生長，分化的分子機制，結(jié)合基因工程技術(shù)，將可為神經(jīng)干細(xì)胞移植治療成功創(chuàng)造條件。鑒于神經(jīng)干細(xì)胞的多向分化潛能，在大腦，脊髓中的損傷修復(fù)研究中令人鼓舞的發(fā)現(xiàn)，自體造血干細(xì)胞等分化為神經(jīng)干細(xì)胞可能性的提出4 此將為神經(jīng)干細(xì)胞自體移植提供一個很好的來源，以及神經(jīng)干細(xì)胞目前被認(rèn)為是一種更優(yōu)于成纖維細(xì)胞的基因治療的載體細(xì)胞5，針對上面的問題我們提出如下假說：如同神經(jīng)干細(xì)胞移植在恢復(fù)受損大腦，脊髓神經(jīng)功能上具有良好的應(yīng)用前景一樣，通過各種人工方法修飾后，神經(jīng)干細(xì)胞移植有恢復(fù)HD 病變腸段的正常神經(jīng)支配的可能。細(xì)胞移植雖然已被認(rèn)為對于修復(fù)神經(jīng)組織是有效的

16、治療方法，但目前使用的細(xì)胞多取自胚胎，這樣一方面細(xì)胞來源有限，另一方面存在異體免疫排斥作用。神經(jīng)干細(xì)胞可以在體外大量增殖，但目前主要在海馬和室管膜下層發(fā)現(xiàn)有神經(jīng)干細(xì)胞分布，這樣造成了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難。骨髓中有兩類干細(xì)胞，即造血干細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞mesenchymal stem cell, MSC。前者的移植已成功用于臨床治療白血病，但其移植需要獲得足夠數(shù)量的造血干細(xì)胞，并且造血干細(xì)胞體外擴增存在困難。MSC易于從骨髓中別離，體外擴增簡單，長期培養(yǎng)過程中能保持多向分化潛能。近期美國學(xué)者Woodbury等在體外實驗中成功地將源于成年大鼠及人骨髓MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞, 并進而分化為神經(jīng)元6。此

17、研究結(jié)果很好地解決了神經(jīng)干細(xì)胞來源困難的問題，為今后神經(jīng)干細(xì)移植治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病打下了根底?？傊?，隨著當(dāng)今干細(xì)胞研究的深入，探索通過MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)小兒外科常見疾病先天性巨結(jié)腸癥正常神經(jīng)支配的方法具有重要現(xiàn)實性及可能性。美國時代周刊曾將人類胚胎干細(xì)胞ES細(xì)胞和胚胎生殖細(xì)胞EG 細(xì)胞建系研究成功列為20世紀(jì)末世界十大科技成就之首，并認(rèn)為ES細(xì)胞和人類基因組將同時成為新世紀(jì)最具開展和應(yīng)用前景的領(lǐng)域。由此激發(fā)了人們對ES細(xì)胞，骨髓干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞定向分化的研究。將MSC,神經(jīng)干細(xì)胞定向分化，移植的研究引入到HD這一小兒外科常見病的治療研究中，探索MSC，神經(jīng)干細(xì)胞克隆、定向分化、移植

18、對于HD治療方法，可為發(fā)育生物學(xué)積累珍貴的資料；采用細(xì)胞工程原理和方法，通過MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植重建HD病變段的正常神經(jīng)支配方法的研究成功，在臨床上將可以讓HD患兒免于手術(shù)，使HD的治療發(fā)生根本性的改觀。該課題的完成除能為兒童的健康成長做出巨大奉獻，并能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的開展，提高本地區(qū)小兒外科在國內(nèi)及國際上的地位，為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順利進行奉獻力量。參考文獻(1) 陳雷玲，胡廷澤，朗詩明，等。320例先天性巨結(jié)腸癥的診斷與治療分析。華西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2000，31(2)：274-27(2) Kathryn S. Embryonic stem cells used to rem

19、yelinate injured rat spinal cord neurons. Lancet, 2000, 355 (9218): 1890(3) McCaffery P, Drager UC. Regulation of retinioc acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine Growth Factor Rev. 2000, 11(3): 233-249(4) Natarajan D, Grigoriou M, Marcos-Gutierrez C

20、V, et al. Multipotential progenitors of themammalian enteric nervous system capable of colonizing aganglionic bowel in organ culture. Development, 1999,126:157-168(5) 劉平，盧亦成，朱誠。中樞神經(jīng)干細(xì)胞。中華神經(jīng)外科雜志。2000，163：196-198(6) Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, et al. Ault rat and human bone marrow stromal cell

21、s differentiate into neurons. J Neurosci Res, 2000, 61(4): 364-3703-3三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)： 探索建立針對先天性巨結(jié)腸癥的MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植治療方法。研究內(nèi)容： MSC的別離，體外克隆； MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 多種人工修飾條件下的神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型lethal spotted rat, ls/ls無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸段移植，定向分化； 鑒定神經(jīng)干細(xì)胞移植后HD動物模型的消化道神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及機能。擬解決的關(guān)鍵問題： MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化； 神經(jīng)干細(xì)胞的基因修飾； 神經(jīng)干細(xì)胞

22、移植，定向分化的分子機制。42. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法： 無血清培養(yǎng)，單細(xì)胞克隆技術(shù)； mRNA差異消減顯示技術(shù)； 原位雜交；RT-PCR，免疫組化技術(shù)，透射電鏡技術(shù)； 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。技術(shù)路線： 建立HD動物模型 MSC的別離及體外培養(yǎng)MSC向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)，克隆V-MYC，EGF等多種基因轉(zhuǎn)染，修飾神經(jīng)干細(xì)胞移植到HD動物無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段誘導(dǎo)分化維甲酸等 mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示神經(jīng)干細(xì)胞移植分化的分子機制 觀察無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)及功能獲得通過MSC、神經(jīng)干細(xì)胞移植對先天性巨結(jié)腸癥腸道神經(jīng)組織重建的方法5-15-2實驗方案

23、：第一局部：建立HD動物大鼠參照文獻進行大鼠選育，源于Wistar-Imamichi AR系，HD大鼠均結(jié)腸造瘺處理。第二局部：MSC別離培養(yǎng)，向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化1. MSC別離培養(yǎng) 切取鼠一側(cè)股骨，暴露骨髓腔，用注射器抽取細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/20%FBS，反復(fù)屢次沖洗出骨髓細(xì)胞，用吸管反復(fù)抽吸后，F(xiàn)icoll 別離液離心別離出有核細(xì)細(xì)胞，移入T-75培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)，第二日將懸浮細(xì)胞移去貼壁細(xì)胞為較純的基質(zhì)干細(xì)胞，3-4天更換培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞融合時用胰島素/EDTAtrypsin/EDTA處理，收獲貼壁細(xì)胞為MSC ( MSC鑒定選用CD29，CD90，CD106等標(biāo)記)。2. MSC向神經(jīng)干細(xì)

24、胞轉(zhuǎn)化 參照文獻在MSC培養(yǎng)液中參加脊索中胚層浸出液，脊索中胚層條件培養(yǎng)液，星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液，多種神經(jīng)生長因子等。3. 鑒定 A. 光鏡及電鏡下觀察轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)改變。B. 免疫組化或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)化后的外表標(biāo)志: nestin, 波形蛋白，RC抗原。第三局部：神經(jīng)干細(xì)胞別離提取，體外培養(yǎng)，基因轉(zhuǎn)染1. 神經(jīng)干細(xì)胞的別離和傳代 分別取鼠紋狀體和孕鼠皮層組織，吸管吹打機械別離制成單細(xì)胞懸液，利用DMEM/F12(1:1) 加B27及bFGF無血清培養(yǎng)基進行原代培養(yǎng)，具體參見文獻。2. 體外基因轉(zhuǎn)染 對于以上兩種來源的神經(jīng)干細(xì)胞采用脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將V-MYC，EGF，及FGF-2

25、，PA，MMP cDNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入神經(jīng)干細(xì)胞，包括雙基因及單基因轉(zhuǎn)染的多種形式。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCXE由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院分子生物學(xué)國家重點實驗室提供。E. coli質(zhì)粒DNA大量制備、純化和酶切參照Sambrook等的文獻方法進行；按LipofectamineTM試劑盒說明進行轉(zhuǎn)染實驗。第四局部：神經(jīng)干細(xì)胞在無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的移植，定向分化及檢測1. 神經(jīng)干細(xì)胞在HD動物模型體內(nèi)移植 按多種組合形式，利用毛細(xì)顯微注射器將經(jīng)多種形式基因轉(zhuǎn)染的神經(jīng)干細(xì)胞注射到HD無神經(jīng)5-3節(jié)細(xì)胞段；參考文獻報道進行，將注射細(xì)胞濃度定為0.5-1 cell/ 0.5ul。2. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞在HD

26、動物體內(nèi)的分化誘導(dǎo) 維甲酸等分化誘導(dǎo)劑處理，藥物濃度選擇參考文獻。3. 移植后的神經(jīng)干細(xì)胞對HD動物模型無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響檢測 A實驗動物的處理：將實驗組鼠包括對照組分別于不同時期斷頸處死，如移植后4周，16周，32周。取移植處腸組織進行檢測，分別按進行檢測的工程要求對樣本進行處理。光鏡及電鏡檢測移植處組織形態(tài)學(xué)變化。免疫組化技術(shù)：檢測神經(jīng)細(xì)胞特異性烯醇化酶NSE，-100，GAFP等表達。原位雜交，RT-PCR檢測：轉(zhuǎn)染基因的表達V-MYC，EGF等，原位雜交所需探針，RT-PCR引物可分別購自中山，GIBIC公司，按說明進行實驗操作。功能鑒定：直腸測壓技術(shù)，生物化學(xué)方法檢測r-

27、氨基丁酸，P物質(zhì)等的合成。4. 神經(jīng)干細(xì)胞移植，分化的分子機制 參照文獻利用mRNA差異消減顯示技術(shù)顯示以上多種形式神經(jīng)干細(xì)胞移植，分化的差異基因，進而進行分級分段克隆。A. 神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織RNA的純化：利用腸道組織的剝片技術(shù)獲取腸神經(jīng)組織，立即置放于液氮中，-70保存。氯仿法提取RNA，DNase I 處理，紫外分光度計定量測定。B. RT-PCR差異消減顯示：對分別將神經(jīng)干細(xì)胞移植處腸段及相同部位正常腸神經(jīng)組織別離擴增出cDNA，運用5、端帽子引物與3、端錨定引物，對cDNA進行大量擴增，正常腸神經(jīng)組織用生物素標(biāo)記的dATP和dNTPs進行PCR擴增，產(chǎn)物進行

28、消減雜交，用連親和素去除共有產(chǎn)物，剩下的產(chǎn)物由帶有a-32 PdATP的dNTPs進行PCR，在重復(fù)差異顯示，回收差異條帶并克隆。0.4ul RNA，1逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，15umol/L dNTP, 10umol/L簡并引物，65。C 5min，37。C溫育10min，加200U/ulMoMuLV反轉(zhuǎn)錄酶，37。C溫育50min，95。C 溫育5min，PCR，消減雜交，過柱子，PCR，消減雜交，TA克隆盒進行DNA克隆，按說明進行，及進行測序，基因鑒定等。5. 結(jié)合步驟3的檢測結(jié)果再進行神經(jīng)干細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)染 同第三部份的體外基因轉(zhuǎn)染。6. 獲得神經(jīng)干細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染，移植，分化，重建HD正常神經(jīng)支配

29、的方案 重復(fù)步驟1；2；3；4，反復(fù)調(diào)整。第五局部：統(tǒng)計分析各實驗組間的數(shù)據(jù)以 均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差表示，用F檢驗，t檢驗，多因素方差分析進行多組及組間統(tǒng)計學(xué)處理，P值小于0.05為差異顯著?？尚行苑治觯?1) MSC別離，體外培養(yǎng)，本課題組已經(jīng)完成。(2) 本課題組已前期進行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實驗，同時成功進行了體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的別離并獲得了國家自然科學(xué)基金支助編號30070382。(3) 神經(jīng)干細(xì)胞移植為當(dāng)今各國神經(jīng)細(xì)胞工程研究重點，大量的研究文獻報道了神經(jīng)干細(xì)胞別離，培養(yǎng)的方法。(4) 較其它一些干細(xì)胞研究不同，神經(jīng)干細(xì)胞有明確的免疫標(biāo)記。(5) 在臨床及研究中對大量先天性巨結(jié)腸癥進行了觀

30、察，有多篇相關(guān)文獻發(fā)表。(6) 課題組已成功進行了神經(jīng)干細(xì)胞的別離培養(yǎng)與鑒定，及成人骨髓MSC體外擴增和定向誘導(dǎo)分化為骨和軟骨細(xì)胞。5-43本工程的創(chuàng)新之處（1） 以往對神經(jīng)干細(xì)胞移植的研究主要局于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊髓損傷修復(fù)方面，雖然有類似于神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)嵴細(xì)胞修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如的文章報道，但神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)腸神經(jīng)節(jié)缺如尚未見報道。（2） 首次提出MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后，移植分化修復(fù)HD正常神經(jīng)支配可能。4. 年度研究方案及預(yù)測進展（1） 2002年1月2002年12月構(gòu)建HD動物模型及初步完成MSC別離，體外培養(yǎng)，及向神經(jīng)干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。（2） 2003年1月2003年12月完成神經(jīng)干細(xì)胞的

31、各種基因轉(zhuǎn)染實驗，初步完成HD動物模型的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測。（3） 2004年1月2004年6月進一步完成HD動物模型的無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞段的神經(jīng)干細(xì)胞注射及檢測，獲得MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞后移植分化重建HD正常神經(jīng)支配的方法。（4） 2004年6月2004年12月數(shù)據(jù)處理，完成論文。5. 預(yù)期研究成果以論文發(fā)表作為研究成果。6 四、研究根底1. 與本工程有關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績（1） 本工程的提出源于課題組對先天性巨結(jié)腸癥長期的臨床及根底研究，既往主要將注意力集中在手術(shù)方法的改良，病理生理學(xué)變化觀察上，已有多篇相關(guān)文章發(fā)表。（2） 本課題組對多個年齡組的正常個體及

32、先天性巨結(jié)腸癥患者進行了神經(jīng)節(jié)發(fā)育觀測，并對人巨細(xì)胞病毒與先天性巨結(jié)腸癥的關(guān)系進行了研究。（3） 對數(shù)百例先天性巨結(jié)腸癥患者進行了診治，有較豐富的臨床經(jīng)驗。（4） 已成功地建立了神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)。（5） 本課題組成員已進行了MSC轉(zhuǎn)化為神經(jīng)干細(xì)胞的實驗，并獲得了國家自然科學(xué)基金資助編號30070382。（6） 本課題組較熟練地掌握了基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，效果優(yōu)良。2. 已具備的實驗條件，尚缺少的實驗條件和擬解決的途徑包括利用國家重點實驗室和部門開放實驗室的方案與落實情況本研究室所在的重慶醫(yī)科大學(xué)兒科研究所為原四川省重點實驗室，現(xiàn)已重新評定為重慶直轄市重點實驗室，目前正在申報國家級及教育部重點實驗室，是

33、博士授權(quán)點并可培養(yǎng)博士后人員。有高級職稱人員100多人。兒科研究所專業(yè)門類齊全，技術(shù)力量雄厚，設(shè)備完善，具有包括中心實驗室在內(nèi)的涉及分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織病理學(xué)、生物化學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)以及急救醫(yī)學(xué)、小兒腫瘤實驗外科學(xué)等專業(yè)實驗室、研究室十余個，能承當(dāng)國家重點科研課題及博士后研究工作。多年來，已完成包括國家自然科學(xué)基金資助工程在內(nèi)的部、委、省、市級科研課題上百項，并獲多項各級獎勵。主要設(shè)備及實驗條件包括： 掃描、透射電鏡 高壓液相色譜儀 顯微成像系統(tǒng) 石蠟，冷凍，恒冷，超薄切片機 熒光，相差，倒置，自動照相顯微鏡 PCR儀7-1 細(xì)胞培養(yǎng)全套設(shè)備 熒光分光光度計 紫外分光光

34、度計 LKB 電泳儀器 低溫超速離心機 超低溫冰箱，低溫冰柜 超聲細(xì)胞粉碎儀 去離子水發(fā)生器 分子生物學(xué)實驗常用設(shè)備 動物實驗檢測維持設(shè)施 二氧化碳孵箱 其他輔助設(shè)備 其它本次實驗需要，但缺少的設(shè)備，如DNA測序分析儀等可通過測序公司解決或聯(lián)系國家干細(xì)胞研究重點實驗室解決。7-2 申請者和工程組主要成員的學(xué)歷和研究工作簡歷，近期已發(fā)表與本工程有關(guān)的主要論著目錄*和獲得學(xué)術(shù)獎勵情況及在本工程中承當(dāng)?shù)娜蝿?wù)；青年科學(xué)基金申請者還應(yīng)注明學(xué)位論文名稱及導(dǎo)師姓名與工作單位* 論文：作者題目刊名年份卷期頁碼 專著：作者書名出版者年份8-18-3五、經(jīng)費預(yù)算支 出 科 目金 額萬元計 算 根 據(jù) 及 理 由1

35、. 合 計21.31科研業(yè)務(wù)費3.5資料費0.5資料檢索及查新等學(xué)術(shù)交流費1.0發(fā)表論文等成果鑒定費2.02實驗材料費16.8實驗動物及飼養(yǎng)2.1Wistar-Imamichi AR系選育生物試劑及化學(xué)試劑3.5nestin，及V-MYC，EGF，F(xiàn)GF-2等 cDNA的構(gòu)建等多種消耗性材料費3.3引物合成2.3cDNA測序2.5多種生長因子 3.13工程組織費1.0 注: 預(yù)算支出科目按以下順序填寫: 1. 科研業(yè)務(wù)費 2. 實驗材料費 3. 儀器設(shè)備費 4. 實驗室改裝費 5. 協(xié)作費 6. 工程組織實施費。開支范圍詳見?國家自然科學(xué)基金資助工程財務(wù)管理方法?第二章。9 六、申請者正在承當(dāng)

36、的其它研究工程 攀登方案、863方案、攻關(guān)任務(wù)和各部委、省市任務(wù)等工程的名稱及編號、任務(wù)來源、起止年月、負(fù)責(zé)或參加以及與本申請工程的關(guān)系等情況七、申請者承當(dāng)負(fù)責(zé)或參加國家自然科學(xué)基金資助工程的情況批準(zhǔn)號工程名稱起止年月負(fù)責(zé)或參加進展或完成情況10 對申請者負(fù)責(zé)的前一個已結(jié)題科學(xué)基金資助工程工程名稱及批準(zhǔn)號完成情況，后繼研究進展及與本申請工程的關(guān)系加以詳細(xì)說明。另附該已結(jié)題工程?研究工作總結(jié)摘要?300字及已發(fā)表主要相關(guān)論文首頁復(fù)印件限三篇。 八、申請者承諾 我保證上述填報內(nèi)容的真實性。如果獲得資助，我與本工程組成員將嚴(yán)格遵守國家自然科學(xué)基金委員會的有關(guān)規(guī)定，切實保證研究工作時間，按方案認(rèn)真開展

37、研究工作，按時報送有關(guān)材料。 申請者簽章 年 月 日11 九、推薦意見 不具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的申請者，須有兩名具有高級專業(yè)技術(shù)職務(wù)的同行專家推薦。推薦時，請認(rèn)真負(fù)責(zé)地介紹申請者及其工程組成員的業(yè)務(wù)根底、研究能力、科研態(tài)度及研究條件等。工程組成員不能做推薦者 推薦者簽章 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位： 推薦者簽章 專業(yè)技術(shù)職務(wù) 專長 所在單位：12十、申請者所在單位及合作單位的審查與保證1. 申請者所在單位學(xué)術(shù)委員會的審查意見包括：對工程的意義、特色和創(chuàng)新之處及申請者的研究水平與學(xué)風(fēng)簽署具體意見先天性巨結(jié)腸癥是小兒外科常見疾病，既往對此類疾患均采用手術(shù)治療，手術(shù)方式較多，由于各種術(shù)式的固有缺陷

38、，目前仍存在各種并發(fā)癥。此疾病的發(fā)生是由于多種原因使胚胎期神經(jīng)嵴細(xì)胞在消化道移行受阻，結(jié)腸壁肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，病變結(jié)腸痙攣收縮，腸內(nèi)容物排出受阻，近端腸管繼發(fā)性擴張形成巨結(jié)腸。此工程結(jié)合當(dāng)今干細(xì)胞研究，將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞MSC,神經(jīng)干細(xì)胞定向分化、移植的研究引入到HD這一小兒外科常見病的治療研究中，探索MSC,神經(jīng)干細(xì)胞克隆，定向分化，移植對于HD治療方法，可為發(fā)育生物學(xué)積累珍貴的資料；采用細(xì)胞工程原理和方法，探討通過MSC，神經(jīng)干細(xì)胞移植重建HD病變段的正常神經(jīng)支配的途徑，該課題在臨床上將可以讓HD患兒免于手術(shù)，使HD的治療發(fā)生根本性的改觀；同時該課題的完成能帶動本地區(qū)整個小兒外科水平的開展

39、，提高本地區(qū)小兒外科在國內(nèi)及國際上的地位，為祖國西部大開發(fā)戰(zhàn)略的順利進行奉獻力量。申請者已獲得華西醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位，攻讀博士期間主要從事先天性巨結(jié)腸方面的研究。科研方面申請者已接受正規(guī)的科研訓(xùn)練，在科研設(shè)計、數(shù)據(jù)分析、撰寫論文，特別是對小兒外科常見病的研究具有堅實的根底，已完成關(guān)于相關(guān)文獻多篇。申請者工作嚴(yán)謹(jǐn)、認(rèn)真，思維敏捷，活潑在其研究領(lǐng)域的前沿，具備良好的科研素質(zhì)。申請者目前正在我單位進行博士后研究，已完成了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化等，對此研究的申請有很好的根底。此工程的提出源于申請者長期的臨床及科研工作積累，設(shè)計科學(xué)、合理，并具有明顯的創(chuàng)新性；課題組人員組成、結(jié)構(gòu)合理、技術(shù)力量雄厚，課題組所在的研究單位實驗條件好，同時已有初步實驗結(jié)果，已有前期國家自然科學(xué)基金的支助，具備完成此項