藥用植物金果欖織培養(yǎng)初探

1、藥用植物金果欖織培養(yǎng)初探作者:日期:藥用植物金果欖組織培養(yǎng)初探-農(nóng)學(xué)論文藥用植物金果欖組織培養(yǎng)初探潘麗梅1,馬小軍2,白隆華1,曾雯雯3,馮世鑫1,莫長明1（1.廣西藥用植物園，南寧530023;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京100193;3.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧530004）摘要：以金果欖（TinosporacapillipesGagnep.）幼嫩莖段為外植體，添加不同濃度的6甲基腺喋吟（6BA）、呷咪3丁酸（IBA）、蔡乙酸（NAA）、激動(dòng)素（KT）、赤霉素（GA）,研究不同培養(yǎng)基對金果欖試管苗誘導(dǎo)、增殖和生根的影響。結(jié)果表明，金果欖啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+1.

2、0mg/L6BA+0.5mg/LKT+0.1mg/L2,4D,腋芽誘導(dǎo)率達(dá)95.1%;增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LGA+0.2mg/LNAA,增殖系數(shù)達(dá)到16.1;生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg/LIBA+0.4mg/LNAA,30d時(shí)生根率為85.4%,10d后煉苗移栽到塘泥和河沙（3：1,體積比）的混合基質(zhì)中，30d后移栽成活率可達(dá)87.3%以上。關(guān)鍵詞：金果欖（TinosporacapillipesGagnep.）;莖段；組織培養(yǎng)；誘導(dǎo)；生根中圖分類號：S567.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號：04398114（2015）051232-03DOI:

3、10.14088/ki.issn0439-8114.2015.05.051收稿日期：2014-08-14基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃應(yīng)用基礎(chǔ)研究專項(xiàng)（桂科基0731038）作者簡介：潘麗梅（1982），女，廣西藤縣人，助理研究員，主要從事藥用植物組織培養(yǎng)研究，（電話）07715610462（電子信箱）p1imei2006;通信作者，馮世鑫，研究員，主要從事藥用植物栽培（電話）07715610462（電子信箱）shixinl996。金果欖（TinosporacapillipesGagnep.）為防己科青牛膽屬常綠纏繞藤本植物，主產(chǎn)于四川、湖南、廣西、湖北、貴州等地，具有清熱解毒、利咽止痛

4、的功效，主治咽喉月中痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脫腹熱痛等13。金果欖塊根含掌葉防己堿（Pa1nmt1ne）和咖倫賓（Colmtfifin）、巴馬汀、藥根堿、非洲防己堿、千金藤堿、蝙蝠葛堿和木蘭花堿4-6等成分，民間廣泛用于治療胃痛。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金果欖有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗月中瘤、降血糖、抗應(yīng)激及解毒等作用，又被喻為可替代抗生素的天然藥物5。由于長期采挖，金果欖野生資源日趨枯竭，人工種植和撫育勢在必行。另外，金果欖雌雄異株，授粉受到環(huán)境影響極大，自然結(jié)實(shí)率低。在資源調(diào)查和引種中發(fā)現(xiàn)，雄株遠(yuǎn)多于雌株（約50：1），結(jié)果機(jī)會(huì)大大減少，且種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率較低7。因此，種源缺乏是金

5、果欖資源銳減的主要原因。目前，金果欖桿插繁殖未獲得成功，而組織培養(yǎng)快速繁殖是現(xiàn)代生物技術(shù)，且在香蕉、羅漢果、石斛等作物上已取得成功8-10,并應(yīng)用于生產(chǎn)，但金果欖組培繁殖研究鮮見報(bào)道。利用MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度和不同種類的激素，在多種植物組織培養(yǎng)中已獲得成功。本試驗(yàn)以金果欖的幼嫩莖段為外植體進(jìn)行消毒，用不同類型植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對叢生芽進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖、生根培養(yǎng)，分析各種植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對金果欖組織培養(yǎng)的影響，從而為金果欖人工繁殖和大規(guī)模推廣栽培提供有利依據(jù)。1材料與方法1.1材料本試驗(yàn)以廣西藥用植物園科研固栽植的金果欖多年生幼嫩枝條為外植體材料。1.2方法1.2.1材料處理將生長旺

6、盛、無病蟲害的金果欖多年生幼嫩枝條剪下，剪成1.52.0cm長且?guī)а康那o段，放入0.1%的洗滌劑中浸泡810min,然后于自來水下沖洗20min,取出放入經(jīng)高壓滅菌的無菌水中潤洗2次。經(jīng)以上處理后，再將外植體放入75%的乙醇中消毒30s,然后放入0.1%的HgC12溶液中消毒7min,無菌水沖洗5次。用無菌濾紙吸干材料上的水分，選擇不變色、無褐化的莖段橫切成面積為0.8cmX1.2cm的帶芽小塊，供接種用。1.2.2培養(yǎng)方法1)啟動(dòng)培養(yǎng)。將經(jīng)過消毒處理的莖段分別接種在添加了不同組合、不同濃度生長激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行啟動(dòng)培養(yǎng)，生長素的類型及濃度為6-BA(0.5、1.0、1.5mg/L)、KT

7、(0.5、1.0、1.5mg/L)、2,4-D(0、0.1、1.5mg/L),每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種20瓶，3次重復(fù)，培養(yǎng)30d后觀察記錄誘導(dǎo)效果。2）增殖培養(yǎng)。將在啟動(dòng)培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出來的芽進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。|3 ）生根培養(yǎng)。將獲得的有效不定芽（株高1.52.0cm）接種于1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)20d后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，每個(gè)處理接種5株，3次重復(fù)，培養(yǎng)30d后統(tǒng)計(jì)生根情況。4 ）培養(yǎng)條件。所述培養(yǎng)基均為MS基本培養(yǎng)基（含26g/L蔗糖、5.0g/L瓊脂，pH5.8）,培養(yǎng)溫度為（25±2）C、光照時(shí)間為12h/d（日光燈，光照度

8、2000lx）。2結(jié)果與分析2.1金果欖莖段啟動(dòng)培養(yǎng)由表1可知，不同組合生長激素對金果欖莖段的啟動(dòng)培養(yǎng)效果不同，帶腋芽的莖段培養(yǎng)10d左右有不同程度的萌發(fā)，6BA和KT均能起到較好的誘導(dǎo)作用，當(dāng)6BA濃度為1.0mg/L,長丁濃度為0.5mg/L,2,4D濃度為0.1mg/L時(shí)，金果欖莖段誘導(dǎo)率達(dá)到95.1%,但當(dāng)6-BA濃度一定，KT和2,4-D濃度過高時(shí)，誘導(dǎo)的部分叢生芽出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。培養(yǎng)基中添加2,4D后，芽的長度明顯增長，但部分出現(xiàn)愈傷組織，說明6BA和KT為金果欖腋芽誘導(dǎo)的主要因素，而2,4D對腋芽的誘導(dǎo)作用不大，其主要作用在于愈傷組織的誘導(dǎo)。金果欖莖段腋芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+

9、1.0mg/L6BA+0.5mg/LKT+0.1mg/L2,4Do靖原+-自廠mi 23-mwvL琛號HtET堀/附>仲君 由謝芳 甫在才個(gè)陽 創(chuàng)q E才華忙療玩050K】呂139UariDDJ30112SK.El372£中tRB3.«速Q(mào)JikiW巾213加ijfitjftiU2£J1J32IAa鋁1112SSJIJiiJ3uMJk714他3IJEJDX*金11MJIJDJai醯3iy也丁才期佗野即L且出生玲眇bd助長生紀(jì).，工卜堂學(xué)廿國值生量林，、好小".|.屏.*世身用.梓AVHf嘲工立r#-* FF 中.市口*寓，2.2金果欖莖段增殖培養(yǎng)將

10、金果欖帶芽莖段接種于附加不同濃度的6-BA和一定濃度GA、NAA的MS培養(yǎng)基中,每個(gè)處理接種30瓶，每瓶接種3個(gè)莖段，經(jīng)過23周培養(yǎng)可形成大量叢生芽。結(jié)果表明（表2）,在4號培養(yǎng)基MS+0.5mg/L6BA+0.2mg/LGA+0.2mg/LNAA上，金果欖叢生芽增殖系數(shù)最大，達(dá)到16.1,芽生長狀況也較好，雖然5號培養(yǎng)基中叢生芽的生長狀況也良好，但其增殖系數(shù)比4號培養(yǎng)基低，且出現(xiàn)了少量的愈傷組織，而在不添加任何激素的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)，金果欖叢生芽增殖系數(shù)最低，且生長緩慢，叢生芽較細(xì)弱。a1吊隹姐堂鑫*昵他用量m相叢生尊有學(xué)的響.ff狀式"1MAIa-n4*2<LS0.2（Li

11、JG£L療暈怪#*土.工匿tinQQi（LISJdI.IJ號雪壯單色產(chǎn)力一增4V.202lbI£1.14才雷憶華當(dāng)七府用T才.通.叱少量甘油更酬珥E-0014彳叱彳叱XMBW2.3壯苗與生根將4號增殖培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出來的金果欖叢生芽接種到壯苗培養(yǎng)基（添加0.5g/L活性炭、0.1mg/LIBA）上進(jìn)行壯苗培養(yǎng)，20d左右苗可長粗、長壯，然后將長至35cm高的健壯試管苗接種于19號生根培養(yǎng)基中，20d左右，苗基部根原基突起；一個(gè)月后，從根原基上長出白色新根，每株生根410條，根長2.37.5cm。不同濃度的生長激素及其組合均能誘導(dǎo)組培苗生根，但不同生長激素及其組合誘導(dǎo)苗生根的表

12、現(xiàn)不同。如表3所示，只添加IBA的情況下，隨著IBA濃度的增加，金果欖叢生芽生根率提高，生根速度加快，與對照存在明顯差異，但根較細(xì)小，容易折斷，不利于移栽成活；只添加NAA的情況下，金果欖叢生芽生根雖比只加IBA的粗，但生根數(shù)減少；以NAA與IBA配合使用可提高金果欖生根率，其生根速度也加快，根粗，根數(shù)多，平均生根數(shù)最大為9.8±2.33。因此，綜合各項(xiàng)指標(biāo)，在誘導(dǎo)金果欖生根時(shí)，以3號生根培養(yǎng)基1/2MS+0.2mg/LIBA+0.4mg/LNAA為佳，接種后21d即開始生根，30d時(shí)生根率為85.4%,40d后可達(dá)95%以上。出*圭0城蛻變軍里鼻鼓.事咱用且k找本IE*XAJL3D

13、l2U幅ML?6.3x3J03-覃壽辛.葉叁口JSit-L3IkS2SSOL：例蟬皆注:*型京鼻1OJ：D星21.心工451frU.4flL91IJ10l4苫心UME靠也A*«SIS舊收伸077a30距工步I5帳Q收斜31T相理肝包Hi中IM4xJjff7小事窄小.葉聲2.4煉苗和移栽煉苗、移栽基質(zhì)和光照度對瓶苗移栽成活率都有很大影響，金果欖苗高約5cm時(shí)開始煉苗。移栽前先閉瓶煉苗6d,再將培養(yǎng)瓶蓋打開，放到全天自然光照，溫度25C的通風(fēng)條件下煉苗3d,移栽時(shí)用銀子將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗干凈根部培養(yǎng)基，放入添加了2mg/LNAA的無菌水中浸泡10min,移栽入已滅菌過的基質(zhì)中（塘

14、泥：河沙=3：1,體積比），移栽后710d用塑料薄膜保濕，上面再覆蓋一層報(bào)紙，保持光照度以遮光率為60%左右為宜，空氣濕度85%以上，每天噴霧1次，10d左右長出新根，移栽成活率達(dá)87.3%以上。3小結(jié)與討論金果欖啟動(dòng)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS+l.0mg/L6BA+0.5mg/LKT+0.1mg/L2,4D,其中6BA和KT為腋芽誘導(dǎo)的主要因素；金果欖莖段增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L6BA+0.2mg/LGA+0.2mg/LNAA,生根的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.2mg/LIBA+0.4mg/LNAA,接種21d后可開始生根，30d時(shí)生根率為85.4%,可邊煉苗邊生根，10d后移栽，

15、30d后移栽成活率可達(dá)87.3%以上。在金果欖繼代增殖試驗(yàn)中，在6-BA濃度一定的情況下，添加GA可大幅度提高芽的增殖系數(shù)；添加NAA對芽的增殖和芽體生長有一定的改善作用。6-BA雖是決定芽增殖系數(shù)的主要因素，但每一種植物都有合適自身分化和生長的濃度，濃度過高會(huì)抑制芽的分化和生長。組培苗生產(chǎn)的關(guān)鍵是瓶苗的移栽成活率，因?yàn)槠棵缭谂囵B(yǎng)室內(nèi)有人工提供的適宜溫度、豐富的養(yǎng)分和充足的水分，組培苗一旦脫離這些優(yōu)越的條件，接受外界自然生長環(huán)境，外界環(huán)境的溫度、濕度變化較大，因此移栽措施不當(dāng)就會(huì)造成組培苗的死亡11,12o而瓶內(nèi)生根能大大提高其移栽成活率，當(dāng)根長為1cm左右時(shí)移栽最佳。金果欖常規(guī)的繁殖方式多以

16、種子傳播為主，但其種子有明顯的休眠期，發(fā)芽率低，采用組織培養(yǎng)已成為其種苗繁育的重要途徑，因此提高組培苗的移栽成活率就顯得至關(guān)重要，該研究可為金果欖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論與技術(shù)支撐。參考文獻(xiàn)：1國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.2宋純清，徐任生，徐亞明.金果欖化學(xué)成分的研究I.新吠喃三菇金果欖昔的結(jié)構(gòu)J.化學(xué)學(xué)報(bào)，1988,46(10):1049-1052.3朱紅梅.金果欖的研究進(jìn)展J.中國民族民間醫(yī)藥雜志，2001,49:75-76.4郭幼瑩，林連波，符小文，等.海南青牛膽生物堿的研究J.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004,10(5):34-35.5馮世鑫，馬小軍，閆志剛，等.采收與加工對金果欖品質(zhì)的影響J.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,50(17):35973599.6馮世鑫，馬小軍，閆志剛，等.光照強(qiáng)度對金果欖光合特性和生長品質(zhì)的影響J.激光生物學(xué)報(bào)，2011,20(4):462-467.7史琪榮，譚策銘，周元川，等.中藥金果欖資源與生態(tài)研究初報(bào)J.中藥草，2006,29(2):1