DNA第一代,第二代,第三代測序的介紹

1、雙脫氧鏈終止法又稱為Sanger法原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核甘三磷酸（dNTP,其中的一種用放射性P32標記）存在條件下復制時，在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引入4種雙脫氧核甘三磷酸（ddNTP）,因為雙脫氧核昔沒有3'-OH,所以只要雙脫氧核甘摻入鏈的末端，該鏈就停止延長，若鏈端摻入單脫氧核甘，鏈就可以繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以各自的雙脫氧堿基為3'端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分4個泳道進行凝膠電泳，分離長短不一的核酸片段，長度相鄰的片段相差一個堿基。經(jīng)過放射自顯影后，根據(jù)片段3'端的雙脫氧核甘，便可依次閱讀合成片段的堿基排

2、列順序。Sanger法因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎上發(fā)展出多種DNA測序技術，其中最重要的是熒光自動測序技術。熒光自動測序技術熒光自動測序技術基于Sanger原理，用熒光標記代替同位素標記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了DNA測序的速度和準確性。20世紀80年代初Jorgenson和Lukacs提出了毛細管電泳技術（capillaryelectrophoresis）。1992年美國的Mathies實驗室首先提出陣列毛細管電泳（capillaryarrayelectrophoresis）新方法，并采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置，25只毛細管并列電泳，每只毛細管在1.5h內(nèi)可讀出3

3、50bp,DNA序列，分析效率可達6000bp/h。1995年Woolley研究組用該技術進行測序研究，使用四色熒光標記法，每個毛細管長3.5cM,在9min內(nèi)可讀取150個堿基，準確率約97%。目前，應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司（ABI）3730系列自動測序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術的DNA測序儀。如ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管，4種雙脫氧核甘酸的堿基分別用不同的熒光標記，在通過毛細管時不同長度的DNA片段上的4種熒光基團被激光激發(fā)，發(fā)出不同顏色的熒光，被CCD檢測系統(tǒng)識別，并直接翻譯成DNA序列。雜交測序技術雜交法測序是20世紀80年代末出現(xiàn)的一種測序方法，該方法不同于

4、化學降解法和Sanger法，而是利用DNA雜交原理，將一系列已知序列的單鏈寡核甘酸片段固定在基片上，把待測的DNA樣品片段變性后與其雜交，根據(jù)雜交情況排列出樣品的序列序檢測速度快，采用標準化的高密度寡核甘酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具有部分第二代測序技術的特點。但該方法誤差較大，且不能重復測定焦磷酸測序（pyrosequencing贖術是近年來發(fā)展起來的一種新的DNA序列分析技術，它通過核甘酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應，促使熒光素發(fā)光并進行檢測。既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核甘酸多態(tài)性（SNP）檢測及等位基因頻率測定等。1焦磷酸測序技術的原理及步驟焦磷酸測序

5、是由DNA聚合酶（DNApolymerase）、三磷酸腺甘硫酸化酶（ATPsulfurylase）、熒光素酶（1ueiferase和雙磷酸酶（apyrase）4種酶催化同一反應體系的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，反應底物為5'-磷酰硫酸（APS）和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加入1種dNTP,若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的焦磷酸基團（PPi）。硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP,后者驅(qū)動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉(zhuǎn)化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由PyrogramTM轉(zhuǎn)化為一個峰值，其高度與反應

6、中摻人的核甘酸數(shù)目成正比。根據(jù)加入dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核甘酸序列。在實驗過程中用a-硫化的三磷酸腺甘（dATPotS）代替三磷酸腺甘（dATP）以有效地被DNA聚合酶利用，而不被蟲熒光素識別。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解產(chǎn)物的濃度，近年來，單鏈DNA結合蛋白（singlestrandDNAbindingprotein,SSBP）和純化SpisomerdATPaS的使用dATPotS降解產(chǎn)物抑制雙磷酸酶活性的這一問題得到較好解決，使得測序長度可達100bp,拓展了該技術在遺羅氏454的GSFLX測序技術利用了焦磷酸測序原理，主要包括以下步驟：1）

7、文庫準備將基因組DNA打碎成300-800bp長的片段（若是snRNA或PCR產(chǎn)物可以直接進入下一步），在單鏈DNA的3'端和5'端分別連上不同的接頭。2）連接帶接頭的單鏈DNA被固定在DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶一個單鏈DNA片段。隨后擴增試劑將磁珠乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了許多只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應器。3）擴增每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增（乳液PCR）,從而排除了其它序列的競爭。整個DNA片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段而言，擴增產(chǎn)生幾百萬個相同的拷貝。乳液PCR終止后，擴增的片段仍然結合在磁珠上。4）測序攜帶DNA的捕

8、獲磁珠被放入PTP板中進行測序。PTP孔的直徑（29叩）只能容納一個磁珠（20叩）。放置在4個單獨的試劑瓶里的4種堿基，依!IT、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一個堿基。如果發(fā)生堿基配對，就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP硫酸化酶和熒光素酶的作用下，釋放出光信號，并實時地被儀器配置的高靈敏度CCD捕獲到。有一個堿基和測序模板進行配對，就會捕獲到一分子的光信號；由此一一對應，就可以準確、快速地確定待測模板的堿基序列與其它第二代測序平臺相比，454測序法的突出優(yōu)勢是較長的讀長，目前GSFLX測序系統(tǒng)的序列讀長已超過400bp。雖然454平臺的測序成本比其他新一代測序平臺要高很

9、多，但對于那些需要長讀長的應用，如從頭測序，它仍是最理想的選擇。Solexa測序技術Illumna公司的新一代測序儀GenomeAnalyzer最早由Solexa公司研發(fā)，利用合成測序（SequencingbySynthesis珀原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平行測序。GenomeAnalyzer技術的基本原理是將基因組DNA打碎成約100-200個堿基的小片段，在片段的兩個末端加上接頭（adapter）0將DNA片段變成單鏈后通過接頭與芯片表面的引物堿基互補而使一端被固定在芯片上。另外一端隨機和附近的另外一個引物互補，也被固定住，形成橋狀結構。通過30輪擴增反應，每個單分子被擴增大約100

10、0倍，成為單克隆的DNA簇，隨后將DNA簇線性化。在下一步合成反應中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的dNTP0在DNA合成時，每一個核甘酸加到引物末端時都會釋放出焦磷酸鹽，激發(fā)生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。用激光掃描反應板表面，在讀取每條模板序列第一輪反應所聚合上去的核甘酸種類后，將這些熒光基團化學切割，恢復3'端黏性，隨后添加第二個核甘酸。如此重復直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣，統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果，就可以得知每個模板DNA片段的序列GenomeAnalyzer系統(tǒng)需要的樣品量低至100ng,文庫構建過程簡單，減少了樣品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到2X

11、50bp,每次運行后可獲得超過20GB的高質(zhì)量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。SOLiD測序技術SOLiD全稱為SupportedOligoLigationDeletion,是ABI(應用生物系統(tǒng))公司于2007年底推出的全新測序技術，目前已發(fā)展到SOLiD3Plus。與454和Solexa的合成測序不同，SOLiD是通過連接反應進行測序的。具基本原理是以四色熒光標記的寡核甘酸進行多次連接合成，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：1)文庫準備SOLiD系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫(fragmentlibrary)或配對末端文庫(mate-pairedlibrar

12、y)0片段文庫就是將基因組DNA打斷，兩頭加上接頭，制成文庫。該文庫適用于轉(zhuǎn)錄組測序、RNA定量、miRNA研究、重測序、3',5'、甲基化分析及ChIP測序等。配對末端文庫是將基因組DNA打斷后，與中間接頭連接，環(huán)化，然后用EcoP15酶切，使中間接頭兩端各有27bp的堿基，最后加上兩端的接頭，形成文庫。該文庫適用于全基因組測序、SNP分析、結構重排及拷貝數(shù)分析等。2)擴增SOLiD用的是與454技術類似的乳液PCR對要測序的片段進行擴增。在微反應器中加入測序模板、PCR反應元件、微珠和引物，進行乳液PCR(emulsionPCR)。PCR反應結束后，磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目

13、巨大的同一DNA模板的擴增產(chǎn)物。3)微珠與玻片連接乳液PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠，微珠上的模板經(jīng)過3彳窗飾，可以與玻片共價結合。SOLiD系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。含有DNA模板的磁珠共價結合在SOLiD玻片表面，SOLiD測序反應就在SOLiD玻片表面進行。每個磁珠經(jīng)SOLiD測序后得到一條序列。4)連接測序SOLiD連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物。探針的5'端用4種顏色的熒光標記，探針3'端第1、2位堿基是ATCG4種堿基中的任何兩種堿基組成的堿基對，共16種堿基對，因此每種顏色對應著4種

14、堿基對。3-5位是隨機的3個堿基。6-8位是可以和任何堿基配對的特殊堿基。單向SOLiD測序包括5輪測序反應，每輪測序反應含有多次連接反應，得到原始顏色序列。SOLiD序列分析軟件根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿基序列轉(zhuǎn)換成顏色編碼序列，然后與SOLiD原始顏色序列進行比較。由于雙堿基編碼規(guī)則中一種顏色對應4種堿基對，前面堿基對的第二個堿基是后面堿基對的第一個堿基，所以一個錯誤顏色編碼就會引起連鎖的解碼錯誤，改變錯誤顏色編碼之后的所有堿基。SOLiD序列分析軟件可以對測序錯誤進行自動校正，最后解碼成原始序列。因為SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤

15、，提供內(nèi)在的校對功能，得到的原始堿基數(shù)據(jù)的準確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時的準確度可以達到99.999%,是目前新一代基因分析技術中準確度最高的。超高通量是SOLiD系統(tǒng)最突出的特點，目前SOLiD3單次運行可產(chǎn)生50GB的序列數(shù)據(jù)，相當于17倍人類基因組覆蓋度。表1三種第二代測序技術對比上市時間訓520072(X)7價格（萬美元.2007年）5)4559單次反應數(shù)據(jù)埴（G）042050讀長（bp）4X)50x250優(yōu)勢長讀長低測序成本，高性價比高通量.高準確度測序技術SULU454第二代測序技術的應用1）從頭測序（de-novosequencing）對于基因組未被測序過的生物，具基

16、因組測序需要從頭測序。由于受測序讀取長度的限制，新一代測序技術中只有454技術能獨立完成復雜基因組如真核生物基因組的從頭測序工作。Solexa和SOLiD技術只能完成簡單生物如細菌的基因組的從頭測序。在復雜基因組的從頭測序中，將Solxa/SOLiD與454技術或傳統(tǒng)的Sanger測序技術結合，分別利用它們的高通量和較長讀長的優(yōu)勢，可以大大降低測序成本，提高測序速度。2）重測序如果對照一個參考基因組，新一代測序技術可以短時間內(nèi)非常輕松的完成一個基因組的重測序3)SNP研究SNP全稱是SingleNucleotidePolymorphism,意即單核甘酸多態(tài)性,是指不同個體的基因組上單個核甘酸的變異，包括替換、缺失和插入。SNP是指變異頻率大于1%的單核甘酸變異，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關4)轉(zhuǎn)錄組及表達譜分析基因表達譜指細胞在特定的條件下表達的所有基因。以往的基因表達譜分析主要依靠基因芯片技術，該技術需要依賴已知的基因序列來設計探針，通過熒光標記和雜交，根據(jù)熒光的強度計算表達量的多少，誤差較大,而且無法檢測未知基因的表達量。第二代測序技術