結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)錄因子SnailmRNA和蛋白的表達(dá)及臨床意義

1、結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)錄因子SnaiIniRNA和蛋白的表達(dá)及臨床意義陸洪軍王淑秋劉振平任翊華【摘要】目的探討轉(zhuǎn)錄因子SnailmRXA和蛋白在結(jié)腸癌中的表達(dá)及臨床意義。方式別離采納RTPCR和Western印跡方式對(duì)68例結(jié)腸癌和20例正常結(jié)腸黏膜上皮組織進(jìn)行SnailmRXA及其蛋白檢測(cè)，分析該轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)腸癌臨床病理因素（年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、組織學(xué)分型、浸潤(rùn)深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期）的關(guān)系。結(jié)果在粘液癌（印戒細(xì)胞癌、粘液腺癌）、低分化、浸及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及處于DukesC+D期的結(jié)腸癌中，SnailmRNA及其蛋白表達(dá)明顯增高（P或，但與性別、年齡、腫瘤部位及大小

2、無(wú)關(guān)（P。結(jié)論Snail的表達(dá)與結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)；檢測(cè)SnailmRXA及其蛋白對(duì)大腸癌的診療有必然價(jià)值。【關(guān)鍵詞】結(jié)腸癌；Snail；侵襲；轉(zhuǎn)移在腫瘤的生物學(xué)行為中，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是最重要的特點(diǎn)，也是一些實(shí)質(zhì)性腫瘤難以治愈的緣故。盡管外科手術(shù)醫(yī)治、放射醫(yī)治和化學(xué)醫(yī)治日趨完善，但如何初期診斷，及時(shí)正確醫(yī)治，抑制惡性腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，提高患者的生存率己成為現(xiàn)今腫瘤防治的重要課題。研究證明，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymaltransitionEMT）是包括結(jié)腸癌在內(nèi)的許多腫瘤細(xì)胞取得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制。轉(zhuǎn)錄因子Snail通過(guò)與Ecadherin啟動(dòng)子區(qū)的E盒（Eb

3、ox）結(jié)合，下調(diào)Ecadherin的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，促使腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移（Do本文旨在探討轉(zhuǎn)錄因子Snail在結(jié)腸癌中的表達(dá)，以判定該轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用。1對(duì)象與方式對(duì)象2007年1月至2020年8月，在本院行根治性手術(shù)的大腸癌患者68例，男42例，女26例；年齡3275歲（中位年齡歲）；術(shù)中留取標(biāo)本。所有病例術(shù)前均未同意化療及放療。腫瘤部位：左半結(jié)腸38例、右半結(jié)腸30例；腫瘤大小：W5cm者48例、5cm者20例。組織學(xué)分型：乳頭狀腺癌4例，管狀腺癌48例，粘液腺癌11例，印戒細(xì)胞癌5例;分化程度：高分化腺癌24例,中分化腺癌30例，低分化腺癌14例；浸潤(rùn)深度：

4、未及漿膜層25例，浸及漿膜層43例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移18例，無(wú)轉(zhuǎn)移50例；Dukes分期：A期32例，B期20例，C期11例，D期5例。另取20例結(jié)腸癌正常腸段的腸黏膜（經(jīng)病理檢查無(wú)異樣）作對(duì)照。所用試劑為兔抗人Snail多克隆抗體（購(gòu)自SantaCruz公司）;逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（購(gòu)自Promega公司）；Trizol試劑（購(gòu)自美國(guó)寶生公司）。方式SnailmRNA檢測(cè)按Trizol試劑盒說(shuō)明提取總RNAo用紫外分光光度儀測(cè)定A260/A280,比值在之間，計(jì)算RNA含量。引物設(shè)計(jì)：（1）上游引物:5'AATCGGAAGCCTAACTACAG3'；下游引物：5'GGAA

5、CAGGCTGAAGTAGAG3'（擴(kuò)增加度320bp）。（2）GAPDH：上游引物：5'ACCACAGTCCATGCCATCAC3'；下游引物：5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA3,（擴(kuò)增加度452bp,為內(nèi)參照）。逆轉(zhuǎn)錄反映按試劑盒操作。RTPCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離檢測(cè)。Snail蛋白的檢測(cè)Western印跡法?？偟鞍滋崛。?搜集細(xì)胞，每孔加入100U1細(xì)胞裂解液（50mmol/LTrisHC1、150mmol/LNaCK5mmol/LEDTA1%NP4O、PMSF、2Ug/mlAprotinin、Ug/mlLeupeptin）,超聲破碎

6、，412000r/min離心5min,搜集上清液。細(xì)胞核蛋白提取：參照文獻(xiàn)方式（2,3）,略改動(dòng)。蛋白質(zhì)樣品與等體積2義上樣buffer混勻，煮沸5min,紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。按蛋白含量測(cè)定結(jié)果每孔上樣50Ug,%SDSPAGE分離樣品。低溫100V3h將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，用封鎖液（5%脫脂奶粉、3%BSA.%Tween20溶于PBS）室溫封鎖2h,將膜與溶于封鎖液中的一抗（兔抗人Snail多克隆抗體1：500）室溫孵育2h,PBS洗5minX3次，TBS洗5minX4次，將膜與溶于二抗稀釋液（5%脫脂奶粉、%Tween20、150mmol/LNaCK50mmol/LTrisHC

7、1,中的二抗室溫孵育1h,TBS洗5minX4次，將膜裝入可熱接封的塑料袋中，加入ECL試劑，暗室曝光、顯影、定影，對(duì)X光底片拍照保留。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置所有數(shù)據(jù)均采納x±s表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。各組SnailmRNA相對(duì)水平經(jīng)方差齊性查驗(yàn)后采納Studentt查驗(yàn)。2結(jié)果結(jié)腸癌組織SnailmRNA表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系SnailmRNA在結(jié)腸癌中的表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位及大小無(wú)關(guān)（P>,而與腫瘤浸潤(rùn)深度、組織學(xué)分型、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes分期均有關(guān)。SnailmRNA在粘液癌（印成細(xì)胞癌、粘液腺癌）、低分化、浸及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及處于DukesC+

8、D期的結(jié)腸癌組織中表達(dá)均明顯增高（P,P。Snail與結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。見(jiàn)表1。表1結(jié)腸癌組織SnailmRXA表達(dá)指數(shù)與臨床病理因素間的關(guān)系（略）結(jié)腸癌和癌旁組織SnailmRXA及其蛋白的表達(dá)結(jié)腸癌組織與癌旁正常腸黏膜組織中均有SnailmRNA表達(dá),但與正常結(jié)腸上皮相較較，結(jié)腸癌SnailmRNA的表達(dá)升高（PV。見(jiàn)表2和圖lo結(jié)腸癌SnailP30條帶較正常對(duì)照組加寬加深，應(yīng)用ChenImage軟件計(jì)算蛋白平均灰度值，結(jié)果顯示Snail蛋白表達(dá)與正常結(jié)腸上皮相較較，有顯著不同（P。見(jiàn)表2和圖2。表2結(jié)腸癌和癌旁正常腸黏膜組織中SnailmRNA及其蛋白的表達(dá)（略）3討

9、論EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，是許多腫瘤細(xì)胞取得侵襲、轉(zhuǎn)移能力的重要機(jī)制（4）。EMT在個(gè)體胚胎發(fā)育、組織形成、傷口愈合和慢性炎癥中，均發(fā)揮著重要作用（5）。研究證明，Snail參與了包括乳腺癌、胃癌和鱗狀上皮細(xì)胞癌在內(nèi)的某些腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT并增進(jìn)其侵襲轉(zhuǎn)移（68）。Snail可使細(xì)胞E鈣黏素及a、B、Y連環(huán)素等上皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)降低或消失，可表達(dá)到纖維細(xì)胞特異性蛋白一、N連環(huán)素等多種間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白，且可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在必然條件下逆轉(zhuǎn)EMT表型時(shí)，就能夠夠降低腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力并延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物的生存期。Snail通過(guò)以下機(jī)制引發(fā)腫瘤侵

10、襲轉(zhuǎn)移:作用于啟動(dòng)子上的Eboxes連接基序，直接抑制Ecadherin、claudins、occludins等上皮黏附位點(diǎn)成份的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞間黏附紊亂；抑制ABLIM1、EPLIN等細(xì)胞骨架成份表達(dá)，使細(xì)胞骨架重組；增進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)，降解基質(zhì)以增進(jìn)細(xì)胞侵襲。研究證明，Snail引發(fā)的EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，但不是惟一的，免疫抑制也起著必然作用。本研究說(shuō)明：(1)結(jié)腸癌組織和癌旁正常組織SnailmRNA及其蛋白表達(dá)間存在不同：結(jié)腸癌組織SnailmRNA及其蛋白表達(dá)增加，提示Snail的高表達(dá)是結(jié)腸癌的發(fā)生、進(jìn)展進(jìn)程中的重要事件。(2)SnailmRXA及其蛋白的表達(dá)與組織

11、學(xué)類型、分化程度、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Dukes分期均有關(guān)：在粘液癌、低分化、侵及漿膜、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和處于DukesC+D期的結(jié)腸癌中SnailmRXA及其蛋白表達(dá)明顯升高，一樣提示Snail的表達(dá)增加能夠評(píng)判結(jié)腸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ShirakiharaT,SaitohM,MiyazonoregulationofepithelialandmesenchymalmarkersbydeltaEFlproteinsinepithelialmesenchymaltransitioninducedbyTGFbeta(J).MolBiolCell,2007;18(9)：353344.2

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