EGFRvⅢ胞外段修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo)CTL細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的作用VIP

1、EGFRv 胞外段修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo) CTL細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞的作用目的研究表皮生長(zhǎng)因子受體型突變體 (EGFR v) 胞外段修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo) CTL細(xì)胞對(duì) EGFR v陽(yáng)性的胃癌 7901細(xì)胞的殺傷作用 , 初步探討其作用機(jī)制。方法構(gòu)建表達(dá) EGFR v的慢病毒 , 應(yīng)用熒光定量法測(cè)定其滴度 , 采用密度梯度離心法從人外周血中分離 T 淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞 , 利用細(xì)胞因子 rhIL-4(100ng/ml),rh GM-CSF(100ng/ml) 及 rh TNF-a(50ng/ml) 誘導(dǎo)單核細(xì)胞向樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)分化, 通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)樹(shù)突狀細(xì)胞表面抗原CD80,CD83,HLA-DR

2、驗(yàn)證 DC的成熟, 用含有 EGFR v的慢病毒轉(zhuǎn)染 DC,應(yīng)用Western-blot 測(cè)定 EGFRv 在 DC的表達(dá), 用 ELISA法, 檢測(cè)上清中的 IL-10 和IFN- 分泌量?？瞻?DC,EGFRv 慢病毒感染的樹(shù)突狀細(xì)胞、陰性對(duì)照的樹(shù)突狀細(xì)胞與 T 淋巴細(xì)胞按照 1:5,1:10,1:20,1:40 共培養(yǎng),72h 后加入 CCK-8,放入 37的二氧化碳的培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 小時(shí), 之后顯微鏡下觀察 , 然后用酶標(biāo)儀檢測(cè)加入 CCK-8后, 在波長(zhǎng)為 450nm的情況下每組混合細(xì)胞培養(yǎng)后的上清液的的吸收值 , 將從成人外周血中培養(yǎng)的 T 淋巴細(xì)胞分別與空白 DC,EGFRv 慢

3、病毒感染的樹(shù)突狀細(xì)胞、陰性對(duì)照的樹(shù)突狀細(xì)胞在 37共培養(yǎng)( 刺激細(xì)胞/ 效應(yīng)細(xì)胞=1:20) 收集細(xì)胞培養(yǎng)的上清, 取傳代后的 SGC7901細(xì)胞和 SGC7901-v做為靶細(xì)胞 , 按不同比例的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的比例 (1:5,1:10,1:20,1:40) 加入不同組的 T 細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng) 24 小時(shí),MTT法測(cè)定殺傷情況。以上所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù) 3 次。結(jié)果 1、利用密度梯度離心法和細(xì)胞因子誘導(dǎo)法成功培養(yǎng)出了成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞和 T 淋巴細(xì)胞。 2、未加入 TNF-a 的樹(shù)突狀細(xì)胞 CD80,CD83,HLA-DR表達(dá)率為:35.5%,25.1%,33.2%, 加入 TNF-a 的CD80,

4、HLA-DR表達(dá)率為:82.7%,69.6%,感染 EGFR v的樹(shù)突狀細(xì)胞 CD-80,HLA-DR-APC表達(dá)率為 :86.3%,76.0% 。3、慢病毒攜帶目的基因 EGFRv 感染樹(shù)突狀細(xì)胞 ,Western Blot 檢測(cè) EGFRv蛋白結(jié)果顯示感染過(guò)的 DC對(duì)EGFRv的表達(dá)率為 58%。4、顯微鏡下觀察攜帶目的基因 EGFR v的慢病毒感染樹(shù)突狀細(xì)胞可獲得較高的感染率 , 達(dá) 60%。5、感染 EGFRv的 DC與自身 T 淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng) , 可刺激 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的具有抗腫瘤活性的細(xì)胞因子 IL-10 及 INF-r, 且呈劑量依賴性。 6、同等條件下 EGFRv 胞外段修飾樹(shù)突狀細(xì)胞誘導(dǎo) CTL細(xì)胞對(duì) EGFRv 陽(yáng)性胃癌 7901細(xì)胞的殺傷作用更強(qiáng)。結(jié)論 1、從人外周血通過(guò)密度梯度離心及細(xì)胞因子刺激法可獲取高純度的 T淋巴細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞 ,TNF-a 是促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟的關(guān)鍵。 2、樹(shù)突狀細(xì)胞刺激 T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生具有殺傷活性的細(xì)胞因子 IL-10 及 INF-r, 可殺傷胃癌