南師大蛋清中提取溶菌酶實驗

1、蛋清中提取溶菌酶南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 姓名：穆旭 學(xué)號：09130333摘要：本實驗通過離子交換層析提取蛋清中的溶菌酶，掌握靜態(tài)和動態(tài)離子交換的方法；和從生物材料中提取活性蛋白質(zhì)方法，并用超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶，掌握超濾分離技術(shù)的原理和操作。并且用SDS-PAGE檢測溶菌酶的純度和含量，從而掌握SDSPAGE的原理和操作。關(guān)鍵詞：溶菌酶，柱層析，離子交換樹脂，超濾，鹽析，SDS-PAGE研究材料與實驗方法1.柱層析前的準(zhǔn)備工作實驗材料：樹脂：724型陽離子交換樹脂、層析柱：1.6cm×30cm、溶液：0.1M NaOH，0.1M HCl、其他材料：布氏漏斗，抽濾瓶，鐵架

2、臺，恒流泵，核酸蛋白檢測儀等。1.1預(yù)處理724型陽離子交換樹脂堿酸堿的方法（Na型），每次用0.1N NaOH或者0.1N HCl溶液（體積約為樹脂的23倍）浸泡樹脂1015min后，都要用蒸餾水將堿液、酸液沖洗掉。1.2裝填離子交換層析柱（重力沉降法）固定層析柱，保持層析柱垂直；將蒸餾水倒入層析柱中，以排出管道中的空氣，當(dāng)蒸餾水高度約為層析柱高的一半時，將層析柱下端的塑料管夾緊；用玻璃棒將樹脂攪拌均勻，倒入層析柱內(nèi)，松開下端的塑料管，樹脂自然沉降，最后保持蒸餾水面高于樹脂表面約2cm。1.3配制0.1M磷酸鈉緩沖液pH7.0先配制 1M Na2HPO4 57.7mL，1M NaH2PO4

3、42.3mL將兩者混合后稀釋至1000mL，裝于試劑瓶中。1.4平衡離子交換樹脂0.1M磷酸鈉緩沖液恒速緩慢流經(jīng)樹脂，直至流出液的pH值與緩沖液相同，平衡結(jié)束。2.柱層析法提取溶菌酶實驗材料：起始緩沖液：0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）洗脫液：50mM NaCl溶液200mL（溶劑：起始緩沖液）、500mM NaCl溶液150mL（溶劑：起始緩沖液）再生溶液：0.5M NaOH溶液儀器：磁力攪拌器等其他材料：新鮮雞蛋2.1樣品的預(yù)處理取2個新鮮雞蛋，在其一端敲一個小洞，收集蛋清，加入約其體積1.5倍的起始緩沖液，攪拌均勻，用4層紗布過濾除去不溶性物質(zhì)，檢查其pH值是否為7.0，否則用0.5

4、M酸、堿調(diào)節(jié)。2.2靜態(tài)吸附和洗滌靜態(tài)吸附溶菌酶：傾出層析柱中平衡好的樹脂，傾去多余平衡緩沖液，將蛋清溶液倒入樹脂中，在磁力攪拌器上輕輕攪拌，室溫下攪拌吸附約45min，注意攪拌速度（勿起大量泡沫、勿打破樹脂）。吸附結(jié)束，吸取 200L上清于dorf管中、4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“1”），傾倒上清。洗滌雜質(zhì)：取與樹脂體積相當(dāng)?shù)钠鹗季彌_液攪拌洗滌樹脂約5min，重復(fù)2次，每次洗滌后，吸取 200L 洗滌液于 dorf管中、4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“2”“3”），傾去洗滌液。2.3動態(tài)洗脫用少量起始緩沖液將樹脂調(diào)勻，重新裝填層析柱，裝填結(jié)束后，用起始緩沖液（用滴管沿層析柱內(nèi)壁緩緩加入，勿沖擊樹脂面，高度約2c

5、m即可）封閉樹脂面，將層析系統(tǒng)組裝好，核酸蛋白檢測儀調(diào)基線（T檔調(diào)“100”，A檔調(diào)“0”），開始用 50mM NaCl洗脫液恒速洗脫雜質(zhì)。（流速約23mL/min)。洗脫雜蛋白：洗脫開始，即計時，然后每隔2min，記錄下吸光值和電導(dǎo)率值（使用LP層析系統(tǒng)的同學(xué)記錄電導(dǎo)率值），當(dāng)洗脫峰結(jié)束（流出液的吸光值從開始上升到下降，直至平穩(wěn)），洗脫完成。在洗脫峰吸光值最大處收集少量洗脫液于 dorf管中，標(biāo)記“4”）收集溶菌酶：更換 500mM NaCl洗脫液，同樣記錄，同樣在吸光值最大處收集少量洗脫液于dorf管中，標(biāo)記“5”），不同的是，此時是溶菌酶的洗脫峰，所以整個洗脫峰要收集于燒杯中，4度保存。

6、2.4再生樹脂、洗滌管道、繪制層析圖譜用0.5M NaOH溶液（約1倍柱床體積）洗滌樹脂，然后用蒸餾水將堿液沖洗干凈，樹脂回收于燒杯中，浸泡于蒸餾水中，保鮮膜蒙好，室溫放置。管道系統(tǒng)連接好，用約100mL 70%乙醇沖洗管道，沖洗層析柱。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制層析圖譜，使用LP層析系統(tǒng)的同學(xué)，分別以吸光值和電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)。3.超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶實驗材料：溶液：0.5M NaOH溶液透析緩沖液：0.1M磷酸鈉緩沖液（pH7.0）其他材料：透析袋（800010000Da），超濾膜（30kD），固體硫酸銨，研缽，搗杵等。3.1超濾分離（四組同學(xué)的溶菌酶洗脫液合并超濾）將溶

7、菌酶洗脫液以合適的流速經(jīng)過超濾膜（進(jìn)口壓力不超過2.0bar），收集透過液，回流液（吸取200L于dorf管中，標(biāo)記為“6”），當(dāng)透過液與回流液體積比約為3:1時，超濾可結(jié)束。3.2鹽析在透過液中加入研細(xì)的固體硫酸銨粉末（邊攪拌邊加入），硫酸銨的終濃度為35（即100mL 溶液中 35g 硫酸銨），室溫下靜置約2030min，4度、10000rpm、20min。3.3透析除鹽取少量 0.1M 磷酸鈉緩沖液（pH7.0）溶解沉淀，裝入透析袋中，置于適量的0.1M 磷酸鈉緩沖液室溫下攪拌透析過夜，次日更換緩沖液繼續(xù)透析24h。透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶菌酶樣品裝入離心管中，4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“7”

8、）。4.SDS-PAGE檢測溶菌酶的純度和含量實驗材料：制膠的試劑：30膠貯存液：丙烯酰胺（Acr）：甲叉雙丙烯酰胺（Bis) 29：1 避光保存 神經(jīng)毒 加速劑：四甲基乙二胺（TEMED）劇毒催化劑：10過硫酸銨（AP ）新鮮配制變性劑：10SDS 室溫保存緩沖液：2×樣品緩沖液： 100mmol/L Tris-HCl 4%SDS 0.2%溴酚藍(lán) 20%甘油 200 mmol/L-巰基乙醇 pH6.8凝膠緩沖液：1.5M Tris-HCl pH 8.8，0.5M Tris-HCl pH6.810×電泳緩沖液：250mmol/L Tris-HCl 2.5 mmol/L 甘氨

9、酸 1% SDS pH8.3 4度保存染色液：考馬氏亮藍(lán) R250 染色液儀器：垂直電泳系統(tǒng)4.1配制分離膠12各種溶液在潔凈干燥的燒杯中混合均勻，勿使膠液產(chǎn)生大量氣泡，迅速沿玻璃板邊緣加入膠液，至短板約2/3高處，灌注膠液時避免混入氣泡，迅速加入去離子水至短板頂端，覆蓋住膠面，待凝膠聚合，倒去水層，并用濾紙將水分吸干。4.2配制濃縮膠5迅速沿玻璃板邊緣加入膠液至接近頂部，斜插入“梳子”，確?！笆猃X”底端無氣泡，和“梳子”水平。4.3加入1×電泳緩沖液加入約200mL 1×電泳緩沖液，使凝膠上、下端都浸泡在電泳緩沖液中，并且內(nèi)槽緩沖液高于外槽；確保加樣孔內(nèi)無無氣泡，以保證電

10、流暢通。4.4制備樣品（1）將15L樣品與15L 2×樣品緩沖液在dorf管中混合均勻，100度煮沸5min，8000rpm 離心 5min；（2）樣品（從左至右）蛋白質(zhì) Marker（10L，不加2×樣品緩沖液，煮沸，離心）標(biāo)記“1”（吸附后的上清液）標(biāo)記“2”（洗滌后的上清液）標(biāo)記“3”（50mM NaCl洗脫峰） 標(biāo)記“4”（500mM NaCl洗脫峰）標(biāo)記“5”（超濾回流液）標(biāo)記“6”（透析除鹽后的溶菌酶樣品）蛋白質(zhì) Marker（10L，不加2×樣品緩沖液，煮沸，離心）加樣：用移液槍緩慢地加入 30L 樣品于樣品孔中，讓樣品沉于樣品孔內(nèi)，避免加入氣泡。4

11、.5電泳（1）恒壓電泳 100V；（2）當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部約0.5cm處，停止電泳；（3）小心剝離凝膠，將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán) R250染液中，浸泡過夜；（4）第二天回收染色液，用脫色液均勻脫去凝膠上的剩余染液。注意事項：染色和脫色都應(yīng)該均勻，所以如果條件允許，應(yīng)在脫色搖床上進(jìn)行。4.6馬氏亮藍(lán)R250染色原理：考馬氏亮藍(lán)R250通過范德華力與蛋白質(zhì)結(jié)合，適用于蛋白質(zhì)電泳微量蛋白質(zhì)染色，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度超過一定范圍時，對其染色不符合Beer定律，不適合作定量分析。靈敏度：每一條蛋白質(zhì)條帶最低質(zhì)量為0.1g。實驗結(jié)果與分析1.柱層析前的準(zhǔn)備工作經(jīng)堿酸堿的方法（Na型）預(yù)處理724型陽離子交換樹脂后

12、進(jìn)行裝柱，然后用配制的0.1M磷酸鈉緩沖液平衡離子交換樹脂，經(jīng)1L磷酸鈉緩沖液的平衡之后，樹脂仍沒有平衡完全，流出來的緩沖液的pH仍過堿。討論：可能由于在堿酸堿預(yù)處理過程中洗滌堿液不完全，造成樹脂平衡緩慢。所以配制新的緩沖液繼續(xù)進(jìn)行平衡樹脂操作，經(jīng)約500ml緩沖液流過后。樹脂平衡完全，可進(jìn)行下步操作。2.柱層析法提取溶菌酶按照實驗步驟進(jìn)行溶菌酶的靜態(tài)吸附和雜質(zhì)洗滌后，按實驗步驟進(jìn)行動態(tài)洗脫操作。得到63組實驗數(shù)據(jù)。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制層析圖譜。如下：通過層析圖譜可知，在22分鐘起進(jìn)入溶菌酶洗脫峰，收集洗脫出來的溶菌酶。4度保存。3.超濾法分離溶菌酶和鹽析濃縮溶菌酶提取出的粗溶菌酶經(jīng)過超濾分離、鹽析、透析除鹽等操作，透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)的溶菌酶樣品裝入離心管中，4度保存?zhèn)溆茫?biāo)記“7”）。4.SDS-PAGE檢測溶菌酶的純度和含量保存的各管樣品經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、馬氏亮藍(lán)R250染色后進(jìn)