甘油管冷凍保藏方法收集

1、§菌種管由傳統(tǒng)的玻璃菌種管改為帶蓋塑料離心管。方法：將塑料離心管置耐高壓塑料離心管盒內(nèi)并用雙層報(bào)紙包好，高壓蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80c烤干。在凈化工作臺(tái)內(nèi)將脫脂牛奶洗下的濃厚菌懸液用長毛細(xì)玻璃滴管加到塑料離 心管的底部，每只左右，切記不要將牛奶污染離心管口。將加好菌液的離心管盒置-20C冰箱預(yù)凍，預(yù)凍好后把離心管盒放置到冷凍干 燥機(jī)干燥箱內(nèi)凍干。凍干后在凈化工作臺(tái)內(nèi)壓好離心管蓋， 不抽真空。貼標(biāo)簽，用封口膜封離心管 口。放-20C冰箱保存。§該改良法優(yōu)點(diǎn)有：操作過程大大簡化，菌種管口不需溶封，不抽真空。菌種管抗破損性極佳；菌種管體積超小。成本低廉，易于商品化生產(chǎn)

2、、推廣。筆者使用該改良法近七年，本省發(fā)放菌種上萬只沒有破損情況出現(xiàn)；數(shù)次發(fā)放嗜血桿菌、鏈球菌、奈瑟氏菌等苛養(yǎng)菌，生長情況良好。近幾年我們還向華東地區(qū) 部分兄弟省分提供了室間質(zhì)評(píng)菌種四萬余只，效果滿意。實(shí)驗(yàn)一一微生物菌種常規(guī)保藏方法錄入時(shí)間：2011-4-13 9:30:37 來源：天津農(nóng)學(xué)院精品課程菌種是一種重要的生物資源，菌種保藏是重要的微生物基礎(chǔ)工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、 不衰、不變，以便于研究與應(yīng)用。1 目的了解菌種保藏的基本原理掌握幾種常用的菌種保藏方法。2 原理菌種保藏的方法很多。 其原理卻大同小異， 不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng)造一個(gè)適合長期休眠的環(huán)境, 即干燥、 低溫、缺乏

3、氧氣和養(yǎng)料等。使微生物的代謝活動(dòng)處于最低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達(dá)到保藏的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求，應(yīng)該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜面保藏、半固體穿刺 , 石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易制作。3 材料菌株待保藏的適齡菌株斜面培養(yǎng)基肉湯蛋白胨斜面，半固體及液體培養(yǎng)基。試劑10%HC比水氯化鈣、石蠟油、五氧化二磷。器具用于菌種保藏的小試管（10*100 毫米 ） 數(shù)支、 5 毫升無菌吸管、 l 毫升無菌吸管等、滅菌鍋、真空泵、干燥器、冰箱無菌水、篩子（40 目、120 目 ） 、標(biāo)簽、接種針、接種環(huán)、棉花、牛角匙等等。4 流程斜面保藏-半固體穿刺保藏-石蠟油封存-砂

4、土管保藏5 步驟斜面保藏5.1.1 流程標(biāo)記試管-接種-培養(yǎng)-保藏5.1.2 步驟5.1.2.1 貼標(biāo)簽取無菌的肉湯蛋白胨斜面數(shù)支。在斜面的正上方距離試管口2-3 厘米處貼上標(biāo)簽。在標(biāo)簽紙上寫明接種的細(xì)菌菌名、培養(yǎng)基名稱和接種日期。5.1.2.2 斜面接種將待保藏的細(xì)菌用接種環(huán)以無菌操作在斜面上作劃線接種。5.1.2.3 培養(yǎng)置 37 恒溫箱中培養(yǎng)48 小時(shí)。5.1.2.4 保藏斜面長好后，直接放入4的冰箱中保藏。這種方法一船可保藏三個(gè)月至半年。半固體穿刺保藏5.2.1 流程標(biāo)記試管-穿刺接種-培養(yǎng)-保藏5.2.2 步驟5.2.2.1 貼標(biāo)簽取無菌的半固體肉湯蛋白等直立柱數(shù)支，貼上標(biāo)簽，注明細(xì)

5、菌菌名、培養(yǎng)基名稱和接種日期。5.2.2.2 穿刺接種用接種針以無菌方式從待保藏的細(xì)菌斜面上挑取菌種，朝直立柱中央直刺至試管底部，然后又沿原線拉出。5.2.2.3 培養(yǎng)置 37 恒溫箱中培養(yǎng)48 小時(shí)。5.2.4 保藏半固體直立柱長好以后，放入4的冰箱中保藏。這種方法一般可保藏半年至一年。石蠟油封存5.3.1 流程標(biāo)記試管-接種-培養(yǎng)-加石蠟油-保藏5.3.2 步驟5.3.1 標(biāo)記5.3.2 接種 同 5.1.2.25.3.3 培養(yǎng)同 5.1.2.35.3.4 加石蠟油無菌操作下將5 毫升石蠟油到培養(yǎng)好的菌種上面，加入的量以超過斜面或直立柱 1 厘米高為宜。5.3.5 保藏：石蠟油封存以后，同

6、樣放入4冰箱中保存。也可直接放在低溫干燥處保藏。這種方法保藏期一般為一至二年。砂土管保藏5.4.1 流程制沙土管-滅菌-制菌液-加樣-干燥-保藏5.4.2 步驟5.4.2.1 制作沙土管選取過 40 目篩的黃砂，酸洗，再水洗至中性，烘干備用；過 120 目篩子的黃土備用；按1 份土加 4 份砂的比例均勻混合后，裝入小試管，裝量1 厘米左右。5.4.2.2 滅菌加壓蒸汽滅菌，直至檢測無菌為止。5.4.2.3 制備菌液取 3 毫升無菌水至待保藏的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕刮下菌苔。震蕩制成菌懸液。5.4.2.4 加樣用 1 毫升吸管吸取上述懸液毫升至砂土管，再用接種環(huán)拌勻。5.4.2.5 干燥把裝好

7、菌液的砂土管放入干燥器或同時(shí)用真空泵連續(xù)抽氣，使之干燥。5.4.2.6 保藏干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蠟封住棉花塞后放冰箱中保藏。（二）冷凍干燥保藏法1 目的理解冷凍干燥保藏菌種的原理掌握冷凍干燥保藏菌種的方法。2 原理冷凍干燥保藏菌種法可克服簡單保藏方法的不足。利用有利于菌種保藏的切因素，使微生物始終處于低溫、干燥、缺氧的條件下，因而它是迄今為止最有效的菌種保藏法之一。3 材料菌株待保藏的各種菌種。試劑2% HCl;牛奶。器具安瓿管、標(biāo)簽、長滴管、脫脂棉、干冰、離心機(jī)、冷凍真空裝置、高頻電火花器。4 流程備安甑管-備脫脂乳-制菌懸液-分裝-預(yù)凍-真空干燥-保藏-活化5 步

8、驟準(zhǔn)備安瓿管安甑管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。將標(biāo)簽放入安培管內(nèi)，管口塞上棉花，滅菌備用。制備脫脂乳用鮮奶經(jīng)處理或使用脫脂奶粉配兌脫脂牛奶，滅菌，并做無菌試驗(yàn)后備用。制菌懸液將無菌牛奶直接加到待保藏的菌種斜面內(nèi)，用接種環(huán)將菌種刮下，輕輕攪亂使其均勻地懸浮在牛奶內(nèi)成懸浮液。分裝用無菌長滴管將懸浮液分裝入安瓿管底部，每支安培管的裝量約為毫升。（ 一般裝入量為安瓿管球部體積的 1/3)預(yù)凍將分裝好的安甑管在-25至-40之間的干冰酒精中進(jìn)行預(yù)凍 1小時(shí)；或在冰箱冷凍室進(jìn)行預(yù)東。真空干燥預(yù)凍以后，將安甑管放入真空器中，開動(dòng)真空泵進(jìn)行干燥。封管封管前將安甑管裝入歧管；真空度抽至毫米汞拄后，再用

9、火焰熔封，封好后，要用高頻火花器檢查各安甑管的真空情況。如果管內(nèi)呈現(xiàn)灰藍(lán)色光，證明保持著真空。檢查時(shí)高頻電火花器應(yīng)射向安甑管的上半部。保藏做好的安甑管應(yīng)放置在低溫避光處保藏?；罨绻獜闹腥〕鼍N恢復(fù)培養(yǎng)，可先用75%酉精將管的外壁消毒，然后將安甑管上部在火焰上燒熱，再滴幾滴無菌水，使管子破裂。在用接種針直接挑取松散的干燥樣品，在斜面接種。6結(jié)果簡述真空冷凍干燥保藏菌種的原理。記錄大腸桿菌斜面作液體石蠟封藏和枯草桿菌作沙土管保藏的要點(diǎn)。7思考菌種保藏中，石蠟油的作用是什么？經(jīng)常使用的細(xì)菌菌株，使用那種保藏方法比較好？沙土管法適合保藏那一類微生物？上一篇：實(shí)驗(yàn)一一Amesfe檢測誘變劑和致癌劑下

10、一篇：實(shí)驗(yàn)一一菌種冷凍干燥保藏法甘油冷凍保藏法本方法適合于中、長期菌種保藏，保藏時(shí)間一般為2-4年左右。(1)用火焰滅菌的接種環(huán)取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落。(2)平皿倒置于30c或37c恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng) 24-48小時(shí)，至單菌落的大小為 3mm£右。(3)挑取一個(gè)單菌落，接種于一個(gè)裝50mL (LB)白300mL三角瓶中30c或37c振蕩培養(yǎng)10-15小時(shí)，至菌密度 OD600為。(4)用火焰滅菌的接種環(huán)取少量種子液，涂片后，作革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體的形態(tài)，及是否有雜菌。(5)按30%T油：種子液為1:1 (V/V)的量加入無菌甘油，混合后分裝至事先滅菌的菌種保存管(1

11、-2mL/管)，-70 C或液氮保存。專家解答甘油管冷凍保藏法1 .試驗(yàn)方法介紹本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達(dá)到保藏目的。其方法是，將 80%勺甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(1081010/ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為 10%-30%于-70 C下凍存。-20 C保存時(shí)間較短?；虿捎皿w積比為8： 2的甘油生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20 C冰箱保存。2 .效果該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時(shí)也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油-生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液， 其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護(hù)了待保存的菌株。求助各位大俠我想斜面-80度長