酶標(biāo)儀的工作原理及基本結(jié)構(gòu)

1、酶免測(cè)試的工作原理吸光度測(cè)試的準(zhǔn)確性對(duì)于酶免測(cè)試結(jié)果的重要性 酶標(biāo)儀的組成部分和工作原理第一節(jié)比色分析的基本理論許多化學(xué)物質(zhì)具有顏色，有些無色的化合物也可以和顯色劑作用而生成有色物質(zhì)。事實(shí)證明，當(dāng)有色溶液的濃度改變時(shí)， 顏色的深淺也隨著改變。 濃度越大，顏色越深；濃度越小， 顏色越淺。因此，可以通過比較溶液顏色深淺的方法來確定有色溶液的濃度，對(duì)溶液中所含的物質(zhì)進(jìn)行定量分析。如納氏管比色法，它是按濃度由高到低，配好一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度管，然后拿待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)管逐個(gè)比較，看和哪一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管的顏色最相近，便讀取該標(biāo)準(zhǔn)管的濃度值為待測(cè)樣品的濃度值，這就是（目視）比色法。這種方法雖然比較簡(jiǎn)便，但是系列標(biāo)準(zhǔn)管 不

2、易保存，誤差較大。后來改用光電檢測(cè)元件代替目視來測(cè)量被測(cè)溶液中物質(zhì)的含量，這種方法叫光電比色法。利用這種方法制成的儀器叫光電比色計(jì)。光電比色計(jì)屬于吸收光譜儀器范圍。、光的性質(zhì)從物理學(xué)中我們知道，光具有波動(dòng)和微粒兩種性質(zhì)， 通稱光的波粒兩象性。 在一些場(chǎng)合, 光的波動(dòng)性比較明顯；在另一些場(chǎng)合，光則主要表現(xiàn)為微粒性。0、波長(zhǎng)（力、速度400760nm之間的電磁 不同波長(zhǎng)的光被人眼所首先，光是一種電磁波?？梢杂妹枋鲭姶挪ǖ男g(shù)語，如振動(dòng)頻率（ （c ）、周期（T ）來描述它。我們?nèi)粘Ｋ姷降陌坠?，便是波長(zhǎng)在 波，它是由紅橙黃綠青藍(lán)紫等色，按照一定比例混合而成的復(fù)合光。感受到的顏色是不同的。 在可見光之

3、外是紅外線和紫外線。各種色光及紅外線、 紫外線的近似波長(zhǎng)范圍如表1所示。表1各種色光及紅外線、紫外線的近似近波范圍單位：nm顏色波長(zhǎng)范圍顏色波長(zhǎng)范圍遠(yuǎn)紅外線100011000000綠501 ,-560中紅外線2501-10001青481 ,-500近紅外線761-2500藍(lán)431 ,-480紅621760紫401 ,-430橙591620普通紫外線191 ,-400黃561590真空紫外線1-190除了波動(dòng)性外，光還具有微粒性。在輻射能量時(shí)，光是以單個(gè)的、一份一份的能量（E= hu）的形式輻射的。式中U是光的頻率，h為普朗克常量。同樣，光被吸收時(shí)，其能量一 份一份地被吸收的。因此，我們可以說，

4、光是由具有能量（ hu）的微粒所組成的，這種微粒 被稱為光子。由式中可知，不同波長(zhǎng)的光子具有不同的能量。波長(zhǎng)越短，即頻率越高，能量 越大。反之亦然。光子的存在可以從光電效應(yīng)中得到充分的證明。、光的互補(bǔ)及有色物質(zhì)的顯色原理若把某兩種顏色的光按照一定的比例混合，能夠得到白色光的話，則這兩種顏色的光就叫做互補(bǔ)色。圖1中處于直線關(guān)系的兩種光為互補(bǔ)色。如綠光和紫光為互補(bǔ)色，黃光和藍(lán)光為互補(bǔ)色等等。圖1互補(bǔ)色光示意圖圖2高鎰酸鉀溶液的光吸收曲線物質(zhì)的顏色與光的吸收、 透過、反射有關(guān)。由于物質(zhì)的性質(zhì)和形態(tài)不同，所以呈現(xiàn)出不 同的顏色。透明物質(zhì)的顏色就是它透過光波的顏色。不透明物質(zhì)的顏色是其反射光波的顏色。有

5、色溶液對(duì)光的吸收是有選擇性的。各種溶液之所以會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色，其原因是因?yàn)槿芤褐械挠猩|(zhì)點(diǎn)（分子或離子）選擇性地吸收某種顏色的光所致。實(shí)踐證明，溶液所呈現(xiàn)的顏色是它的主要吸收光的互補(bǔ)色。如一束白光通過高鎰酸鉀溶液時(shí)，綠光大部分被選擇吸收， 其他的光透過溶液。從互補(bǔ)色示意圖可以看出， 透過光中除紫色外，其他顏色的光兩兩互補(bǔ)。 透過光中只剩下紫色光，所以高鎰酸鉀呈紫色。通常用吸收曲線來描述溶液對(duì)各種波長(zhǎng)的光的吸收情況。讓不同波長(zhǎng)的光通過一定濃度的有色溶液，分別測(cè)出它對(duì)各種波長(zhǎng)的光的吸收程度（用吸光度A來表示），以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作圖，所得到的曲線稱為溶液的吸收曲線或吸收光譜圖。例如，高

6、鎰酸 鉀吸收曲線如圖所示。圖 2中Ci、。、。分別代表不同的濃度，Ci < C2 < C3。從圖2中可以看出，在可見光范圍內(nèi)，高鎰酸鉀溶液對(duì)波長(zhǎng)為 525nm左右的綠色光吸收 程度最大，而對(duì)紫色和紅色光很少吸收。對(duì)于任何一種有色溶液， 都可以測(cè)繪出它的吸收曲線。 光吸收最大處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)叫最 大吸收波長(zhǎng)。濃度不同的同一種溶液， 其吸收光譜的形狀和最大吸收波長(zhǎng)是一樣的，也就是說，不同的物質(zhì)都具有其特定的吸收光譜。如同根據(jù)指紋可以辨認(rèn)眾人一樣，在光譜分析中，可以根據(jù)吸收光譜的不同來鑒別物質(zhì)。從圖2中還可以看出，溶液的濃度越大，對(duì)（綠）光的吸收程度越大。因此，可以利用這部分光線通過溶液后

7、被吸收的程度來確定溶液的濃度。如可用綠色光來對(duì)高鎰酸鉀溶液進(jìn)行比色測(cè)定。由于有色物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，因此，在進(jìn)行比色測(cè)定時(shí)，只能用光波中能被有色溶液吸收的那部分光線，即應(yīng)該有單色光進(jìn)行比色測(cè)定。至于不被有色溶液吸收的光線， 則應(yīng)設(shè)定在未透過有色溶液之前或之后將其消除掉。濾光片就起這個(gè)作用。 根據(jù)前面所敘述的理由可知，選擇濾光片的原則應(yīng)是：濾光片的顏色應(yīng)與待測(cè)溶液的顏色為互補(bǔ)色。三、朗伯-比爾（Lamber-Beer ）定律溶液顏色的深淺與濃度之間的數(shù)量關(guān)系可以用吸收定律來描述。它是由朗伯定律和比爾定律相結(jié)合而成的，所以又稱朗伯-比爾定律。當(dāng)一束平行單色光照射到均勻、非散射的溶液時(shí)，光的一

8、部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面所反射。設(shè)入射光的強(qiáng)度為I。，吸光度的強(qiáng)度為Ia ,反射光I r ，透過光的強(qiáng)度為 I t 。則它們之間有如下關(guān)系：I o = I a+I r+ 11在實(shí)際比色分析時(shí)，所用的比色皿都是同質(zhì)料、同規(guī)格的，因此反射光的強(qiáng)度為一定值，不會(huì)引起誤差，即反射光的影響可以不考慮。這樣，上式可簡(jiǎn)化為：Io=I a + 11當(dāng)入射光的強(qiáng)度一定時(shí)，被吸收的光的強(qiáng)度越大，透過光的強(qiáng)度就越小。這就是說，光強(qiáng)的減弱僅僅與有色溶液對(duì)光的吸收有關(guān)。在比色分析中，常把透過光的強(qiáng)度占入射光的強(qiáng)度的百分比 ( I t / I o) 稱為透過率或透射比，用T表示，即T= (It /

9、 Io) %。T越大，表明有色溶液的透光程度越大。當(dāng)一束平行單色光通過有色溶液時(shí)，由于溶液吸收了一部分光線，光線的強(qiáng)度就要減弱。溶液的濃度越大、透過的液層越厚、入射的光線越強(qiáng)，則對(duì)光線的吸收就越多。如果入射光的強(qiáng)度不同， 則光的吸收只與液層厚度及溶液的濃度有關(guān)。 它們之間的關(guān)系可以用下式 表示：A= K C- L式中， A 為吸光度； K 為吸(消)光系數(shù)； C 為溶液的濃度； L 為液層厚度。此公式說明： 在入射光一定時(shí)， 溶液的吸光度與溶液的濃度及液層厚度成正比。 此式就是光的吸收定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式，又叫朗伯 - 比爾定律。這一定律是比色分析和其他吸收光譜分析的理論基 礎(chǔ)。吸光系數(shù) K= A

10、/ (C- L),它表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度。在入射光的波長(zhǎng)、溶液的種類和溫度一定的條件下， K 為定值。 K 值越大，說明比色分析時(shí)的靈敏度越高。吸光度A與透射比T的關(guān)系如下：A= lgT即吸光度 A與透射比T的負(fù)對(duì)數(shù)成正比。四、定量方法用光電比色計(jì)和分光光度計(jì)測(cè)定有色溶液的濃度有計(jì)算法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法兩種。計(jì)算法必須嚴(yán)格遵守朗伯 - 比爾定律的應(yīng)用條件，方能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。(一)計(jì)算法根據(jù)被測(cè)溶液濃度的大致范圍，先配制一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用同樣的方法處理標(biāo)準(zhǔn)與被測(cè)溶液，使其成色后，在同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，用同一臺(tái)儀器分別測(cè)出它們的吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)溶液中：As= Ks '

11、Cs ' Ls在待測(cè)溶液中：A = Kx G Lx將兩式相除可得：As /A x =Ks CS - Ls/ (Kx - CX - Lx)如果測(cè)定時(shí)選用相同厚度的比色皿使L相等，并使用同一波長(zhǎng)的單色光，再保持溫度相同，則K也相等。這樣上式可簡(jiǎn)化為：As /A x=G/ C x由此可見，在滿足上述條件下， 溶液的吸光度與其濃度成正比。這一關(guān)系式是設(shè)計(jì)光電比色計(jì)和分光光度計(jì)的基礎(chǔ)，也是比色分析的基本計(jì)算公式之一。式中標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度已知，As和Ax可以用光電比色計(jì)測(cè)量出來，這樣，待測(cè)溶液的濃度便可以由下式求出：G= Cs Ax/ a s由于儀器的性能和工作環(huán)境都是在不斷變化的，因此，在采用計(jì)算

12、機(jī)時(shí)，必須每次都要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)液和被測(cè)液進(jìn)行測(cè)量，然后利用上式進(jìn)行計(jì)算， 否則，會(huì)帶來較大的測(cè)量誤差。 再者,光電比色計(jì)在使用時(shí)，一般都或多或少會(huì)偏離朗伯-比爾定律，故欲得到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果，常采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。(二)標(biāo)準(zhǔn)曲線法這種方法分以下幾步進(jìn)行：(1)先配制5種以上標(biāo)準(zhǔn)濃度的溶液；(2)測(cè)出每種溶液的吸光度 A;(3)做A、C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖3所示。圖3標(biāo)準(zhǔn)曲線有了標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，便可以對(duì)溶液進(jìn)行測(cè)量。在同樣工作條件下，用儀器測(cè)出A后，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可求得被測(cè)溶液的濃度值cx。為了方便工作，現(xiàn)代光電比色計(jì)大都加有對(duì)數(shù)運(yùn)算放大器，使用時(shí)只要選用一種合適的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定標(biāo)，然后便可以直接讀取溶液的濃度值，

13、使工作效率大大提高。第二節(jié)光電比色計(jì)的基本結(jié)構(gòu)利用光電池或光電管等光電元件作檢測(cè)器，來測(cè)量通過有色溶液的透射比或吸光度，進(jìn)而求出物質(zhì)含量的方法叫光電比色法?；谶@種方法而設(shè)計(jì)成的儀器叫光電比色計(jì)。一般的光電比色計(jì)由光源、濾光片、比色皿、光電檢測(cè)器、放大和顯示等6部分組成。光電比色計(jì)的方框圖如圖4所示。圖4光電比色計(jì)方框圖光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)濾光片濾除后，變?yōu)榻频膯紊狻４藛紊馔ㄟ^比色皿時(shí)，被比色皿中盛放的樣品液吸收掉一部分，然后照在光電檢測(cè)器上。光電檢測(cè)器將照在它上面的光信號(hào)的強(qiáng)弱轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)的大小，最后由顯示部分將測(cè)量結(jié)果顯示出來。一、光源理想的光源應(yīng)在整個(gè)所需要的波長(zhǎng)范圍內(nèi)具有均勻的發(fā)光

14、強(qiáng)度，也就是說，它的光譜 應(yīng)該包括所用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)有波長(zhǎng)的光，光的強(qiáng)度應(yīng)該足夠大， 并且在整個(gè)光譜區(qū)中， 其強(qiáng)度不應(yīng)隨波長(zhǎng)有顯示的變化。實(shí)際上，這種理想的光源并不存在，所有光源的光強(qiáng)都隨波長(zhǎng) 而變。在可見光范圍內(nèi)常用的光源有鴇絲燈和鹵鴇燈。（一）鴇絲燈鴇絲燈是可見光區(qū)和近紅外區(qū)最常用的光源，它適應(yīng)的波長(zhǎng)范圍在3202500nm之間，如圖5所示。鴇絲燈靠電能將鴇絲加熱至白熾而發(fā)光，它的光譜分布與燈絲的工作溫度有關(guān)。鴇絲燈的特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格便宜、壽命較長(zhǎng)，通常可以工作1000h以上。圖5鴇絲燈的能量曲線其不足之處是，在點(diǎn)燃時(shí)鴇絲會(huì)不斷向外蒸發(fā)出鴇分子。燈絲的溫度越高，蒸發(fā)速度越快。鴇絲的蒸發(fā)會(huì)

15、使燈絲變細(xì)， 縮短壽命，更重要的影響是蒸發(fā)出的鴇分子到達(dá)燈泡的內(nèi)壁時(shí)，會(huì)沉積在內(nèi)壁上， 隨著工作時(shí)間的延長(zhǎng)，內(nèi)壁沉積的鴇會(huì)越來越厚，使燈泡透出來的 光越來越弱。嚴(yán)重的會(huì)使燈壁發(fā)黑，無法使用。使用鹵鴇燈可以解決這一問題。（二）鹵鴇燈鹵鴇燈是在鴇燈中加入適量的鹵素或鹵化物（如碘鴇燈內(nèi)加入純碘，澳鴇燈中加入澳 化氫）而制成的，有時(shí)也稱作鴇鹵素?zé)艉望u素?zé)?。其燈壁多采用石英或高硅氧玻璃。鹵鴇燈有比普通鴇燈高得多的發(fā)光效率和長(zhǎng)得多的壽命，這主要是因?yàn)樵邴u鴇燈中，鴇蒸氣在靠近燈壁的低溫區(qū)與鹵素相結(jié)合，生成了揮發(fā)性的鹵化鴇氣體。由于燈泡內(nèi)的熱對(duì)流，使鹵化鴇氣體產(chǎn)生流動(dòng)。當(dāng)鹵化鴇碰上高溫?zé)艚z時(shí)，又分解成鹵素和鴇

16、。鴇沉積在燈絲上，而鹵素再繼續(xù)擴(kuò)散到溫度較低的燈壁區(qū)與鴇化合。這一過程一般稱為鹵鴇循環(huán)或鴇的再生循環(huán)。這一循環(huán)大大減少了鴇在燈泡內(nèi)壁的沉積，它不但延長(zhǎng)了燈泡的壽命，還提高了燈泡的性能。 鹵鴇燈的壽命通?？蛇_(dá) 2000h以上，它的另一優(yōu)點(diǎn)是體積比同功率的鴇絲燈要小得多。鴇燈（包括鹵鴇燈）的發(fā)光穩(wěn)定度與所加的電壓有密切的關(guān)系。已知在可見光區(qū)，其 能量輸出的波動(dòng)約為所加電壓波動(dòng)的4次方倍。為了獲得穩(wěn)定的測(cè)量結(jié)果，保持光源燈發(fā)光的穩(wěn)定性是非常重要的，這就要求給光源燈提供穩(wěn)定的供電電壓。這兩種鴇燈既可以用交流供電，也可以用直流供電。在交流供電時(shí)，通常采用磁飽和 穩(wěn)壓器供電。在直流供電時(shí)，通常采用電子穩(wěn)壓

17、電路供電。目前，絕大部分采用直流供電。二、濾光片濾光片又叫濾色片，其作用是控制波長(zhǎng)或能量的分布，即它只讓一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的光 通過，而將其余不需要的波長(zhǎng)的光濾去，相當(dāng)于電路中的帶通濾波器。濾光片通過的波長(zhǎng)范圍越窄、透射比越大，說明其質(zhì)量越好。濾光片通過單色光的純度，通常用其光譜特性曲線的半寬度表示。圖6是一塊藍(lán)色濾光片的透射比曲線。曲線上與最大透射比Tm對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)（480nm）,叫峰值波長(zhǎng)。與最大透射比的一半（Tm/2）相對(duì)應(yīng)的 A B兩點(diǎn)之間的波長(zhǎng)差，叫半寬度。即：半寬度=入2-入。圖6中的半寬度=530-430 = 100ns半寬度越小，表示透過的單色光越純。常用的波光片有吸收濾光片、干涉濾

18、光片、復(fù)合濾光片等。圖6吸收濾光片的透光曲線（一）吸收濾光片吸收濾光片又叫玻璃濾光片，它是在熔化的玻璃中摻以不同的添加劑制成的。這種濾光片所呈現(xiàn)的顏色就是其透過光的顏色。其優(yōu)點(diǎn)是熱穩(wěn)定性較好、 價(jià)格便宜，是普通光電比色計(jì)最常用的濾光片。根據(jù)其性能的不同，吸收濾光片又可分為帶通濾光片和截止濾光片兩類。 帶通濾光片的透光特性如圖 6所示。這類濾光片的半寬度較寬，通常在100nm左右；最大透射比較小，通常在 20左右。（二）截止和復(fù)合濾光片截止濾光片的特性是其透光部分的透射比接近100,而其他部分的透射比則迅速下降為0,透光部分不存在兩端截止的通頻帶，因此，它沒有半寬度的概念，其透光特性如圖7所 示

19、。從圖7還可以看出，兩塊截止濾光片、 兩塊帶通濾光片，或一塊截止與一塊帶通濾光片， 可以組成一塊新的帶通濾光片， 這樣的濾光片叫復(fù)合濾光片。復(fù)合濾光片可以得到比玻璃濾光片窄得多的半寬度。圖7截止濾光片的透光特性圖8截止濾光片的名義值截止濾光片的名義值用半高波長(zhǎng)和陡度表示，如圖8。半高波長(zhǎng)是指曲線前沿Tm /2處所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)，圖中用入1表示。透射比下降到 5%時(shí)所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)稱為截止波長(zhǎng)，圖中8用加表示。陡度定義為：陡度=半高波長(zhǎng)/（爪粉。國產(chǎn)比色計(jì)中62、65、67號(hào)3塊濾光片為截止濾光片。目前，國內(nèi)生產(chǎn)的光電比色計(jì)一般只附有常用的42號(hào)、50號(hào)和65號(hào)3塊波光片。濾光片的編號(hào)是其峰值（或半高）

20、波長(zhǎng)的代號(hào)。如 42號(hào)和50號(hào)的峰值波長(zhǎng)分別為 420nm和 500nm, 65號(hào)的半高波長(zhǎng)為 650ns如需要其他波長(zhǎng)的濾光片，可以自行購買。濾光片的透光特性與溫度有關(guān)。溫度升高時(shí)，不但它的半寬度會(huì)加寬， 峰值波長(zhǎng)也會(huì)起變化。溫度變化還從其他途徑影響比色分析。因此，在光源燈和濾光片之間常加上一塊隔熱玻璃，以減少溫度的影響。此外，雖然一般不認(rèn)為透明玻璃是濾光片，但是普通玻璃確實(shí)不能透過波長(zhǎng)小于300nm而大于2600nm的光波。故工作在紅外和紫外波段的光學(xué)儀器必須使用特殊的透光材料，如 紫外區(qū)使用石英玻璃，紅外區(qū)使用巖鹽、氟化鈣等。（三）干涉濾光片由光的干涉原理可知， 來自同一光源的兩束光線，

21、在空間不同的路徑而相互疊加時(shí)，若光程差為波長(zhǎng)的整數(shù)倍，則互相加強(qiáng)；若光程差為半個(gè)波長(zhǎng)的奇數(shù)倍，則互相減弱。干涉濾光片就是利用光的干涉原理來產(chǎn)生窄譜帶光束的元件。它大多采用多層鍍膜等復(fù)雜的工藝制成。干涉濾光片的半寬度可以做得很窄， 如可達(dá)幾個(gè)納米，透射比可以做得很大， 如70%以上。干涉濾光片雖然性能優(yōu)越，但其價(jià)格昂貴。峰值波長(zhǎng)和最大透射比會(huì)隨著時(shí)間而發(fā)生改 變，甚至失效。另外還有一種濾光片叫中性濾光片，可以用它作吸光度的標(biāo)準(zhǔn)。它實(shí)際上是一個(gè)衰減器， 在所使用的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，它對(duì)所有的波長(zhǎng)進(jìn)行大致相同程度的吸收。需要說明的是，這種濾可能與實(shí)際值有偏差，使用時(shí)要以實(shí)際使用的波長(zhǎng)下的測(cè)定值為準(zhǔn)。光片上

22、的標(biāo)稱吸光度值，、比色皿比色皿又叫比色環(huán)、 比色池、比色槽、吸收池等，它主要用來盛裝比色分析時(shí)的樣品液。在可見光范圍內(nèi)，比色皿常用無色光學(xué)玻璃或塑料制成；在紫外區(qū)，常用石英玻璃來制作。比色皿的形狀一般為方形，圓形的比較少。此外，還有流動(dòng)比色皿、微量比色皿、可拆卸比色皿等，如圖 9所示。除了盛放液體的比色皿之外，還有用來盛裝氣體的比色皿。氣體比色皿需加有蓋子。圖9比色皿的形狀示意圖由于經(jīng)常用來盛裝各種化學(xué)溶液，比色皿除了要求具有良好的透光特性之外，還應(yīng)有較強(qiáng)的耐腐蝕性。盡管可以做成各種形狀和尺寸，但國際上規(guī)定，液層厚度為10mm勺比色皿為標(biāo)準(zhǔn)比色皿。在使用中應(yīng)該注意的是， 每臺(tái)儀器所配的比色皿都

23、是成套的，所以臺(tái)與臺(tái)之間所帶的比色皿不能混用，否則會(huì)帶來較大的測(cè)量誤差。在同一測(cè)定中所使用的所有比色皿的光徑（內(nèi)徑）必須一致。檢驗(yàn)比色皿是否符合要求的方法是：先在各比色皿中放入相同的溶液，然后放入儀器進(jìn)行測(cè)量。在其他條件不變的情況下，讀出的透射比誤差應(yīng)小于0.5%。否則說明誤差太大，不應(yīng)再使用。比色皿的內(nèi)壁和透光外壁都應(yīng)注意清潔，不能用硬質(zhì)纖維或用手去摸。其不透光的兩壁是供拿取的。不透光的兩壁被磨成毛沙面或其他不透光面，以示區(qū)別。使用比色皿時(shí)，其放置方向也應(yīng)注意。 因?yàn)橥腹夥较驌Q向后，其透光性可能會(huì)發(fā)生改變。 有的比色皿上標(biāo)有箭頭，用來指示光的方向。使用時(shí)，溶液不要放得太滿，以防液體溢出。一般

24、加液量只要稍多于 1/2即可。若有液體溢出，一定要把其外表的水分擦干。否則，會(huì)產(chǎn)生光的反射和折射，嚴(yán)重影響測(cè)量結(jié)果。四、光電檢測(cè)器前面已經(jīng)述及，光電檢測(cè)器是用來將光能轉(zhuǎn)換成電能的器件。在檢驗(yàn)儀器中常用的光電檢測(cè)器有光電池、光電管和光電倍增管等。光電檢測(cè)器必須滿足以下 3個(gè)條件：（1）光電轉(zhuǎn)換須滿足恒定的函數(shù)關(guān)系；（2）波長(zhǎng)響應(yīng)范圍寬；（3）靈敏度高，響應(yīng)速度快，產(chǎn)生的電信號(hào)易于檢測(cè)和放大，噪聲低。（一）光電池某些半導(dǎo)體材料受光照射時(shí)， 受光面和背光面之間會(huì)產(chǎn)生電位差， 如果在這兩面之間連 接上檢流計(jì)，會(huì)看到有電流通過， 這種光電轉(zhuǎn)換器件稱為光電池。 如硒光電池、硅光電池等, 其中硒光電池應(yīng)用較

25、廣，它的結(jié)果如圖 10所示。A圖10硒光電池結(jié)構(gòu)示意圖在作為電極之一的金屬板（如厚12mm的鐵、銅、鋁板）上，涂上一層厚約 0.1mm的P型半導(dǎo)體硒。然后，再在硒上濺鍍一層半透明的金屬薄膜（如銀或氧化鎘等），作為另一極。經(jīng)過熱處理后，在硒半導(dǎo)體和金屬薄膜的分界面上形成一層阻擋層一一PN結(jié)，其附加電場(chǎng)的方向由金屬膜指向硒。這一阻擋層既能夠阻止硒半導(dǎo)體中的空穴向金屬膜中擴(kuò)散， 也能夠阻止金屬膜中的電子向硒半導(dǎo)體中擴(kuò)散。當(dāng)光通過金屬膜照射到半導(dǎo)體上時(shí)，半導(dǎo)體中處于束縛狀態(tài)的電子吸收了光子的能量后，成為自由電子，這時(shí)可以順利地通過阻擋層到金屬膜上。因此，在金屬膜電極上便積累了較多的電子。另一極由于失去

26、了電子， 積累了較多的空穴，這樣就產(chǎn)生了 “光生電動(dòng)勢(shì)”。這種現(xiàn)象由于是在物體內(nèi)部產(chǎn)生的，有時(shí)也把它叫做“內(nèi)光電效應(yīng)”。如果有外電路將兩電極接通，便有（光）電流流經(jīng)外回路。所產(chǎn)生的 光電流與入射光強(qiáng)成正比。 從其工作原理我們可以看出，光電池不用外接電源， 只要受光照射，便能產(chǎn)生電流。應(yīng)用起來很方便。不同材料的光電池，其光譜靈敏范圍不一樣。硒光電池的工作范圍在380750nmi包含了整個(gè)可見光范圍。圖 11是硒光電池和人眼對(duì)不同波長(zhǎng)的光的感應(yīng)曲線。圖11 硒光電池和人眼對(duì)不同波長(zhǎng)光的感應(yīng)曲線在普通室內(nèi)照明的條件下，硒光電池產(chǎn)生的光電流有幾十至幾百微安。用三用表就可以測(cè)量出來。方法是先將表置于10

27、0 g或50隱檔，有正表棒接硒光電池的正極 一一背面鋁片， 負(fù)表棒接負(fù)極一一正面集電環(huán)。在一般的室內(nèi)照明條件下，測(cè)得的電流為幾十微安以上。當(dāng) 光電流非常微弱或沒有時(shí)，說明光電池已經(jīng)失效。硒光電池受光連續(xù)照射的時(shí)間過長(zhǎng)或受強(qiáng)光照射后，光電流會(huì)很快上升至一個(gè)較高的數(shù)值，然后逐漸下降，這一現(xiàn)象叫做光電池的疲勞現(xiàn)象，其表現(xiàn)為儀器上的指針或反射光點(diǎn)慢慢后退。因此，光電池不要連續(xù)使用過久。在插入濾光片之前，不要開亮燈泡，以免強(qiáng)光照射。如果光電池已經(jīng)疲勞，最簡(jiǎn)單的恢復(fù)辦法是把它置于暗處一段時(shí)間，使其慢慢恢復(fù)靈敏度。另外，光電池很容易受潮而致使其產(chǎn)生的電流大小不穩(wěn)定，平時(shí)保存要防潮、防光，最 好用深色紙包起來

28、放入干燥器皿中。光電池的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)實(shí)、便宜、使用方便，不需外接電源就可以直接送到微安表或檢流計(jì)上去顯示。其缺點(diǎn)是對(duì)光的響應(yīng)速度慢，不能檢測(cè)脈沖光束；內(nèi)阻小，不便進(jìn)行信號(hào)放大等。常用的光電池除了硒光電池外，還有硅光電池。和硒光電池相比， 硅光電池最大的優(yōu)點(diǎn)是使用壽命長(zhǎng)一一可使用10年以上。它幾乎無疲勞現(xiàn)象，是很受歡迎的一種新型光電池。不同廠家生產(chǎn)的硅光電池，其光譜靈敏范圍不一樣。如有的工作在3001100nm,有的工作在5001000nmi還有的工作在 380780nmo所以，使用硅光電池時(shí)，一定要事先弄清 楚其工作波長(zhǎng)，即光譜靈敏第范圍。除了光譜靈敏范圍之外，光電檢測(cè)元件的另一個(gè)重要指標(biāo)是積分靈

29、敏度，簡(jiǎn)稱靈敏度。靈敏度是指在單位光通量照射下，光電轉(zhuǎn)換元件所產(chǎn)生的光電流的大小。一般光電池的靈敏度為幾百微安/流明。酶標(biāo)儀的工作原理及基本結(jié)構(gòu)一、酶標(biāo)聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法酶標(biāo)聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法采用酶標(biāo)記技術(shù)，使待測(cè)標(biāo)本與事先包被在塑料凹孔板內(nèi)的相 應(yīng)抗原或抗體相結(jié)合，形成免疫復(fù)合物。酶標(biāo)抗原或抗體與此結(jié)合形成酶標(biāo)記的免疫復(fù)合物。 當(dāng)加入酶的相應(yīng)底物時(shí)，由于酶的催化作用， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。顏色的深淺與相應(yīng)的抗原或抗體的量成正比。這樣，原來人體中無色的抗原或抗體，與酶聯(lián)接后仍保持免疫和酶的活性。當(dāng)加入底 物后，能使底物顯色?？乖蚩贵w的含量越高，顏色就越深。這樣，便可根據(jù)所生成的顏色 的深淺，來分析抗原

30、或抗體的含量。酶標(biāo)法（并稱固相酶免疫測(cè)定）可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有3個(gè)必要的試劑：固相的抗原或抗體、 酶標(biāo)記的抗原或抗體和酶反應(yīng)的底物。 根據(jù)試 劑的來源和標(biāo)本的性狀以檢測(cè)的具體條件， 可設(shè)計(jì)出各種不同的檢測(cè)方法?，F(xiàn)介紹3種最常 用的方法。（一）抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原最常用的方法，圖10為其示意圖。具體操作步驟如下：圖10雙抗體夾心法測(cè)抗原示意圖(1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。然后洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。(2)加受檢標(biāo)本使之與固相抗體接觸反應(yīng)一段時(shí)間，讓標(biāo)本中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。然后洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。(

31、3)加酶標(biāo)抗體，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。然后徹底洗滌未結(jié)合 的酶標(biāo)抗體。此時(shí)，固相載體上帶有的酶量就代表標(biāo)本中受檢抗原的量。(4)加底物顯色。夾心式復(fù)合物中的酶催化底物變?yōu)橛猩a(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度 進(jìn)行該抗原的定性或定量。本法只適用于二價(jià)或二價(jià)以上大分子抗原的檢出和定量分析，而不能用于半抗原等小分子的測(cè)定。(二)間接法間接法是檢測(cè)抗體最常用的方法，圖11為其示意圖。其原理為利用酶標(biāo)記的抗體來檢測(cè)已與固相抗原結(jié)合的受檢抗體。操作步驟如下： 圖11間接法測(cè)抗體示意圖(1)將特異體抗原與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗原。然后洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。(2)加稀釋的受檢血清，使血清中的

32、特異性抗體與固相抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體 復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。(3)加酶標(biāo)抗免疫球蛋白 (酶標(biāo)抗體)，它與固相復(fù)合物中的抗體相結(jié)合，從而使該抗 體間接地標(biāo)記上酶。清洗后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。(4)加底物顯色，顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體量。(三)競(jìng)爭(zhēng)法競(jìng)爭(zhēng)法可用于測(cè)定抗原， 也可用于測(cè)定抗體。 以測(cè)定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競(jìng) 爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合，因此，結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成正比， 其示意圖如圖 12所示。具體操作步驟為：恁昧仁也OE O£QO 9M

33、（青O：圖12競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原示意圖(1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié)，形成固相抗體。然后洗滌。(2)在待測(cè)管中加入受檢標(biāo)本與一定量的酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。若受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。若受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機(jī)會(huì)與固相抗體結(jié)合。這樣，受檢標(biāo)本中抗原量越高， 則由于這些抗原與固相抗體結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性地占去了酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合的機(jī)會(huì)，使酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合量越少?！皡⒖脊堋敝兄患用笜?biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分 的量。然后洗滌。(3)加底物顯色。參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原量最多，故顏色最深。參考管中顏色 深度與待測(cè)管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本中抗原的量。待測(cè)管越淡，表示標(biāo)本中抗原量越多。二、酶標(biāo)儀的工作原理及結(jié)構(gòu)由酶標(biāo)聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法可知，酶標(biāo)義應(yīng)該用比色法來分析抗原或抗體的含量，即它應(yīng)依照比色原理進(jìn)行工作。 實(shí)際上，酶標(biāo)儀就是一臺(tái)變相的光電比色計(jì)或分光光度