PCR-SSCP原理及應(yīng)用

1、PCR-SSCP 原理及應(yīng)用隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測基因結(jié)構(gòu)和突變的方法不斷涌現(xiàn).尤其是 PCR 技術(shù)問 世以后，各種與PCR 相結(jié)合的基因檢測技術(shù)進(jìn)一步推動了基因研究的發(fā)展.如不對稱PCR 產(chǎn)物的直接測序、核糖核酸酶酶切法(Ribonuclease cleavage， RNAase) 、限制性片段長度多態(tài)性分析(RestrictionFragment Length PolymorPhism ， RFLP) 等等已成為基因分析的有力工具.但這些方法操作比較繁瑣，局限性較大，或要求實(shí)驗(yàn)條件高，不適合一般臨床實(shí)驗(yàn)室使用.1989年問世的PCR-SSCP(下文稱SSCP)作為檢測基因突變的方法

2、，經(jīng)不斷地改進(jìn)和完善，更為簡便、快速、靈敏，不但用于檢測基因點(diǎn)突變和短序列的缺失和插入，而且還被用于DNA 定量分析，監(jiān)測PCR 診斷實(shí)驗(yàn)中的交*污 染情況，以及傳染源的調(diào)查等.由于 SSCP 的突出的優(yōu)點(diǎn)，近幾年被大量地應(yīng)用.SSCP 的原理及特點(diǎn)日本 Orita 等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA 片段呈復(fù)雜的空間折疊構(gòu)象，這種立體結(jié)構(gòu)主要是由其內(nèi)部堿基配對等分子內(nèi)相互作用力來維持的，當(dāng)有一個堿基發(fā)生改變時，會或多或少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變，空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA 分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同.因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),可以非常 敏銳地將構(gòu)象上有差 異 的

3、分 子 分 離 開 . 作 者 稱 該 方 法 為 單 鏈 構(gòu) 象 多 態(tài) 性 (Single-Strand Conformation PolymorPhism , SSCP)分析.在隨后的研究中， 作者又 將SSCP用于檢查PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的基因突變，從而建立了PCR-SSCP 技術(shù)，進(jìn)一步提高了 檢測突變方法的簡便性和靈敏性.其基本過程是: PCR 擴(kuò)增靶 DNA;將特異的PCR 擴(kuò)增 產(chǎn)物變性，而后快速復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單 鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳;最后通過放射性自顯影、銀染或澳化乙錠顯色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA 帶遷移率與正常對照的相

4、比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA 片段中有堿基突變.該方法簡便、快速、靈敏，不需要特 殊的儀器，適合臨床實(shí)驗(yàn)的需要. 但它也有不足之處.例如，只能作為一種突變檢測方法， 要最后確定突變的位置和類型，還需進(jìn)一步測序;電泳條件要求較嚴(yán)格;另外，由于 SSCP 是依據(jù)點(diǎn)突變引起單鏈DNA 分子立體構(gòu)象的改變來實(shí)現(xiàn)電泳分離的，這樣就可能會出現(xiàn)當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對單鏈 DNA 分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時，再加上其他條件的影響， 使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨造成漏檢.盡管如此該方法和其他方法相比仍有較高的檢測率.首先，它可以發(fā)現(xiàn)靶DNA 片段中未知位置的堿基突變.Tak

5、ao,經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明小于 300bp的DNA片段中的單堿基突變，90%可被 SSCP 發(fā) 現(xiàn)，他認(rèn)為現(xiàn)在知道的所有單堿基改變絕大多數(shù)可用該方法檢測出來.另外，SSCP 方 法可通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將不同遷移率的突變單鏈 DNA 分離，并且還可以進(jìn)一步提純.用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑒別突變DNA 片段 .SSCP 的不斷改進(jìn)SSCP 技術(shù)自創(chuàng)立以來，經(jīng)歷了自身發(fā)展和完善的過程，剛建立時是將同位素?fù)饺隤CR 擴(kuò)增物中，通過放射自顯影來顯示結(jié)果.這給該技術(shù)的推廣造成一定的困難，隨著 DNA 銀染方法與PCR-SSCP 結(jié)合， 尤其是直接溴乙錠染色方法的應(yīng)用，使得該方法大大簡化. 最近， S

6、SCP 值得注意的改進(jìn)是將 DNA-SSCP 分析，改為RNA-SSCP 分析，其基本原理是: RNA 有著更多精細(xì)的二級和三級構(gòu)象，這些構(gòu)象對單個堿基的突變很敏感，從而提高了檢出率，其突變檢出率可達(dá)90%以上.另外，RNA 不易結(jié)合成雙鏈，因此可以較大量的進(jìn)行電泳，有利于用溴化乙錠染色.但該方法增加了一個反轉(zhuǎn)錄過程 ;還需要一個較長的引物，內(nèi)含有啟動RNA 聚合酶的啟動序列，從而相對地增加了該方法的難度.為了進(jìn)一步提高SSCP 的檢出率，可將 SSCP 分析與其它突變檢測方法相結(jié)合.其中與雜交雙鏈分析（HeterocluPlex analysis, Het）法結(jié)合可以大大提高檢出率.Het

7、法是用 探針與要檢測的單鏈DNA 或 RNA 進(jìn)行雜交，含有一對堿基對錯配的雜交鏈可以和完全互補(bǔ)的雜交鏈在非變性PAG 凝膠上通過電泳被分離開.對同一靶序列分別進(jìn)行SSCP 和 Het 分析可以使點(diǎn)突變的檢出率接近100%，而且實(shí)驗(yàn)簡便.PCR-SSCP 的實(shí)驗(yàn)操作在小于 1Kb 長度的情況下，DNA 片段長度與丙烯酰胺的濃度選擇如下DNA 片段長度（核苷酸數(shù)） （%）1Kb 700b 3.5700b500b5500b200b8200b 12在進(jìn)行 SSCP 前首先要通過PCR 擴(kuò)增出特異性好的產(chǎn)物（瓊脂糖電泳不能有過強(qiáng)的拖尾）.1）制備聚丙烯酰胺凝膠（PAG）按上表制所需的膠液，將梳子插入模

8、子，從梳子一端加入膠，當(dāng)膠液快到梳齒時，使模子向加膠端傾斜，繼續(xù)慢慢加膠，邊加邊放端模子以防止氣泡形成，室溫放置1h使 之凝固.然后拔掉梳子，頂部加入1XTbE封閉，備用.2）電泳取10仙lPCR產(chǎn)物，加入10仙l變性劑（95%甲酰胺，10mmol/LEDTA0.02% 澳酚藍(lán)）、30屋石蠟油，煮沸 5min,取出立刻放入冰浴中2min以上，然后將水相全部上樣，10-15 C下 電泳.開始在300V電壓下電泳 5min,然后 在120V電泳8h,取下凝膠，將其浸在含 0.5ug/ml澳化錠的IXTbE緩沖 液中染色30-45min ，在紫外燈下觀察，或進(jìn)行銀染.3）銀染法將 PAG 板用去離子

9、水洗二次，浸入10%乙醇和0.5%冰醋酸溶液固定6min. 用去離子水洗二次， 再浸入 0.2%AgNO3 溶液中 10min. 用去離子水洗3-5 次 ，然 后浸 入 1.5%NaOH 和 0.4%甲 醛溶液 中顯 色 7min. 最后， 用 0.75%NaCO3 終止顯色.4、 SSCP 的應(yīng)用自從 Orita 等用 SSCP 進(jìn)行人類DNA 多態(tài)性分析以來，該方法大量地用于檢測和腫瘤發(fā)生有關(guān)的基因突變，例如檢測星形細(xì)胞瘤、腦瘤、小細(xì)胞肺癌、胃癌、腸癌等腫瘤中的P53 基因的突變、肺癌的ras 基因突變等.最近 Sugano 等用銀染色SSCP 法， 成功地檢測了 c-Ki-ras2 基因

10、第 12 位的突變，電泳和銀染色過程在2.5 小時內(nèi)完成.SSCP 還用于檢測引起人類遺傳性疾病的研究上，如在囊性纖維化中起作用的CFTR 基因、 神經(jīng)纖維瘤1型基因、 家族性結(jié)腸息肉基因的研究中.最近，Sharkar 等用 RNA-SSCP 法檢測了 28 名 b 型血友病患者的凝血因子IX 的基因序列，并與DNA-SSCP 和直接基因測序法進(jìn)行了比較， 發(fā)現(xiàn)在全長2.6kbP 的凝血因子IX 基因組中，有 20 處堿基點(diǎn)突變，RNA-SSCP 可檢測 出其中的70%，而 DNA-SSCP 只能檢測出35%，顯示了RNA-SSCP 比 DNA-SSCP 有更高的靈敏性 .#P#分頁標(biāo)題#e#

11、SSCP 法除大量地用于基因突變的檢測外，還用于病毒的分型、監(jiān)測PCR實(shí)驗(yàn)中的污染情況、以及病原體傳播途徑的研究中.YaP 用巢式 PCR 對來自不同國家和地區(qū)的 HbV標(biāo)品進(jìn)行了檢測，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了 SSCP分析， 發(fā)現(xiàn)每個標(biāo)本的SSCP 圖譜完全不同，不 僅證明了HbVDNA 具有地區(qū)性變異，而且排除了交* 性污染的可能性，為保證PCR 診斷 結(jié)果的可靠性找到了好方法.另外，YaP 等還將 SSCP 用于 DNA 定量分析上，他們將 SSCP與競爭性PCR法相結(jié)合進(jìn)行乳腺癌細(xì)胞突變P53基因的定量分析，并取得了初步成功. 該方法的優(yōu)點(diǎn)在于，內(nèi)標(biāo)和待測DNA 只有一個堿基不同，這樣使內(nèi)標(biāo)

12、和待測DNA 有相同 的擴(kuò)增條件，從而更準(zhǔn)確地測出DNA 的量 .從以上可以看出，SSCP 正在分子生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著巨大的作用.5、 SSCP 注意的事項(xiàng)SSCP 是一種快速、簡便、靈敏的檢測基因突變的方法，為了使SSCP達(dá)到最佳效果，應(yīng)注意下列事項(xiàng).重復(fù)性.影響 SSCP 重復(fù)性的主要因素為電泳的電壓和溫度.這兩個條件保持不變，SSCP 圖譜可保持良好的重復(fù)性.一般SSCP 圖譜是二條單鏈DNA 帶，但有時有的DNA 片段 可能只呈現(xiàn)一條SSDNA 帶，或者三條以上，這主要是由于兩條單鏈DNA 之間存在相似的立體構(gòu)象.有時三條以上的 SSCP 圖譜是由于野型DNA 片段和突變型DNA 片段共

13、同存在的結(jié)果 .靶 DNA 序列長度的影響在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SSCP 對短鏈 DNA 或 RNA 的點(diǎn)突變檢出率要比長鏈的高， 這可能是由于長鏈DNA 和 RNA 分子中單個堿基的改變在維持立體構(gòu)象中起的作用較小的緣故.而有人認(rèn)為在DNA 鏈較短的 （400bP 以下）情況下，DNA 的長度不會影響SSCP 的效果.他們仔細(xì)選擇了實(shí)驗(yàn)條件，發(fā)現(xiàn)354bP 的 DNA 中點(diǎn)突變的檢出率仍可達(dá)到90%以 上 .電泳電壓和溫度的影響: 為了使單鏈DNA 保持一定的穩(wěn)定立體構(gòu)象，SSCP 應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行（一般4-15之間）.在電泳過程中除環(huán)境溫度外，電壓過高也是引起溫度升高的主要原因，因此，在沒有冷卻裝

14、置的電泳槽上進(jìn)行SSCP 時，開始的5min 應(yīng)用較 高的電壓（250V） ，以后用100V左右電壓進(jìn)行電泳.這主要是由于開始的高電壓可以使不同立體構(gòu)象的單鏈 DNA 初步分離，而凝膠的溫度不會升高.隨后的低電壓電泳可以使之進(jìn)一步分離.在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件確定電泳電壓. DNA 片段中點(diǎn)突變的位置對SSCP 的影響點(diǎn)突變在DNA 和 RNA 中的位置對SSCP 檢測率的影響， 取決于該位置對維持立體構(gòu)象作用的大小，而不是僅僅取決于點(diǎn)突變在DNA 鏈 上的位置（有人認(rèn)為點(diǎn)突變在DNA 鏈中部要比在近端部容易被SSCP 檢測出來）.White 曾 設(shè)計了一組樣品DNA片段，并將其中的點(diǎn)突變設(shè)

15、在DNA 鏈的中部，而且該點(diǎn)又正處在發(fā)夾結(jié)構(gòu)頂端的環(huán)上，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SSCP 只能檢測出9 個樣品中的2 個 （檢出率為22%），說明DNA 鏈中任何部位的突變，只要對其單鏈立體構(gòu)象沒有影響，都有可能被漏檢. SSCP 的結(jié)果斷定:由于在 SSCP 分析中非變性PAG 電泳不是根據(jù)單鏈 DNA 分子和帶電量的大小來分離的，而是以單鏈DNA 片段空間構(gòu)象的立體位阻大小來實(shí)現(xiàn)分離的，因此，這種分離不能反映出分子量的大小.有時正常鏈與突變鏈的遷移率很接近，很難 看出兩者之間的差別.因此一般要求電泳長度在16-18cm 以上，以檢測限為指標(biāo)來判定結(jié)果. 檢測限是指突變 DNA 片段與正常DNA 片段可分辨

16、的電泳距離差的最小值.大于檢 測限則判定鏈的遷移率有改變，說明該DNA 序列有變化，小于檢測限則說明鏈之間無 變化.例如，一般檢測限定為 3mm,那么當(dāng)兩帶間距離在 3mm以上， 則說明兩鏈之間有改變 .另外檢測限不能定的太低，否則主觀因素太大，易造成假陽性結(jié)果.另外， SSCP 分析中其它條件，如PCR 產(chǎn)物的上樣量，PAG 的交聯(lián)度、以及膠的濃度等，都應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇確定.總之，SSCP 分析法是一種快速、簡便、靈敏的突變檢測方法，適合臨床實(shí)驗(yàn)室的要求.它可以檢測各種點(diǎn)突變，短核甘酸序列的缺失或插入 .隨著SSCP分析不斷完善，它將成為基因診斷研究的一個有力工具PCR-SSCP 技術(shù)

17、哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 實(shí)驗(yàn)原理聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) - 單 鏈 構(gòu) 象 多 態(tài) （ Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism , PCR-SSCP）技術(shù)是在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上 發(fā)展起來的，它是一種簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的用來顯示在PCR 反應(yīng)產(chǎn)物中單堿基突變（點(diǎn)突變）的手段。該方法已被用做癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測，遺傳病的致病基因分析和基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域。在 SSCP 測定中，雙鏈DNA（ dsDNA） 被變性成為單鏈DNA（ ssDNA） ，每一條單鏈DNA 都基于它們的內(nèi)部序列而呈現(xiàn)出一種獨(dú)有

18、的折疊構(gòu)象，即使同樣長度的DNA 單鏈因其堿基順序不同、甚至單個堿基的不同會形成不同的構(gòu)象。這些單鏈DNA 在非變性條件下，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，單鏈DNA 的遷移率和帶型，都取決于其折疊構(gòu)象和電泳時的溫度。試劑與材料1 樣本 DNA（ 100 ng/ml ） 、 MTHFR 上下游引物（ 5 pmol/ml ） 、 Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10 x PCR 反應(yīng)緩沖液、4XdNTPs （2.5 mmol/L ）、30%丙 烯酰胺（交聯(lián)度49:1）、5XTBE緩沖液、10%過硫酸錢（現(xiàn)用現(xiàn)配）、TEMED、 甲酰胺上樣緩沖液、固定液、銀染液、顯色液。2微量加樣器、PCR

19、 自動熱循環(huán)儀、聚丙烯酰胺凝膠電泳裝置。實(shí)驗(yàn)步驟一、 PCR 反應(yīng)20 ml 反應(yīng)體系成分如下：模板 DNA ( 100 ng/ml )1 ml10 X PCR反應(yīng)緩沖液2 mlTaq DNA 聚合酶(5 U/ml )0.2 ml4X dNTPs (2.5 mmol/L )1 mlMTHFR 上下游引物各 1 mlddH2O 加至終體積20 mlmmwmmmmwWmmmmmmmmwmwWwwmwmwmmmmmmmmmmwwmmmmmmPCR 反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 5 min ；94 c 30 s、62 c 50 s、72 c 90 s,共 30 個循環(huán)；72 7 min 。反應(yīng)結(jié)束后，置4保存。二、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳