培養(yǎng)基配制及適用性檢查標準操作規(guī)程

1、文件名稱培養(yǎng)基配制及適用性檢查標準操作規(guī)程文件編號SMP-10-QC-009版 本 號00起草部門質量控制部審核部門批 準 人起 草 人審 核 人批準日期起草日期審核日期生效日期頒發(fā)部門質量控制部分 發(fā) 號分發(fā)部門質量保證部 質量控制部 目的： 建立培養(yǎng)基配制及適用性檢查的標準操作規(guī)程，規(guī)范實驗人員的操作流程。范圍： 適用于微生物檢驗人員對培養(yǎng)基的規(guī)范管理。依據(jù)：藥品生產(chǎn)質量管理規(guī)范（2010年修訂）、中華人民共和國藥典2015年版第四部職責：1.微生物檢驗員：負責實驗室所需求的培養(yǎng)基管理工作，使日常檢驗可以順利進行。2.微生物檢驗主管：負責對日常配制培養(yǎng)基的規(guī)范操作進行監(jiān)督。內(nèi)容1 培養(yǎng)基的

2、申購 根據(jù)檢驗項目、工作量和工作進度的需求，提前一個月進行所需的培養(yǎng)基申購。申購時需指定培養(yǎng)基供應商，必要時進行供應商審計。2 培養(yǎng)基的驗收2.1 培養(yǎng)基到貨后，微生物室檢驗員應進行驗收。驗收內(nèi)容包括核對品名、數(shù)量、規(guī)格、生產(chǎn)廠商，應與申購單一致；檢查培養(yǎng)基包裝有無破損、包裝是否完整、產(chǎn)品是否在有效期內(nèi)。2.2 驗收合格后，登記于培養(yǎng)基領用臺賬（附記錄文件編號：SMP-10-QC-009-02（00）。3 培養(yǎng)基的貯藏3.1未開封的脫水培養(yǎng)基貯存于陰涼室，使培養(yǎng)基處于低溫、干燥、和避光條件下。已開封的脫水培養(yǎng)基應蓋緊，貯存于陰涼庫。3.2滅菌好的培養(yǎng)基應進行預培養(yǎng)72h檢查無菌后，置48冷藏保

3、存待用。滅菌后培養(yǎng)基儲存期為7天。4 培養(yǎng)基的配制4.1培養(yǎng)基的配制和使用應填寫 培養(yǎng)基配制及使用記錄（附記錄文件編號：SMP-10-QC-009-02（00）。4.2培養(yǎng)基配制批號原則：原材料批號-配制日期：比如2011年1月1日配制的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基干粉批號000000，配制批號為:000000-110101。配制好的培養(yǎng)基貼培養(yǎng)基標簽（附記錄文件編號：R-SMP-10-QC-009-03）。（注：同一天同一培養(yǎng)基配置多次的，在原批號后加“-”加“數(shù)字”表示，如000000-110101-01）4.3培養(yǎng)基配制方法 4.3.1 使用商品化脫水合成培養(yǎng)基時，應嚴格按照廠商提供的使用說明配制，如

4、重量/體積、pH、滅菌條件和操作步驟等。實驗室使用各種基礎成分制備培養(yǎng)基時，應按照配方準確配制，并記錄相關信息如：培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級別，每個成分物質含量、制造商、批號，pH值，培養(yǎng)基體積/分裝體積，滅菌條件（滅菌方式、溫度及時間），配制日期、人員等，以便溯源。4.3.2 水、容器具要求：培養(yǎng)基配制均采用純化水，特殊說明時采用去離子水和蒸餾水。培養(yǎng)基配制所用容器和配套器具應潔凈。對熱敏感的培養(yǎng)基如糖發(fā)酵培養(yǎng)基其分裝容器應先進行預滅菌，以保證培養(yǎng)基的無菌性。4.3.3 稱量與分裝： 快速稱量所需量的脫水合成培養(yǎng)基（必要時佩戴口罩或在通風柜中操作，以防吸入含有有毒物質的培養(yǎng)基粉末）。以免吸潮。

5、先加入適量的水，充分混合。注意避免培養(yǎng)基結塊，然后加水至所需的量。根據(jù)說明書要求選擇是否加熱。分裝體積不超過容器體積的2/3。配制斜面等含瓊脂的培養(yǎng)基也需加熱煮沸至完全溶解后分裝。4.4 pH 值的測定和調(diào)整 pH值采用pH計進行檢測，溫度25±2。取配后培養(yǎng)基10ml進行滅前pH測定。另取20ml于50ml三角瓶與同批配制培養(yǎng)基同時滅菌冷卻至25±2檢測滅后PH。滅菌前后pH應按下表進行控制。滅菌前可使用濃度約為40g/L（約1mol/L）的氫氧化鈉溶液或濃度約為36.5g/L（約1mol/L）的鹽酸溶液進行緩慢調(diào)整，避免反復調(diào)整而增加離子濃度。滅菌后培養(yǎng)基不符合標準時視

6、為不合格，不進行使用。4.5 培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基和試劑應采用濕熱滅菌法或過濾除菌法。 濕熱滅菌在高壓滅菌鍋或蒸汽滅菌柜中進行，容器具若需濕熱滅菌時，滅菌條件為121滅菌30 min。培養(yǎng)基嚴格按說明書條件進行滅菌。培養(yǎng)基滅菌后應立即取出，不得存放于高壓滅菌器中。5 培養(yǎng)基的質量控制 5.1計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查5.1.1菌種及菌液制備 菌種：試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查和計數(shù)方法適用性試驗用菌株見表1。 菌液制備：按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取金黃色葡萄球菌、銅綠假單

7、胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)1824小時，取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10-7， 分取各菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數(shù)，取小于100CFU/ml的菌液備用；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25培養(yǎng)23天。取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀釋至10-7，取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基25ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數(shù)，

8、取小于100CFU/ml的菌液備用；取黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基，經(jīng)25培養(yǎng)57天，加入35ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10-7， 分取各菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數(shù)，取小于100CFU/ml的菌液備用。 菌液制備后若在室溫下放置，應在2 小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在28 ,在驗證過的貯存期

9、內(nèi)使用。5.1.2 陰性對照 為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調(diào)查。5.1.3培養(yǎng)基適用性檢査 微生物計數(shù)用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基適用性檢查。 按表1 規(guī)定，接種不大于l00cfu的菌液至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板，置表1 規(guī)定條件下培養(yǎng)。每一試驗菌株平行制備2管或2個平皿。同時，用相應的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進行上述試驗。被檢固體培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)與對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的比值應在0.52 范圍內(nèi)，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌

10、落一致；被檢液體培養(yǎng)基管與對照培養(yǎng)基管比較，試驗菌應生長良好。表1 試驗菌液的制備和使用試驗菌株試驗菌液的制備計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查計數(shù)方法適用性試驗需氧菌總數(shù)計數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)需氧菌總數(shù)計數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)CMC C(B ) 26 003胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度303 5 ，培養(yǎng)時間1 824小時胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035, 培養(yǎng)時間不超過3 天， 接種量不大100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度3035, 培養(yǎng)時間不超過3

11、天，接種量不大于l00cfu銅綠假單胞菌 (Pseudomonas aeruginosa) CMCC ( B ) 10 104胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間1 824小時 胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基， 培養(yǎng)溫度303 5，培養(yǎng)時間不超過3 天，接種量不大于l00cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN 法），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天，接種量不大于l00cfu枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis)CMCC(B)63 501胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間18 -24

12、小時胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30-35，培養(yǎng)時間不超過3天，接種量不大于100cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（MPN法），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天，接種量不大l00cfu白色念珠菌 (Candida albicans) CMCC(F)98 001沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間2 3天胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（MPN 法不適用），培養(yǎng)溫度

13、3035，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于100cfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2.025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu黑曲霉（Aspergillusniger) CMCC (F ) 98 003沙氏葡萄糖瓊 脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間57天，或直到獲得豐富的孢子胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035 ，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于lOOcfu沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（MPN法不適用），培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu沙氏葡萄糖

14、瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2 025，培養(yǎng)時間不超過5天，接種量不大于l00cfu5.2控制菌檢查用培養(yǎng)基適用性檢查5.2.1 菌種及菌液制備 菌種：試驗用菌株的傳代次數(shù)不得超過5 代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0 代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。 菌液制備：按表1規(guī)定程序培養(yǎng)各試驗菌株。取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)1824小時，取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀釋至10-7，分取各菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注胰酪大豆胨瓊脂

15、培養(yǎng)基20ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數(shù)，取小于100CFU/ml的菌液備用；取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25培養(yǎng)23天。取上述培養(yǎng)物1ml加入9ml 0.9無菌氯化鈉溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀釋至10-7，取菌懸液1ml注入平皿中，立即傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml，各菌懸液平行制備兩個平皿，平皿法培養(yǎng)計數(shù)，取小于100CFU/ml的菌液備用； 菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內(nèi)使用；若保存在28，可在24小時內(nèi)使用。2.1.3 陰性對照 為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進

16、行偏差調(diào)查。2.2 培養(yǎng)基適用性檢查控制菌檢查用的成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應進行培養(yǎng)基的適用性檢查。控制菌檢査用培養(yǎng)基的適用性檢查項目包括促生長能力、抑制能力及指示特性的檢查。各培養(yǎng)基的檢查項目及所用的菌株見表1。表1 控制菌檢査用培養(yǎng)基的促生長能力、抑制能力和指示特性控制菌檢查培養(yǎng)基特性試驗菌株耐膽鹽革蘭陰性菌腸道菌增菌液體培養(yǎng)基紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示特性大腸埃希菌、銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌、銅綠假單胞菌大腸埃希菌麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示特性大腸埃希菌金黃色葡萄球菌大腸埃希菌沙門菌

17、R V 沙門菌增菌液體培養(yǎng)木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基促生長能力抑制能力促生長能力+指示特性指示能力乙型副傷寒沙門菌金黃色葡萄球菌乙型副傷寒沙門菌乙型副傷寒沙門菌白色念珠菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基念珠菌顯色培養(yǎng)基促生長能力促生長能力+指示特性促生長能力+指示能力抑制能力白色念珠菌白色念珠菌白色念珠菌大腸埃希菌2.2.1 液體培養(yǎng)基促生長能力檢査 分別接種不大于100cfu的試驗菌(表1)于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應生長良好。2.2.2 固體培養(yǎng)基促生能力檢査

18、 用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1 )于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基與對照培養(yǎng)基上生長的菌落大小、形態(tài)特征應一致。2.2.3 培養(yǎng)基抑制能力檢査 接種不少于l00cfu的試驗菌（表1)于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應控制菌檢査規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不小于規(guī)定的最長培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，試驗菌應不得生長。2.2.4 培養(yǎng)基指示特性檢査 用涂布法分別接種不大于100cfu的試驗菌（表1 )于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平板上，在相應控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，被檢培養(yǎng)基上試驗菌生長的菌落大小、

19、形態(tài)特征、指示劑反應情況等應與對照培養(yǎng)基一致。6培養(yǎng)基銷毀失效、檢測用過培養(yǎng)基（無論是否有菌生長）均按廢物進行高壓蒸汽滅菌處理。參照實驗室廢棄物管理規(guī)程（文件編號：SMP-10-QC-014（00）。相關文件：文件名稱文件編號檢定菌管理規(guī)程SMP-10-QC-010實驗室廢棄物管理規(guī)程SMP-10-QC-014（00）相關記錄：記錄名稱記錄編號培養(yǎng)基登記臺賬R-SMP-10-QC-009-01培養(yǎng)基配制及使用記錄R-SMP-10-QC-009-02培養(yǎng)基配制標簽R-SMP-10-QC-009-03計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查報告R-SMP-10-QC-009-04計數(shù)培養(yǎng)基適用性數(shù)據(jù)記錄R-SMP-10-QC-009-05控制菌培養(yǎng)基適用性測試記錄R-SMP-10-QC-009-06控制菌培養(yǎng)基適用性檢查報告R-SMP-10-QC-009-07文件變更歷史：文件修訂及變更原因生效日期文件編號版本號新修訂。SMP-10-QC-00900培 養(yǎng) 基 領 用 臺 賬R-SMP-10-QC-009-01(00)培養(yǎng)基名稱供應商進廠編號規(guī)格安全庫存量日期批號入庫量領用數(shù)量剩余庫存領用人管理人備注 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日 年 月 日