水解酶的催化多功能性和串聯(lián)方法的研究論文

1、 .碩 士 學(xué) 位 論 文論文題目: 水解酶的催化多功能性與其串聯(lián)方法的研究作者 香 指導(dǎo)教師 林 賢 福 教 授 學(xué)科(專業(yè)) 應(yīng) 用 化 學(xué) 所在學(xué)院 理 學(xué) 院 提交日期 2011 年 1 月 107 / 120碩士學(xué)位論文水解酶的催化多功能性與其串聯(lián)方法的研究作 者： 香導(dǎo) 師：林賢福 教授二一一年一月中國 M. S. DissertationStudy on the Catalytic Promiscuityof Hydrolase and Tandem Reaction Author: Xiang ChenAdvisor: Prof. Xianfu Lin Chemistry De

2、partment, Zhejiang UniversityJan 2011HangzhouChina附件3：獨(dú)創(chuàng)性聲明與版權(quán)使用授權(quán)書獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作與取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得 大學(xué) 或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示意。 學(xué)位論文作者簽名： 簽字日期：學(xué)位論文使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解 大學(xué) 有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)

3、印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán) 大學(xué) 可以將學(xué)位論文的全部或部分容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。 （的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書） 學(xué)位論文作者簽名： 導(dǎo)師簽名： 簽字日期： 簽字日期： 學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向： 工作單位： ： 通訊地址： ：摘要酶催化有機(jī)合成方法的研究越來越受化學(xué)家關(guān)注，探索酶催化的新功能，調(diào)控酶促反應(yīng)，通過酶催化多功能性來設(shè)計(jì)串聯(lián)反應(yīng)新方法新途徑；為化學(xué)的綠色合成提供更有價(jià)值的新思路、新技術(shù)。論文研究了脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的新功能，考察了反應(yīng)條件，包括反應(yīng)時(shí)間、酶源、溶劑、底物的比例

4、、酶濃度、溫度、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的影響，合成了15種吲哚衍生物。并通過無酶，BSA與失活的PPL來驗(yàn)證酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。論文研究了脂肪酶催化的親核加成-消去-Michael加成串聯(lián)反應(yīng)的新功能，考察了酶源、反應(yīng)介質(zhì)、混合溶劑的比例、酶濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化該串聯(lián)反應(yīng)的影響，結(jié)果表明：在水與二氧六環(huán)比例為4/1的混合溶劑中，脂肪酶PPL可以催化醛與吲哚的串聯(lián)反應(yīng)，合成了26種雙分子吲哚衍生物。論文研究了N-雜環(huán)化合物添加對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控作用。發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶與咪唑質(zhì)量比為2/1時(shí)，?；傅拇呋疌laisen-Schm

5、idt活性顯著提高。并通過無酶無咪唑、BSA和咪唑、單酶與單咪唑催化來證實(shí)酶活性中心和咪唑的共同的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。同時(shí)考察了酶源、溶劑、添加劑、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)酰化酶與咪唑催化反應(yīng)的影響；并合成了18種, -不飽和羰基化合物。論文通過調(diào)控?；概c咪唑共同催化催化芳香醛與酮的Aldol縮合-消去-Michael加成-分子Aldol縮合-消去串聯(lián)反應(yīng)活性，合成了15種新穎的環(huán)己烯酮衍生物?？疾炝朔磻?yīng)條件：酶源、溶劑、添加劑、酶與添加劑的比例、底物結(jié)構(gòu)對(duì)酰化酶與咪唑催化串聯(lián)Aldol縮合-消去-Michael加成-分子Aldol縮合-消去反應(yīng)的影響，并提出了可能的反應(yīng)機(jī)理。本論文

6、總共合成了74種化合物，產(chǎn)物經(jīng)IR，1H-NMR, 13C-NMR，GC-MS，HRMS等手段表征分析和驗(yàn)證。關(guān)鍵詞：脂肪酶、?；浮⒋?lián)反應(yīng)、多功能性、共同催化。AbstractEnzyme catalysis in organic synthesis had drawn an increasing number of chemists attention. Explore new function of enzymes; regulate enzymatic reaction; design a new tandem reaction base on the promiscuity of

7、enzym, providing more valuable, new ideas and new technologies for green chemistry.Lipase was firstly found to catalyze the Friedel-Craft reaction in water. After screening the reaction time, enzyme sources, reaction media, the molar ratio of substrate, temperature and the structure of substrates, l

8、ipase fromporcine pancreas, Type II (PPL) catalyzed the Friedel-Craft reaction of indole derivative and , -unsaturated compounds. 15Fridel-Craft adducts were synthesized.Thecontrol experiments proved that the active site of PPL were responsible for those enzymatic reaction. The mechanisms for the Fr

9、iedel-Craft reaction and tandem reaction catalyzed by PPL werealso proposed.We screening the PPL catalyze the tandem Nucleophilic addition/dehydration /Michael addition of aldehyde and indole. The enzyme sources, reaction media, temperature, the structure of substrate that affects this tandem reacti

10、on were investigated systemly. In mixture solvent (water/dioxane=4/1), lipase (from porcine pancreas, Type II) can catalyze the tandem Nucleophilic addition/dehydration /Michael addition between aldehydes and indole derivatives. After the stepwise process were optimized, 26 bis(indolyl)alkanes were

11、prepared in moderate to excellent yields by using PPL as catalyst.The influence of N-heterocyclic compounds on the enzymatic reaction was investigated. Though investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found D-aminoacylase and imidazole can co-catalyze th

12、e Claisen-Schmidt reaction. When the ratio of D-aminoacylase and imidazole is 2/1, the activity of D-aminoacylase was improved obviously. And 18 tandems Aldol condensation/dehydration adducts were obtained via this method. Thecontrol experiments demonstrated that the active site of D-aminoacylase wa

13、s responsible for theenzymatic reaction. The mechanism for the Claisen-Schmidt reaction catalyzed by D-aminoacylase and imidazolewasalso proposed.A single enzyme can co-catalyze the cascade Aldol condensation-elimination -Michael-intromolecularAldolcondensation-eliminationfor synthesis of conjugate

14、cyclohexanone-2-ene reaction with imidazole in octane. By investigating enzyme sources, solvent, additive, the ratio of imidazole and acylase, we found D-aminoacylase and imidazole can co-catalyze this tandem reaction. After the stepwise process was optimized, 15 conjugate cyclohexanone-2-enes were

15、prepared. Some control experiments were designed to prove that the enzyme canco-catalyze this cascade reaction with imidazole in octane. The mechanism for the tandem reaction catalyzed by D-aminoacylase and imidazolewasalso proposed.In this thesis, 74 compounds were synthesized and these compounds w

16、ere characterized by IR, 1H NMR, 13C NMR, GC-MS andHRMS.Keywords: lipase; acylase;tandem;multifunction;co-catalyze.目錄獨(dú)創(chuàng)性聲明i摘要iiAbstractiii第一章 緒論11.1 酶催化多功能性的研究11.2 酶催化多組分串聯(lián)反應(yīng)11.3 小分子對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控21.4 本論文的研究目的與容2第二章 酶催化多功能性與酶催化串聯(lián)方法研究進(jìn)展42.1 酶的催化多功能性42.1.1 脂肪酶的催化多功能性42.1.2 蛋白酶的催化多功能性72.1.3 酰化酶催化加成反應(yīng)72.1.4 酯

17、酶催化氧化反應(yīng)92.1.5 轉(zhuǎn)氨酶的催化多功能性102.1.6 其他酶的催化多功能性102.2 酶促串聯(lián)反應(yīng)112.2.1單酶催化串聯(lián)反應(yīng)122.2.2 多酶催化串聯(lián)反應(yīng)142.2.3化學(xué)/酶促法催化串聯(lián)反應(yīng)182.3小分子對(duì)酶的催化的調(diào)控222.3.1小分子對(duì)酶促化學(xué)選擇性調(diào)控222.3.2小分子對(duì)酶的區(qū)域選擇性調(diào)控232.3.3小分子對(duì)酶的立體選擇性調(diào)控24第三章 水解酶催化Friedel-Craft反應(yīng)與其串聯(lián)反應(yīng)303.1 實(shí)驗(yàn)部分303.1.1 實(shí)驗(yàn)試劑303.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法313.1.3 合成Friedel-Crafts產(chǎn)物的表征323.1.4 合成雙分子吲哚衍生物的表征3

18、53.2脂肪酶催化Friedel-Craft反應(yīng)393.2.1引言393.2.2 水解酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)403.2.3 酶源對(duì)Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的影響413.2.4 脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的條件優(yōu)化423.2.5脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物443.2.6脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)機(jī)理模型473.3 脂肪酶催化醛與吲哚衍生物的串聯(lián)反應(yīng)483.3.1引言483.3.2 水解酶催化雙分子吲哚與醛的串聯(lián)反應(yīng)483.3.3 酶源對(duì)吲哚與對(duì)硝基苯甲醛串聯(lián)反應(yīng)的影響503.3.4 反應(yīng)條件對(duì)水解酶催化吲哚與醛串聯(lián)反應(yīng)

19、的影響503.3.5脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物533.3.6脂肪酶催化合成氮雜環(huán)衍生物機(jī)理模型563.4 本章小結(jié)58第四章 D-氨基酰化酶與N-雜環(huán)催化Claisen-Schmidt反應(yīng)614.1引言614.2 實(shí)驗(yàn)部分624.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑624.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法634.2.3 咪唑與D-氨基?；复呋疌laisen-Schmidt反應(yīng)644.3酶源對(duì)Claisen-Schmid反應(yīng)的影響684.4酰化酶與N-雜環(huán)化合物催化Claisen-Schmidt反應(yīng)的條件優(yōu)化684.4.1 有機(jī)溶劑對(duì)Claisen-Schmidt反應(yīng)的影響694.4.2 添加劑對(duì)Claisen-Schmi

20、dt反應(yīng)的影響694.4.3 添加劑與酶的比例對(duì)Claisen-Schmidt反應(yīng)的影響704.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)Claisen-Schmidt反應(yīng)的影響714.4.5 優(yōu)化后的?；复呋疌laisen-Schmidt反應(yīng)條件724.5 N-雜環(huán)化合物調(diào)節(jié)?；复呋铣? -不飽和羰基化合物724.5.1受體結(jié)構(gòu)對(duì)Claisen-Schmidt反應(yīng)的影響724. 5.2供體結(jié)構(gòu)對(duì)于Claisen-Schmidt反應(yīng)的影響734.6 ?；概c咪唑催化Claisen-schmidt反應(yīng)的機(jī)理744.6.1 酶活性中心催化驗(yàn)證744.6.2 反應(yīng)機(jī)理754.7 本章小結(jié)76第五章 酰化酶催化醛酮多步

21、串聯(lián)合成環(huán)己烯酮衍生物785.1引言785.2 實(shí)驗(yàn)部分795.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑795.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與方法805.2.3 D-氨基?；概c咪唑催化串聯(lián)反應(yīng)合成環(huán)己烯酮衍生物815.2.4 合成化合物的表征835.3 催化劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響865.3.1酶源對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響865.3.2 添加劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4 試驗(yàn)條件對(duì)該串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4.1 有機(jī)溶劑對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響875.4.2 丙酮的量對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響885.4.3 添加劑與酶的比例對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響885.4.4 優(yōu)化后的?；复呋┩?lián)反應(yīng)的條件895.5 N-雜環(huán)化合物調(diào)節(jié)酰化酶催化合成

22、環(huán)己烯酮衍生物905.5.1受體結(jié)構(gòu)對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響905. 5.2供體結(jié)構(gòu)對(duì)醛酮串聯(lián)反應(yīng)的影響915.6 酰化酶與咪唑催化醛酮串聯(lián)反應(yīng)的機(jī)理假設(shè)925.6.1 酶活性中心催化驗(yàn)證925.6.2 反應(yīng)機(jī)理925.7 本章小結(jié)93第六章 總結(jié)95攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文97致 98第一章 緒論酶作為一種高效的、對(duì)環(huán)境友好的催化劑已經(jīng)越來越廣泛地應(yīng)用于有機(jī)合成1a-f。對(duì)酶促反應(yīng)的研究也逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槊复俚亩喙δ苄院驼{(diào)控酶促反應(yīng)。酶促一鍋法和酶促串聯(lián)反應(yīng)也逐漸成為研究的熱點(diǎn)。1.1 酶催化多功能性的研究酶的催化多功能性在最近十年研究的新進(jìn)展，Berglund和 Gotor等人分別報(bào)道了脂肪酶CA

23、L-B具有催化碳-碳鍵2和碳-氮鍵Michael3加成反應(yīng)新功能。Kita、Hult和余孝其課題組又發(fā)現(xiàn)水解酶除催化酯鍵或者酰胺鍵的合成與水解外，還可以催化胺解反應(yīng)4、羥醛縮合反應(yīng)5a-b、Diels-Alder6和Mannich 7等；我們課題組也發(fā)現(xiàn)碳-氮鍵Michael8a-b加成反應(yīng)可以被蛋白酶、D-氨基酸?；傅人饷复呋?、碳-碳Michael9加成反應(yīng)也可以被D-氨基酸?；复呋?、氮雜環(huán)與乙烯酯的Markovnikov10a-c加成反應(yīng)可以被?；窹GA、D-氨基酸酰化酶和Amano Acylase催化、醛與硝基烷烴的Henry11反應(yīng)也可以由D-氨基酸?；复呋纫幌盗行卢F(xiàn)象。不

24、斷研究探索酶催化多功能性的機(jī)理，深入認(rèn)識(shí)酶催化的性質(zhì)，這將大大促進(jìn)酶催化方法在綠色有機(jī)合成中應(yīng)用。1.2 酶催化多組分串聯(lián)反應(yīng)串聯(lián)反應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)從簡單的原料出發(fā)合成復(fù)雜的功能分子，酶聯(lián)合化學(xué)催化劑來催化串聯(lián)反應(yīng)是個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性方法。Kroutil12課題組利用金屬與酶的的組合來實(shí)現(xiàn)串聯(lián)的氧化與非對(duì)稱還原反應(yīng)。Huerta課題組13報(bào)道了-羥基酯化合物的動(dòng)力學(xué)拆分可以通過脂肪酶Pseudomonas cepacia和釕催化劑的組合來實(shí)現(xiàn)，得到較高的產(chǎn)率和ee值。酶促化學(xué)法即可以實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)動(dòng)力學(xué)拆分14a-c，又可以用于手性合成15a-b。利用酶具有催化多種反應(yīng)的功能，以多步串聯(lián)和一鍋轉(zhuǎn)化的方式來實(shí)

25、現(xiàn)多種生物活性化合物合成，這對(duì)有機(jī)合成方法學(xué)具有重要的意義。余孝其課題組報(bào)道了水解酶可以催化Mannich16反應(yīng)，脫羰基的aldol17反應(yīng)等。Klaas18課題組報(bào)道了水解酶CAL B可以催化脫保護(hù)，?；铜h(huán)氧化的多步串聯(lián)反應(yīng)。我們課題組也利用單酶催化合成一系列含糖咪唑衍生物19與復(fù)雜的咪唑-糖類復(fù)合物。在利用串聯(lián)來合成碳水類方面，多酶已經(jīng)展現(xiàn)出很大的優(yōu)勢和潛力。Ragauskas和Witayakran20也報(bào)道了苯并呋喃衍生物可以通過雙酶體系來合成。Wong21課題組與Richter22課題組通過控制各步反應(yīng)條件，利用多酶催化的功能來合成多種糖類衍生物。酶催化串聯(lián)反應(yīng)具有條件溫和，環(huán)境

26、友好等優(yōu)勢。因而，利用單酶或多酶來探索新反應(yīng)的組合將會(huì)是一個(gè)新的領(lǐng)域。1.3 小分子對(duì)酶促反應(yīng)的調(diào)控酶的結(jié)構(gòu)決定了酶的催化功能，一些酶與小分子存在著特殊的作用，從而能引起蛋白構(gòu)象的變化，添加劑的使用能夠調(diào)節(jié)酶催化的功能23,例如：化學(xué)選擇性調(diào)控、立體選擇性調(diào)控和區(qū)域選擇性調(diào)控。利用添加劑調(diào)控酶促反應(yīng)，是基因工程之外新途徑，為推動(dòng)酶催化合成的應(yīng)用提供更加可行辦法。1.4 本論文的研究目的與容本論文的研究目的是：通過研究酶的催化多功能性，認(rèn)識(shí)酶催化本質(zhì)，實(shí)現(xiàn)調(diào)控酶促反應(yīng)，并應(yīng)用于有機(jī)合成。為此，論文將圍繞以下容開展研究。研究了脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的新功能，考察了反應(yīng)條件

27、，包括反應(yīng)時(shí)間、酶源、溶劑、底物的比例、酶濃度、溫度、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化Friedel-Crafts烷基化反應(yīng)的影響。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了脂肪酶具有催化串聯(lián)的親核加成-消去-Michael加成反應(yīng)的新功能，考察了酶源、反應(yīng)介質(zhì)、混合溶劑的比例、酶濃度、溫度、反應(yīng)時(shí)間、底物結(jié)構(gòu)對(duì)脂肪酶催化該串聯(lián)反應(yīng)的影響。并通過無酶，BSA與失活的PPL來驗(yàn)證酶活性中心的催化作用，提出了可能的催化機(jī)理。研究N-雜環(huán)化合物對(duì)酰化酶催化多功能性的調(diào)控作用，考察酶源、有機(jī)溶劑、各種N-雜環(huán)化合物、N-雜環(huán)化合物與酰化酶的比例、催化劑的量、反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)酶催化功能的影響。建立添加劑與酶催化功能的關(guān)系，并將添加劑的調(diào)控作用應(yīng)

28、用于酰化酶催化Claisen-Schmidt和串聯(lián)的Aldol縮合-消去-Michael加成-分子Aldol縮合-消去反應(yīng)。通過控制實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證酶與添加劑共同起到催化作用，提出了反應(yīng)的機(jī)理。參考文獻(xiàn)1. (a) R. J Kazlauskas, Curr. Opin. Chem. Biol.,2005, 9, 195; (b) P Berglundand SPark, Curr. Org. Chem.,2005, 9, 325; (c) D. M. Z Schmidt, E. CMundorff,MDojka, E Bermudez, J. ENess, S Govindarajan, P. C

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35、 C. Yang, M C. Ko, J J. Liu, H Cho, D Q. Gao, M. Tong, H H. Tai, J H. Woods, C G. Zhan. J. Am. Chem. Soc.2008, 130, 12148;(b)G J. Williams, T. L Woodhall, M Farnsworth, A Nelson, A Berry. J. Am. Chem. Soc.2006, 128, 16238.16. K Li, T He, Ch Li, X. W Feng, N Wang and X. Q Yu, Green Chem., 2009, 6, 77

36、7.17. X W. Feng, Ch Li, N Wang, K Li, W W. Zhang, X Q. Yu. Green Chem., 2009, 11, 1933.18. M. Rusch gen Klaas, M. Kunz, S. Warwel, J. Mol. Catal. B: Enzym., 1999, 7, 283.19. S P. Yao, D S. Lu, Q Wu, Y Cai, S H. Xu, X F. Lin. Chem. Commun.2004, 2006. 20.S Witayakran, A J. Ragauskas. Eur. J. Org. Chem

37、.2009, 3, 358. 21. D Franke, T Machajewski, C C. Hsu, C H. Wong. J. Org. Chem.2003, 68, 6828. 22. W Rmisch, W Eisenreich, G Richter, A Bacher.J. Org. Chem.2002, 67, 8890. 23.(a) T Itoh, S H. Han, Y Matsushita, S Hayase. Green Chem.2004, 6, 437; (b) W Y. Lou, M H. Zong, H. Wu, R. Xu, J F. Wang. Green

38、 Chem.2005, 7, 500.第二章 酶催化多功能性與酶催化串聯(lián)方法研究進(jìn)展生物催化合成方法是當(dāng)前備受關(guān)注的前沿領(lǐng)域1a-c。它具有選擇性高、條件溫和、反應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，因而吸引了化學(xué)、化工、制藥、材料等眾多領(lǐng)域研究學(xué)者的興趣。酶一直被認(rèn)為是一種快速、專一且只對(duì)一定底物或一類反應(yīng)具有高度識(shí)別的生物催化劑。越來越多具有高立體選擇性的酶被廣泛應(yīng)用于多種有機(jī)化合物的合成中2a-c。最近的研究表明部分酶還具有催化多功能性，即許多酶能夠在主反應(yīng)的活性位點(diǎn)催化第二種反應(yīng)，而且越來越多的研究表明催化多功能性普遍存在。串聯(lián)反應(yīng)可以由簡單原料經(jīng)過多個(gè)化學(xué)鍵形成來得到目標(biāo)產(chǎn)物。該方法減少中間產(chǎn)物的分離步驟

39、，簡化反應(yīng)操作的過程。同時(shí)也能防止活潑或不穩(wěn)定中間產(chǎn)物在反應(yīng)體系中的累積，加快反應(yīng)速度，提高最終產(chǎn)物的得率，進(jìn)而得到一些常規(guī)方法難以合成的化合物。與分步反應(yīng)相比, 巧妙的串聯(lián)反應(yīng)不僅能提高反應(yīng)效率，具有高選擇性、原子經(jīng)濟(jì)性,大量減少浪費(fèi)，還能免去了各步后處理和分離帶來的消耗和污染。本章主要針對(duì)酶的催化多功能性研究、小分子調(diào)控酶促混亂性的研究以與單酶參與的串聯(lián)反應(yīng)在有機(jī)合成中的應(yīng)用與化學(xué)/酶促法催化串聯(lián)反應(yīng)。2.1 酶的催化多功能性酶的催化多功能性是指酶在其活性位點(diǎn)能夠催化不同化學(xué)反應(yīng)的能力，這些化學(xué)反應(yīng)可能在兩點(diǎn)上有所不同：(1)參與的官能團(tuán)，即反應(yīng)過程中形成或斷裂的鍵不同；(2)可能的催化機(jī)

40、理，即鍵形成或斷裂的過程不同。大多數(shù)催化多功能性的例子都包含以上兩點(diǎn)，酶的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和進(jìn)化過程中的不完美控制都可能賦予酶的新催化功能。2.1.1 脂肪酶的催化多功能性脂肪酶是一類來源比較廣泛，商業(yè)上易得的生物催化劑，目前有些脂肪酶催化的有機(jī)反應(yīng)已經(jīng)成功應(yīng)用于工業(yè)化的生產(chǎn)中。因此，對(duì)于脂肪酶的研究也備受關(guān)注3a-c，從而脂肪酶催化多功能性也不斷被報(bào)道出來。首次報(bào)道了酶促C-C鍵Michael加成反應(yīng)的是Berglund4課題組。他們將CAL B上105位的絲氨酸突變成丙氨酸，從而實(shí)現(xiàn)了CAL B快速催化1,3-二羰基化合物與, -不飽和羰基化合物的Michael加成反應(yīng)（如圖2-1）。由于突變?cè)鰪?qiáng)

41、了組氨酸奪取質(zhì)子的能力，從而很大程度上提高CAL B催化Michael加成反應(yīng)的效率，所以該反應(yīng)可以在10分鐘完成。圖2-1 CAL-B突變酶催化的1,3-二羰基化合物與,-不飽和羰基化合物的Michael加成反應(yīng)我們課題組研究發(fā)現(xiàn)CAL-B也可以催化C-S鍵的生成的新功能5。CAL-B能夠催化乙烯酯與硫醇的加成反應(yīng)來合成硫醚類的化合物。非常有趣的是硫醇的加成位置可以通過反應(yīng)的溶劑來調(diào)控（如圖2-2）。在異丙醚中，該反應(yīng)可以得到馬氏（Markovnikov）加成產(chǎn)物。然而當(dāng)該反應(yīng)在DMF中進(jìn)行時(shí)，CAL-B可以催化二者發(fā)生反馬氏（anti-Markovnikov）加成反應(yīng)。圖2-2 脂肪酶催化

42、硫醇與乙烯酯的反應(yīng)Berglund課題組還CAL B進(jìn)行深入的研究，他們提出了, -不飽和羰基化合物與硫醇Michael加成反應(yīng)的中間體6（圖2-3）。中間體為：氧穴可以結(jié)合底物中的羰基，組氨酸與天冬氨酸協(xié)同奪取質(zhì)子。通過化學(xué)計(jì)算表明絲氨酸會(huì)與組氨酸形成氫鍵，因而絲氨酸的存在會(huì)降低組氨酸與天冬氨酸協(xié)同奪取質(zhì)子的能力。根據(jù)這一理論，他們采取突變的方法來提高酶的催化效率。他們將催化中心的絲氨酸突變成丙氨酸，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示突變酶催化活性提高了60多倍。圖2-3 甲基硫醇與丙烯醛的Michael 加成反應(yīng)中計(jì)算的模型。Gotor課題組在對(duì)水解酶研究中，發(fā)現(xiàn)水解酶Chirazyme L-27可以催化二級(jí)胺

43、與丙烯腈的Michael加成反應(yīng)（圖2-4）。更有趣的是他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)環(huán)戊胺的活性要大于環(huán)己胺，而環(huán)己胺的活性要大于二乙胺的活性。圖2-4 水解酶催化二級(jí)胺與丙烯腈的Michael加成反應(yīng)。Berglund課題組還發(fā)現(xiàn)正己醛的羥醛縮合8反應(yīng)可以由CALB催化發(fā)生（圖2-5）。雖然這個(gè)反應(yīng)沒有立體選擇性，但它的非對(duì)映體選擇性與自發(fā)的反應(yīng)有很大的區(qū)別。實(shí)驗(yàn)事實(shí)證明，用丙氨酸代替絲氨酸后羥醛縮合反應(yīng)活性大約增加了2倍。這個(gè)反應(yīng)的機(jī)理與Michael加成類似，都是通過形成烯醇式中間體進(jìn)行的。圖2-5 水解酶催化正己醛的aldol反應(yīng)。Berglund和Brinck都報(bào)道了己醛或丙醛的aldol反應(yīng)可

44、以用CALB在環(huán)己烷中催化進(jìn)行 9a-b。將酶中丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸后，反應(yīng)的活性提高了4倍，但是這個(gè)反應(yīng)并沒有立體選擇性。針對(duì)脂肪酶催化aldol反應(yīng)立體選擇性的問題，余孝其課題組10在水相中研究了7 種脂肪酶催化含芳香醛與丙酮反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在豬胰脂肪酶PPL的催化下，該反應(yīng)可以得到一定手性的產(chǎn)物，其ee值為43%（圖2-6）。圖 2-6 水相中脂肪酶催化的羥醛縮合反應(yīng)我們課題組報(bào)道了在DMSO溶劑中，嘧啶類化合物與丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的碳氮鍵Michael加成反應(yīng)可以利用Amano Lipase M11來催化，合成了一系列的含有嘧啶乙烯酯衍生物（圖2-7）。Gotor12a-b課題組發(fā)現(xiàn)仲胺

45、與丙烯腈反應(yīng)可以用CALB在甲苯中催化進(jìn)行，結(jié)果顯示CALB具有很好的Michael加成活性。根據(jù)催化三聯(lián)體理論，他們提出了催化機(jī)理。酶中的組氨酸殘基和天冬氨酸殘基協(xié)同負(fù)責(zé)質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，催化中心的陰離子穴可以結(jié)合腈基用于穩(wěn)定過渡態(tài)。圖 2-7脂肪酶催化嘧啶與丙烯酰氧基丙酸乙烯酯的Michael加成反應(yīng) 2.1.2 蛋白酶的催化多功能性Lee13報(bào)道了在水相中糜蛋白酶可以先催化三甲氧基硅烷的水解，然后催化產(chǎn)物的縮合得到硅醚（圖 2-8）。圖 2-8 青霉素G ?；复呋膭e嘌醇與乙烯酯的Markovnikov 加成反應(yīng)我們課題組14a-c研究非水介質(zhì)酶促反應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在有機(jī)溶劑中，咪唑與丙烯酸甲酯的

46、Michael加成反應(yīng)可以用枯草桿菌蛋白酶進(jìn)行催化（圖 2-9）。研究表明，該蛋白酶具有廣泛的底物適應(yīng)性和結(jié)構(gòu)復(fù)雜性，如嘧啶類和嘌呤類，都能做為加成反應(yīng)的供體。在疏水性溶劑中，底物可以完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物。圖 2-9蛋白酶催化咪唑、嘧啶、嘌呤的 Michael加成反應(yīng) 2.1.3 酰化酶催化加成反應(yīng)我們課題組15在研究中發(fā)現(xiàn)別嘌醇與羧酸乙烯酯的反應(yīng)可以用青霉素 G ?；竵泶呋?，得到Markovnikov加成產(chǎn)物（圖 2-10），利用該酶能夠高效地催化別嘌醇和一系列不同結(jié)構(gòu)的乙烯酯發(fā)生Markovnikov加成反應(yīng)，我們還研究了乙烯酯結(jié)構(gòu)對(duì)酶促M(fèi)arkovnikov加成反應(yīng)的影響。接著通過考察空白、

47、失活酶、牛血清蛋白等催化對(duì)照實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證青霉素 G ?；傅幕钚灾行钠鸬酱呋饔?。但是令人感到意外的是，酶催化反應(yīng)并沒有立體選擇性。圖 2-10 青霉素 G?；复呋膭e嘌醇與乙烯酯的 Markovnikov 加成反應(yīng)我們還針對(duì)其他的酰化酶展開了研究，發(fā)現(xiàn)了碳-氮鍵的Markovnikov加成反應(yīng)可以用活性中心含有兩種鋅離子的D-氨基?；复呋M(jìn)行16a-b。嘧啶類、唑類、嘌呤類等氮雜環(huán)化合物都可以做該反應(yīng)底物，潛在生物活性的氮雜環(huán)衍生物可以利用D-氨基?；复呋铣傻玫?。我們同樣通過無酶、失活酶、牛血清蛋白催化與活性位點(diǎn)抑制的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明了Markovnikov加成是酶催化過程。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，

48、我們提出了?；复呋疢arkovnikov加成反應(yīng)可能的催化機(jī)理（圖 2-11）。首先，酶活性中心的一個(gè)鋅離子起到氧陰離子穴的作用，與乙烯酯中的羰基進(jìn)行配位，從而影響乙烯酯的碳碳雙鍵的電荷分布，進(jìn)而使得與氧相連的碳帶部分正電荷，羰基就被活化了，而這種正電荷更易于被親核進(jìn)攻；其次，酶催化中心的天冬氨酸殘基奪取氮原子上的質(zhì)子，形成親核試劑，再加成到乙烯酯的-碳上。這個(gè)機(jī)理中-碳上的負(fù)電荷被活性中心的鋅離子穩(wěn)定，天冬氨酸又作為質(zhì)子傳遞媒介完成反應(yīng)。圖 2-11D-氨基酰化酶催化的 Markovnikov 加成反應(yīng)的推測機(jī)理 我們還針對(duì)D-氨基?；刚归_了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)了D-氨基?；敢材艽呋?

49、碳鍵的Henry反應(yīng)17。一系列的硝基烷烴和醛可以做為該反應(yīng)底物，利用D-氨基?；复呋铣梢幌盗芯哂袧撛谏锘钚缘南趸衔铩Ｎ覀兺瑯油ㄟ^無酶、失活酶和牛血清蛋白催化的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明了Henry反應(yīng)是酶催化過程（圖 2-12）。圖 2-12 D-氨基?；复呋?-硝基苯甲醛與硝基乙烷的 Henry反應(yīng)依據(jù)D-氨基?；复呋疢arkovnikov加成反應(yīng)的機(jī)理，我們課題組推測鋅離子依賴型的?；高€應(yīng)該具有催化Michael加成的功能。我們進(jìn)而設(shè)計(jì)了一些試驗(yàn)來驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果正與我們的推測一致，氮雜環(huán)化合物與丙烯酸酯的碳-氮鍵的Michael加成反應(yīng)18可以利用D-氨基酸酰化酶做催化劑來實(shí)現(xiàn)，以與1

50、,3-二羰基化合物與共軛稀醛或稀酮的碳-碳鍵的Michael加成（圖 2-13）。圖 2-13 D-氨基酸?；复呋?1,3-二羰基化合物與 ,-不飽和化合物的 Michael 加成 2.1.4 酯酶催化氧化反應(yīng)Altenbuchner19和Shimizu20兩個(gè)課題組發(fā)現(xiàn)，當(dāng)反應(yīng)體系中含有過氧化氫或過氧酸時(shí)，一些酯酶可以顯示出氧化酶的活性，即催化過氧化反應(yīng)。研究表明，由于?；磻?yīng)與過氧化反應(yīng)具有一樣過渡態(tài)和酶-?；鶑?fù)合物中間體，從而導(dǎo)致了酯酶的催化多功能性（圖 2-14）。圖 2-14 非血紅素過氧化酶催化的酯水解反應(yīng)和過氧化反應(yīng)機(jī)理。2.1.5 轉(zhuǎn)氨酶的催化多功能性西南大學(xué)的He課題組針對(duì)

51、轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶可以催化硝基烷烴與醛的Henry反應(yīng)21，得到了Henry反應(yīng)產(chǎn)物（圖 2-15），利用該酶能夠高效地催化硝基烷烴和一系列不同結(jié)構(gòu)的芳香醛發(fā)生Henry反應(yīng)， 且研究了醛的結(jié)構(gòu)對(duì)酶促Henry反應(yīng)的影響。接著通過考察空白、失活酶、牛血清蛋白等催化對(duì)照實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證了谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶的活性中心起到催化作用。圖 2-15 酶催化4-硝基苯甲醛與硝基甲烷的Henry 反應(yīng)2.1.6 其他酶的催化多功能性早在1921 年Neuberg和Hirsch22a-c這兩位科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)酵母全細(xì)胞能夠催化額外的反應(yīng)（圖2-16）。接著Ohta課題組23報(bào)道了芳基丙二酸酯脫羧酶可

52、以催化aldol反應(yīng)，他們?cè)谠囼?yàn)中發(fā)現(xiàn)酶的催化新功能與天然活性都經(jīng)歷一個(gè)烯醇負(fù)離子的中間體。而酵母丙酮酸酯脫羧酶能夠催化乙醛和苯甲醛的aldol反應(yīng)，生成(R)-苯基乙?；状?。Gerlt研究組24a-b發(fā)現(xiàn)N-?；被嵯妇哂写呋撍磻?yīng)的功能（圖 2-17）。圖2-16丙酮酸脫羧酶催化乙醛和苯甲醛的立體選擇性縮和反應(yīng)。 圖2-17 N-?；被嵯复呋撍磻?yīng) Janssen課題組25報(bào)道了負(fù)離子親核試劑與環(huán)氧化合物的立體選擇性開環(huán)反應(yīng)可以由鹵代醇脫鹵酶（Agrobacterium radiobacter AD1）催化發(fā)生，產(chǎn)物 ee 值圍在90%99%。研究發(fā)現(xiàn) Br-, Cl-

53、, I-, CN-, NO2-, N3-, OCN-, SCN-和 HCOO-等9個(gè)負(fù)離子都可以作為親核試劑，而含硫化合物、二價(jià)的負(fù)離子和非離子的伯醇和氨類則不能反應(yīng)，這表明酶只能接受線型的一價(jià)負(fù)離子作為底物（圖 2-18）圖 2-18鹵代醇脫鹵酶催化的環(huán)氧開環(huán)反應(yīng) Griengl 課題組報(bào)道了第一個(gè)生物催化的不對(duì)稱Henry反應(yīng)26，他們發(fā)現(xiàn)硝基甲烷和苯甲醛的不對(duì)稱Henry反應(yīng)可以被醇腈裂合酶(來源于 Hevea brasiliensis)催化，在室溫條件下與PBS 緩沖液和TBME 混合溶液中反應(yīng) 48 小時(shí)，產(chǎn)率可以達(dá)到 63%，ee值為 92%（圖 2-19）圖2-19 HbHNL催

54、化硝基甲烷與醛的加成反應(yīng)許多課題組在研究中發(fā)現(xiàn)9-硫代和10-硫代硬脂酸酯類化合物的磺化氧化反應(yīng) 27和9-氟代硬脂酸酯類化合物的羥基化反應(yīng)28可以通過去飽和酶催化得到。而來自于兩種細(xì)菌的異構(gòu)酶在pH=6.8的磷酸緩沖溶液中可以催化水和3E-鹵代丙烯酸酯的 Michael加成反應(yīng)29等，酶的催化多功能性不但拓寬了生物催化劑在有機(jī)合成中的應(yīng)用，豐富了有機(jī)合成方法學(xué)，而且為生命體系中復(fù)雜分子的合成提供了一種高效、綠色的途徑。對(duì)現(xiàn)有酶活性位點(diǎn)進(jìn)行一定程度的人工修飾，能夠得到新的多功能性酶或者創(chuàng)造出以多功能性為主要活性的酶。隨著蛋白質(zhì)工程和酶促多功能性研究的不斷深化，酶在不對(duì)稱合成與生命體系中必定會(huì)取

55、得更大突破。2.2 酶促串聯(lián)反應(yīng)串聯(lián)反應(yīng)因其高效、多樣的合成優(yōu)勢備受化學(xué)家青睞。而酶具有催化多種反應(yīng)的功能，所以將酶催化的多種反應(yīng)的功能加以組合，并以多步串聯(lián)和一鍋轉(zhuǎn)化的方式來實(shí)現(xiàn)多種生物活性化合物合成，這對(duì)有機(jī)合成方法學(xué)具有重要的意義。2.2.1單酶催化串聯(lián)反應(yīng)在研究中發(fā)現(xiàn)絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶30能夠催化三種非天然的反應(yīng)， 包括氨基丙二酸酯的脫羧反應(yīng)、氨酸的逆羥醛縮合反應(yīng)以與丙氨酸的消旋化反應(yīng)。頭孢菌素 C 合成酶31能催化五元環(huán)到六元環(huán)的擴(kuò)環(huán)反應(yīng)和甲基上的羥基化反應(yīng)（圖 2-20）圖2-20 eukaryotes中一種頭孢菌素C合成酶催化兩種不同的反應(yīng) 雙環(huán)2，2，2辛烯二酮是非常重要的有機(jī)

56、合成中間體，Muller等人32發(fā)現(xiàn)了在氯仿中，固定化酪氨酸酶可以利用“一鍋法”催化苯酚串聯(lián)羥基化-氧化-Diels-Alder反應(yīng)生成雙環(huán)2，2，2辛烯二酮（圖 2-21）。首先，是由酪氨酸酶催化苯酚羥基化生成鄰苯二酚。其次，鄰苯二酚在酪氨酸酶的作用下進(jìn)一步被氧化成鄰位苯醌。最后，苯醌與烯烴化合物發(fā)生Diels-Alder反應(yīng)得到最終產(chǎn)物。圖 2-21 單酶催化羥基化-氧化-Diels-Alder的串聯(lián)反應(yīng) Beifuss課題組33在研究漆酶時(shí)發(fā)現(xiàn)：漆酶可以催化串聯(lián)的氧化-Michael加成-氧化-Michael加成反應(yīng)生成一系列苯并呋喃類衍生物（圖 2-22）。首先，漆酶催化氧化苯酚生成鄰二苯醌。其次，漆酶催化1，3-二羰基化合物對(duì)鄰二苯醌發(fā)生一個(gè)Michael加成反應(yīng)。再者，漆酶又催化氧化苯酚生成鄰二苯醌。最后在漆酶的作用下，1，3-二羰基化合物上的羰基氧對(duì)鄰二苯醌又發(fā)生一個(gè)Michael加成反應(yīng)生成最終的苯并呋喃類衍生物。機(jī)理如下：圖 2-22 漆酶催化串聯(lián)反應(yīng)