醫(yī)學(xué)免疫學(xué)- 免疫學(xué)檢測技術(shù)

1、免疫學(xué)檢測技術(shù)免疫學(xué)檢測技術(shù)Immunodiagnosis第一節(jié)第一節(jié) 抗原或抗體檢測抗原或抗體檢測I. Detection of antigens or antibodies一、抗原一、抗原-抗體反應(yīng)的特點抗體反應(yīng)的特點Specificity（一）高度特異性（一）高度特異性 Cross-reaction: common antigen 交叉反應(yīng)：共同抗原交叉反應(yīng)：共同抗原 Antiserum absorption 抗血清吸收抗血清吸收 1st antibody & 2nd antibody 一抗；二抗一抗；二抗Reversibility/invertibility: （二）可逆性（二

2、）可逆性 non-covalent, surface-binding , dissociable 非共價、表面結(jié)合，可解離非共價、表面結(jié)合，可解離 complementary capacity: affinity; avidity 互補程度：親和力互補程度：親和力 ； 親合力親合力Visibility（三）可見性的條件（三）可見性的條件Compatible concentrations of antigen and antibody combined in proportion at or near equivalence Antigen: multivalent; Antibody(IgG)

3、: divalent 比例適合：抗原多價，抗體比例適合：抗原多價，抗體2價。交織成網(wǎng)。價。交織成網(wǎng)。Ph value; Temperature; Ionic concentration 條件適宜：酸堿度、溫度、離子濃度條件適宜：酸堿度、溫度、離子濃度Adequate concentration, binding strength; reaction time 足夠濃度、結(jié)合強度和反應(yīng)時間足夠濃度、結(jié)合強度和反應(yīng)時間Prozone phenomenon前帶現(xiàn)象前帶現(xiàn)象二、抗原二、抗原-抗體反應(yīng)的應(yīng)用抗體反應(yīng)的應(yīng)用Terms 術(shù)語術(shù)語Serological reaction 血清學(xué)反應(yīng)血清學(xué)反應(yīng)Q

4、ualitative analysis 定性定性Quantitation 定量定量Orientation 定位定位Titration 滴定滴定Titer 效價效價/滴度滴度三、常用的抗原三、常用的抗原-抗體反應(yīng)技術(shù)抗體反應(yīng)技術(shù)經(jīng)典技術(shù)經(jīng)典技術(shù)中和反應(yīng)中和反應(yīng)補體結(jié)合反應(yīng)補體結(jié)合反應(yīng)凝集反應(yīng)凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)I ) Agglutination（一）凝集反應(yīng)：（一）凝集反應(yīng)：顆粒性抗原顆粒性抗原或或包被有可溶性抗原的顆粒包被有可溶性抗原的顆粒 + 相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體肉眼可見的凝集肉眼可見的凝集塊塊 1. 直接凝集直接凝集 顆粒性抗原顆粒性抗原+ 相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體 玻片凝集：抗原定性玻片凝集：抗

5、原定性 （ABO血型血型） 試管凝集：抗體定量試管凝集：抗體定量 （肥達反應(yīng)）（肥達反應(yīng)） 2. 間接凝集間接凝集 包被有可溶性抗原的顆粒包被有可溶性抗原的顆粒 + 相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體 紅細胞（間接血凝）；乳膠（間接乳凝）紅細胞（間接血凝）；乳膠（間接乳凝） Coombs Test: 紅細胞（紅細胞（Rh抗原）抗原）+ 不完全抗體不完全抗體 + 抗人球蛋白抗人球蛋白 3. 派生的試驗派生的試驗 反向間接凝集反應(yīng)：包被抗體的顆粒反向間接凝集反應(yīng)：包被抗體的顆粒 + 抗原抗原 間接凝集抑制反應(yīng)：間接凝集抑制反應(yīng)： （乳膠妊娠試驗乳膠妊娠試驗） 抗體抗體 + 未知抗原未知抗原 + 包被有相應(yīng)可溶性抗原

6、的顆粒包被有相應(yīng)可溶性抗原的顆粒 凝集？凝集？HaemagglutinationII ) Precipitation （二）沉淀反應(yīng)（二）沉淀反應(yīng) 可溶性抗原可溶性抗原 + 相應(yīng)抗體相應(yīng)抗體肉眼可見的沉淀物肉眼可見的沉淀物 使用半固體瓊脂凝膠為使用半固體瓊脂凝膠為介質(zhì)介質(zhì)瓊脂擴散瓊脂擴散/免疫擴散免疫擴散1. 單向免疫擴散：抗原單向免疫擴散：抗原 的的定量（定量（Ig、C3 ）2. 雙向免疫擴散：抗原雙向免疫擴散：抗原/抗體的抗體的定性、組成及定性、組成及Ag相關(guān)性分析相關(guān)性分析3. 免疫電泳：免疫電泳： 電泳電泳 + 雙向免疫擴散雙向免疫擴散 （抗原分析）（抗原分析）4. 對流電泳：對流電泳

7、： 雙向免疫擴散雙向免疫擴散 + 電泳電泳 （抗原（抗原/抗體定性）抗體定性）5. 火箭電泳：火箭電泳： 單向免疫擴散單向免疫擴散 + 電泳電泳 （抗原定量）（抗原定量）6. 免疫比濁：免疫比濁： 抗體抗體 + 遞增量抗原遞增量抗原比濁比濁（抗原定量）（抗原定量）III ) Immunolabelling Techniques （三）免疫標記技術(shù)（三）免疫標記技術(shù)標記物：標記物： 熒光素、酶、放射性核素、電子致密物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)熒光素、酶、放射性核素、電子致密物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)標記對象：抗原或抗體標記對象：抗原或抗體用途：用途： 定性、定量、定位定性、定量、定位1. 免疫熒光法（免疫熒光法（

8、IFA ） 熒光素可雙色；使免疫復(fù)合物呈熒光；可定性、定位熒光素可雙色；使免疫復(fù)合物呈熒光；可定性、定位 （1）直接熒光法）直接熒光法 （2）間接熒光法：）間接熒光法： 熒光素一抗熒光素一抗 熒光素二抗熒光素二抗 對每種抗體作標記對每種抗體作標記 不必標記每種抗體不必標記每種抗體 特異特異 敏感敏感 測測Ag 測測Ag/Ab免疫熒光法免疫熒光法2. 酶免疫測定酶免疫測定（EIA）: ELISA與酶免疫組化與酶免疫組化（1）雙抗體夾心法）雙抗體夾心法ELISA：查抗原：查抗原（2）間接法）間接法ELISA： 查抗體查抗體（3）BAS-ELISA ： Biotin-Avidin-酶放大系統(tǒng)酶放大系

9、統(tǒng)（4）ELISPOT測定法：測定法： _包被物包被物 待測物待測物 測定結(jié)果測定結(jié)果_ 抗抗CK抗體抗體 CK分泌細胞分泌細胞 單一單一CK 已知抗原已知抗原 B細胞細胞 特異特異B細胞細胞 （5）酶免疫組化）酶免疫組化* 酶標抗體酶標抗體 + 組織組織/細胞（未知抗原）細胞（未知抗原） + 形態(tài)學(xué)檢查形態(tài)學(xué)檢查*免疫組化技術(shù)：可對抗原定性、定量、定位免疫組化技術(shù)：可對抗原定性、定量、定位 酶免疫組化：酶免疫組化： HRP免疫金銀組化：免疫金銀組化： 膠體金顆粒膠體金顆粒免疫電鏡技術(shù)：免疫電鏡技術(shù)： HRP、膠體金、鐵蛋白、膠體金、鐵蛋白雙抗體夾心法、間接法雙抗體夾心法、間接法ELISA間接

10、法間接法ELISAELISA操作圖可調(diào)移液器可調(diào)移液器8孔道可調(diào)移液器孔道可調(diào)移液器3. 放射免疫測定放射免疫測定（RIA） 常用常用 125I，測定微量物質(zhì)，測定微量物質(zhì)4. 化學(xué)發(fā)光免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析 常用常用 魯米諾，測定超微量物質(zhì)魯米諾，測定超微量物質(zhì)5. 免疫印跡法（免疫印跡法（Western Blotting） 先做凝膠電泳將蛋白質(zhì)分區(qū)先做凝膠電泳將蛋白質(zhì)分區(qū) 再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體再將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至固相載體 后用酶免疫、放射免疫等技術(shù)加以測定后用酶免疫、放射免疫等技術(shù)加以測定第二節(jié)第二節(jié) 免疫細胞的測定免疫細胞的測定一、淋巴細胞的分離與類型鑒定淋巴細胞的分離與類型鑒定 （一

11、）血細胞分離（一）血細胞分離 外周血外周血 密度梯度離心法密度梯度離心法 外周血單個核細胞（淋巴細胞外周血單個核細胞（淋巴細胞+單核細胞）單核細胞） 吸附培養(yǎng)分離法吸附培養(yǎng)分離法 淋巴細胞淋巴細胞 尼龍毛，抗尼龍毛，抗CD3單抗，單抗，E花結(jié)花結(jié) T細胞細胞 B細胞細胞（二）淋巴細胞鑒定（二）淋巴細胞鑒定1. 免疫熒光法免疫熒光法 常用間接法測常用間接法測CD3/CD4/CD8、mIgM/mIgD2. 磁珠分離法磁珠分離法 如抗如抗CD4抗體交聯(lián)微珠可分離抗體交聯(lián)微珠可分離CD4與與CD83. 流式細胞術(shù)（流式細胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM） 可分析細胞大小、核型、表面分子（多

12、種熒光標記）可分析細胞大小、核型、表面分子（多種熒光標記） 檢測各類免疫細胞及其比率檢測各類免疫細胞及其比率 白血病、淋巴瘤的免疫學(xué)分型白血病、淋巴瘤的免疫學(xué)分型 細胞分選細胞分選二、淋巴細胞功能測定二、淋巴細胞功能測定（一）（一）T細胞功能測定細胞功能測定 1. T細胞增殖試驗：細胞增殖試驗： 絲裂原絲裂原/抗抗CD3刺激刺激/特異抗原特異抗原細胞增殖細胞增殖 （1）同位素摻入法）同位素摻入法 （2）MTT法法 （3）形態(tài)觀測法）形態(tài)觀測法 2. 細胞毒試驗細胞毒試驗 CTL、NK細胞殺傷靶細胞細胞殺傷靶細胞 （1）51Cr 釋放法釋放法 （2）凋亡細胞檢查法）凋亡細胞檢查法 階梯狀酶切圖譜

13、階梯狀酶切圖譜 TUNEL法法 FCM3. 細胞因子檢測細胞因子檢測（1）免疫學(xué)檢測法）免疫學(xué)檢測法 夾心法夾心法ELISA FCM（2）生物學(xué)檢測法）生物學(xué)檢測法 細胞增殖（或細胞增殖抑制）試驗細胞增殖（或細胞增殖抑制）試驗 細胞毒（或細胞毒抑制）試驗細胞毒（或細胞毒抑制）試驗 （3） 分子生物學(xué)檢測法分子生物學(xué)檢測法 RT-PCR測定測定mRNA4. 皮膚試驗：皮膚試驗： 測試測試IV型超敏反應(yīng)能力型超敏反應(yīng)能力（二）（二）B細胞功能測定細胞功能測定1. B細胞增殖試驗細胞增殖試驗 小鼠：小鼠：LPS 人：人： SPA；抗；抗IgM2. 抗體形成細胞檢測抗體形成細胞檢測 溶血空斑試驗溶血空

14、斑試驗 ELISPOT試驗試驗（三）吞噬細胞功能的測定（三）吞噬細胞功能的測定1. 趨化功能測定趨化功能測定 Boyden 小室小室2. 吞噬功能測定吞噬功能測定 第三節(jié)第三節(jié) 補體及循環(huán)免疫復(fù)合物的測定補體及循環(huán)免疫復(fù)合物的測定III. Application of immunological techniques第四節(jié)第四節(jié) 免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用免疫學(xué)檢測方法的應(yīng)用1. Assessment and selection 一、免疫學(xué)檢測方法的評估與選擇免疫學(xué)檢測方法的評估與選擇 Reliability: true vs false 可靠性可靠性 ( gold standard*=真陰性率與真

15、陽性率真陰性率與真陽性率) * Specificity= 真陰性真陰性/（真陰性（真陰性+假陽性）假陽性）x 100% * Sensitivity= 真陽性真陽性/（真陽性（真陽性+假陰性）假陰性）x 100% Safety 安全性安全性 Simplicity 簡易性簡易性 Saving of time and money 經(jīng)濟性經(jīng)濟性Selection as per requirement and availability 依據(jù)需要與可能選擇依據(jù)需要與可能選擇Screening: 初篩初篩 high sensitivity first, to avoid case missing 避免漏診避免漏診Diagnosis: 確診確診 high specificity first, to avoid misdiagnosis 避免誤診避免誤診2. Clinical application 二、免疫學(xué)檢測方法的臨床應(yīng)用二、免疫學(xué)檢測方法的臨床應(yīng)用1) Infectious diseases （一）（一） 感染性疾病感染性疾病 pathogen 病原體