基因編輯技術(shù)和原理

1、 基因編輯技術(shù)和原理 李傲 什么是基因編輯技術(shù)？ 基因編輯是指對基因組進(jìn)行定點修飾的一項新技術(shù)。利用該技術(shù)，可以精確地定位到基因組的某一位點上， 在這位點上剪斷靶標(biāo) DNA 片段并插入新的基因片段。此過程既模擬了基因的自然突變， 又修改并編輯了原有的基因組， 真正達(dá)成了“編輯基因”。 基因編輯的研究背景 傳統(tǒng)的動物育種方法受到種源的限制，其程需要耗費大量的人力、物力和財力，經(jīng)歷漫長的培育過程。而且不同種間的雜交很困難，育種成果很難取得突破性進(jìn)展。 基因編輯原理 現(xiàn)代基因組編輯技術(shù)的基本原理是相同的，即借助特異性 DNA 雙鏈斷裂激活細(xì)胞天然的修復(fù)機制，包括非同源末端連接和同源重組修復(fù) 兩條途徑

2、。 1.非同源末端連接（NHEJ ）是一種低保真度的修復(fù)過程，斷裂的DNA 修復(fù)重連的過程中會發(fā)生堿基隨機的插入或丟失，造成移碼突變使基因失活,實現(xiàn)目的基因敲除。如果一個外源性供體基因序列存在，NHEJ 機制會將其連入雙鏈斷裂DSB 位點，從而實現(xiàn)定點的基因敲入。 （ 移碼突變：在正常DNA分子中，堿基缺失或增加3的倍數(shù)，造成這位置之后的一系列編碼發(fā)生移位錯誤的改變，這種現(xiàn)象稱移碼突變。） 2. 同源重組修復(fù)（HR） 是一種相對高保真度的修復(fù)過程，在一個帶有同源臂的重組供體存在的情況下，供體中的外源目的基因會通過同源重組過程完整的整合到靶位點，不會出現(xiàn)隨機的堿基插入或丟失。如果在一個基因兩側(cè)同

3、時產(chǎn)生DSB，在一個同源供體存在的情況下，可以進(jìn)行原基因的替換。 基因編輯原理基因編輯技術(shù)的種類目前主要有 3 種基因編輯技術(shù)， 分別為：n人工核酸酶介導(dǎo)的鋅指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技術(shù)；n轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALEN)技術(shù)； nRNA 引導(dǎo)的 CRISPR- Cas 核酸酶技術(shù)(CRISPR- Cas 9）。 1. ZFN 基因組編輯技術(shù)ZFN 技術(shù)是第一代基因組編輯技術(shù)，其功能的實現(xiàn)是基于具有獨特的DNA序列識別的鋅指蛋白發(fā)展起來的。1986年

4、Diakun 等首先在真核生物轉(zhuǎn)錄因子家族的 DNA 結(jié)合區(qū)域發(fā)現(xiàn)了Cys2- His2鋅指模塊，到1996年，Kim等首次人工連接了鋅指蛋白與核酸內(nèi)切酶。2005年，Urnov等發(fā)現(xiàn)一對由4個鋅指連接而成的ZFN可識別24 bp的特異性序列，由此揭開了ZFN在基因組編輯中的應(yīng)用。ZFN 由鋅指蛋白(ZFP)和 Fok核酸內(nèi)切酶組成。其中，由 ZFP 構(gòu)成的 DNA 識別域能識別特異位點并與之結(jié)合，而由Fok構(gòu)成的切割域能執(zhí)行剪切功能，兩者結(jié)合可使靶位點的雙鏈DNA 斷裂(DSB)。于是， 細(xì)胞可以通過同源重組(HR)修復(fù)機制和非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機制來修復(fù) DNA。HR 修復(fù)有可能

5、會對靶標(biāo)位點進(jìn)行恢復(fù)修飾或者插入修飾，而 NHEJ 修復(fù)極易發(fā)生插入突變或缺失突變。兩者都可造成移碼突變，因此達(dá)到基因敲除的目的。ZFN 誘導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)可應(yīng)用于很多物種及基因位點，具有較好的發(fā)展?jié)摿Α５悄壳坝?3 個方面的缺陷制約了該技術(shù)的推廣:(1)以現(xiàn)有的策略設(shè)計高親和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和時間;(2)在細(xì)胞中持續(xù)表達(dá) ZFN 對細(xì)胞有毒性;(3)雖然三聯(lián)體設(shè)計具有一定特異性，但仍然存在不同程度的脫靶效應(yīng)。 2. TALEN 基因組編輯技術(shù) 2009 年，研究者在植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)中發(fā)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子，它的蛋白核酸結(jié)合域的氨基酸序列

6、與其靶位點的核酸序列有較恒定的對應(yīng)關(guān)系。隨后，TALE特異識別 DNA 序列的特性被用來取代 ZFN技術(shù)中的鋅指蛋白。它可設(shè)計性更強，不受上下游序列影響，具備比ZFN 更廣闊的應(yīng)用潛力。TALENs 包含兩個 TALEN 蛋白, 每個 TALEN 都是由 TALE array 與 Fok融合而成. 其中一個 TALEN 靶向正義鏈上靶標(biāo)位點, 另一個則靶向反義鏈上的靶標(biāo)位點. 然后 Fok形成二聚體, 在靶向序列中間的 spacer 處切割 DNA, 造成雙鏈 DNA 斷裂, 隨后細(xì)胞啟動 DNA 損傷修復(fù)機制. 針對不同的TALEN 骨架, 其最適宜的spacer長度不同, 其長度范圍一般為

7、1220 bp. 實驗結(jié)果表明, TALENs在靶向DNA時, 第一個堿基為 T 時其結(jié)合效果更佳。目前， TALEN 已經(jīng)成功應(yīng)用于酵母、 哺乳動物和植物的位點特異性基因打靶， 與鋅指核酸酶系統(tǒng)相比有較大的應(yīng)用優(yōu)勢， 但仍然有些問題需要解決，例如:脫靶效應(yīng)、TALEN 與基因組進(jìn)行特異結(jié)合與染色體位置及鄰近序列有關(guān)等。CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)1987年，Ishino 等在K12大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)這種間隔重復(fù)序列廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中。經(jīng)過幾十年的研究，在2007年終于證明這種重復(fù)序列與細(xì)菌獲得性免疫的關(guān)系。CRISPR/Cas

8、 系統(tǒng)由 Cas9 核酸內(nèi)切酶與sgRNA構(gòu)成. 轉(zhuǎn)錄的 sgRNA 折疊成特定的三維結(jié)構(gòu)后與 Cas9 蛋白形成復(fù)合體, 指導(dǎo) Cas9 核酸內(nèi)切酶識別特定靶標(biāo)位點, 在 PAM 序列上游處切割 DNA 造成雙鏈 DNA 斷裂, 并啟動 DNA 損傷修復(fù)機制. 從不同菌種中分離的 CRISPR/Cas 系統(tǒng), 其 CrRNA(或者是人工構(gòu)建的sgRNA)靶向序列的長度不同, PAM 序列也可能不同。在這個系統(tǒng)中，只憑借一段 RNA 便能識別外來基因并將其降解的功能蛋白引起了研究者的興趣。直到2012 年，Jinek 等第一次在體外系統(tǒng)中CRISPR/Cas9 為一種可編輯的短RNA 介導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶，標(biāo)志著 CRISPR /Cas9 基因組編輯技術(shù)成功問世。基因編輯的優(yōu)勢與傳統(tǒng)的以同源重組