KRAS和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用（課堂PPT）

1、1KRAS和和EGFR檢測(cè)與臨床應(yīng)用檢測(cè)與臨床應(yīng)用2匯報(bào)內(nèi)容匯報(bào)內(nèi)容KRAS和和EGFR的簡介及臨床意義的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)等位特異性引物設(shè)計(jì)等位特異性引物設(shè)計(jì)KRAS試劑盒開發(fā)簡介試劑盒開發(fā)簡介3KRAS和和EGFR的簡介及臨床意義的簡介及臨床意義4KRAS背景背景KRAS是一種原癌基因，長約是一種原癌基因，長約35kb，位于，位于12號(hào)染色體，是號(hào)染色體，是RAS基因基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和和RAF、MEK、ERK信號(hào)通路的調(diào)控；信號(hào)通路的調(diào)控；EGFR在通路中位于在

2、通路中位于KRAS上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸上游，配體與之結(jié)合后可以激發(fā)其酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致激酶活性，導(dǎo)致KRAS的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；的活化和通路中信號(hào)傳導(dǎo)；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結(jié)直）、結(jié)直腸癌（腸癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。5KRAS基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效基因突變影響結(jié)直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從基因野生型的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者能從EGF抗體（抗體（西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者

3、治療效果很差；）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對(duì)西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于突變型患者對(duì)西妥昔單抗無應(yīng)答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med6結(jié)直腸癌患者檢測(cè)結(jié)直腸癌患者檢測(cè)KRAS突變相關(guān)指南突變相關(guān)指南歐洲藥品評(píng)估局（歐洲藥品評(píng)估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從野生型的進(jìn)展期結(jié)直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)（ASCO，2009）推薦：）

4、推薦：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者應(yīng)檢測(cè)KRAS突變，突變，如有如有KRAS12、13位突變，則不應(yīng)進(jìn)行位突變，則不應(yīng)進(jìn)行EGFR單克隆抗體治療；單克隆抗體治療；美國美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌前必須檢測(cè)必須檢測(cè)KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（日批準(zhǔn)第一個(gè)用于結(jié)直腸癌的基因檢測(cè)（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；，以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2014）

5、指南說：）指南說：轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者均應(yīng)進(jìn)行RAS突變檢測(cè)（突變檢測(cè)（KRAS和和NRAS），至少應(yīng)檢測(cè)），至少應(yīng)檢測(cè)KRAS第二外顯子的突變情況第二外顯子的突變情況。KRAS或或NRAS突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。突變型的病人不應(yīng)采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛(wèi)生部于中國衛(wèi)生部于2010年年10月月14日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（日發(fā)表了結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2010版）版） 。明確指出。明確指出在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受在患者確定為復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌接受西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組、帕尼單抗時(shí)，必須檢測(cè)腫瘤組織的織的

6、K-ras基因狀態(tài)。在晚期基因狀態(tài)。在晚期/轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌化療中，在治療前檢測(cè)腫瘤 K-ras 基因基因狀態(tài)，狀態(tài)，EGFR不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。不推薦作為常規(guī)檢查項(xiàng)目。7KRAS基因突變影響非小細(xì)胞肺癌基因突變影響非小細(xì)胞肺癌藥物療效藥物療效KRAS基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（基因野生型的非小細(xì)胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如，如吉吉非替尼、厄洛替尼非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗；）治療中獲益，而基因突變的患者易發(fā)生抵抗； KRASKRAS突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生

7、存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中突變型患者使用厄洛替尼聯(lián)合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol 8非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者檢測(cè)KRAS突變突變相關(guān)指南相關(guān)指南美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突變與非小細(xì)突變與非小細(xì)胞肺癌患者胞肺癌患者TKI抵抗有關(guān)，抵抗有關(guān)，KRAS基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合基因測(cè)序有助于確定哪些病人適合TKI治療。治

8、療。當(dāng)當(dāng)KRAS基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)基因發(fā)生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進(jìn)行分子靶向治療。行分子靶向治療。9KRAS主要突變位點(diǎn)主要突變位點(diǎn)在結(jié)直腸癌中，在結(jié)直腸癌中，KRAS突變主要發(fā)生于突變主要發(fā)生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370

9、E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2

10、247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV

11、202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA621315EGFR突變與突變與EGFR-TKI藥物療效關(guān)藥物療效關(guān)系系所在外顯子所在外顯子突變類型突變類型與與EGFR-TKI療效關(guān)系療效關(guān)系18G719A(S/C)3種點(diǎn)突變種點(diǎn)突變藥敏突變藥敏突變1919種缺失突變種缺失突變藥敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變S768I藥敏突變藥敏突變20點(diǎn)突變點(diǎn)突變T790M耐藥突變耐藥突變*

12、203種插入突變種插入突變耐藥突變耐藥突變*21點(diǎn)突變點(diǎn)突變L858R藥敏突變藥敏突變21點(diǎn)突變點(diǎn)突變L861Q藥敏突變藥敏突變16ADx EGFR試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)試劑盒突變結(jié)果檢測(cè)組別組別突變類型突變類型所占比例所占比例對(duì)吉非替尼對(duì)吉非替尼敏感性敏感性證據(jù)證據(jù) 1Exon 19 deletions; L858R 90%充分充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%無無17ARMS-PCR的基本原理和技術(shù)特點(diǎn)的基本原

13、理和技術(shù)特點(diǎn)18ARMS-PCR原理原理ARMS是是Amplification Refractory Mutation System (擴(kuò)增阻礙突擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)變系統(tǒng))的縮寫。的縮寫。根據(jù)根據(jù) PCR過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位過程中要求引物和模板間的嚴(yán)格互補(bǔ)配對(duì)來實(shí)現(xiàn)對(duì)突變位點(diǎn)的檢測(cè)點(diǎn)的檢測(cè), 當(dāng)引物當(dāng)引物 3 末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí)末端出現(xiàn)錯(cuò)配時(shí), 產(chǎn)物將不能延伸。產(chǎn)物將不能延伸。因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，因此設(shè)計(jì)兩條上游（或下游）引物，使其使其3末端分別與突變位點(diǎn)堿基末端分別與突變位點(diǎn)堿基匹配和錯(cuò)配匹配和錯(cuò)配，共用下游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目，共用下

14、游（或上游）引物，分別擴(kuò)增野生型和突變型目的片斷。的片斷。19ARMS-PCR原理原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forwar

15、d primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics20PCR產(chǎn)物檢測(cè)產(chǎn)物檢測(cè)-Real time PCR每個(gè)每個(gè)PCR循環(huán)循環(huán)檢測(cè)熒光信號(hào)檢測(cè)熒光信號(hào)，不同不同PCR產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)產(chǎn)物，不同熒光信號(hào)相比凝膠電泳：更快，可定量，無相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染信號(hào)產(chǎn)生方法：信號(hào)產(chǎn)生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環(huán)探針，雙環(huán)探針(廈門艾德廈門艾德)，Taqman，M

16、olecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer21應(yīng)用于應(yīng)用于Real time-PCR的的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe2

17、2ARMS技術(shù)特點(diǎn)技術(shù)特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高靈敏度高（0.1-1%）操作簡便操作簡便周期短周期短不產(chǎn)生不產(chǎn)生PCR產(chǎn)物污染產(chǎn)物污染適用樣本類型多適用樣本類型多（如（如FFPE）精確突變類型精確突變類型缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：方法建立需時(shí)較長方法建立需時(shí)較長僅能檢測(cè)已知突變僅能檢測(cè)已知突變23測(cè)序法與測(cè)序法與ARMS法相比較法相比較Sanger測(cè)序法測(cè)序法焦磷酸測(cè)序焦磷酸測(cè)序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPE標(biāo)本成功率標(biāo)本成功率 低低較高較高高高商用試劑盒商用試劑盒無無有有有有流程與速度流程與速度1-2天天2-3天天AGTGly13SerGGCAGCGly12ArgGGTCGTGly1

18、3ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC30三引物設(shè)計(jì)原理三引物設(shè)計(jì)原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics31三引物設(shè)計(jì)三引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTC

19、CTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，5432三引物設(shè)計(jì)三引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì)下游引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTA

20、ATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列選擇序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互補(bǔ)鏈：互補(bǔ)鏈：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3333端增加錯(cuò)配端增加錯(cuò)配如果如果3端是弱錯(cuò)配（端是弱錯(cuò)配（C/A或或G/T）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（）則需要引入強(qiáng)的錯(cuò)配（A/G或或

21、C/T）才可阻斷才可阻斷3端的擴(kuò)增；端的擴(kuò)增；如果如果3端是強(qiáng)錯(cuò)配（端是強(qiáng)錯(cuò)配（A/G或或C/T）則需要引入弱的錯(cuò)配（）則需要引入弱的錯(cuò)配（C/A或或G/T）或不需引入錯(cuò)配即可阻斷或不需引入錯(cuò)配即可阻斷3端的擴(kuò)增；端的擴(kuò)增；當(dāng)當(dāng)3端是中度錯(cuò)配（端是中度錯(cuò)配（A/A，C/C，G/G 或或T/T）則需要引入中度的錯(cuò)配）則需要引入中度的錯(cuò)配。野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-334四引物設(shè)計(jì)四引物設(shè)計(jì)35四

22、引物設(shè)計(jì)四引物設(shè)計(jì)ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內(nèi)引物（內(nèi)引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內(nèi)引物（內(nèi)引物（R）5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3外引物（外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（外引物（

23、R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-336KRAS試劑盒開發(fā)簡介試劑盒開發(fā)簡介37KRAS突變探針和引物設(shè)計(jì)突變探針和引物設(shè)計(jì)KRAS序列：序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 1

24、2GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 參照引物：

25、參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39. 下游引物：下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3鎖核酸阻滯探針鎖核酸阻滯探針(野生型野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙江大學(xué)，浙江大學(xué)，CN 102367478 B38反應(yīng)體系反應(yīng)體系 引物終濃度：引物終濃度：0.3 M Taqman探針終濃度：探針終濃度：0.1 M LNA阻滯探針終濃度：阻滯探針終濃度：0.9 M Goldstarbest Taq酶終濃度：酶終濃度：0.05 U/l 模板模板DNA終濃度：終濃度：10-300 ng/l