DNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理

1、精選文檔DNA提取過(guò)程中各種試劑的作用及原理1溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。 2溶液IINaOHSDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。但當(dāng)pH12或pH3時(shí)，

2、就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。 SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。（2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。 3. 溶液III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性

3、，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性，使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3molL NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾桑瑴p少相斥力而互相聚合，后者是因?yàn)殁c鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。 4為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？ 用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DN

4、A很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時(shí)，就會(huì)影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時(shí)可用95乙醇代替無(wú)水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無(wú)水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 5在用乙醇沉淀DN

5、A時(shí)，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達(dá)0.10.25mol/L？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負(fù)電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太低時(shí)，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當(dāng)加入的鹽溶液濃度太高時(shí)，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過(guò)多的鹽雜質(zhì)存在，影響DNA的酶切等反應(yīng)，必須要進(jìn)行洗滌或重沉淀。 6加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來(lái)處理？ 加進(jìn)去的RNase本身是一種蛋白質(zhì)，為了純化DNA，

6、又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復(fù)合物沉淀，再加KAc使這些復(fù)合物轉(zhuǎn)變?yōu)槿芙舛雀〉拟淃}形式的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。 7為什么在保存或抽提DNA過(guò)程中，一般采用TE緩沖液？ 在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（pKa7.2）和硼酸系統(tǒng)（pKa=9.24）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)，磷酸根離子的種類及數(shù)量將與Ca2產(chǎn)生Ca3(PO4)2沉淀，在DNA

7、反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)，大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA更能穩(wěn)定 。氯仿的作用主要是使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇的作用是消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫。氯仿是強(qiáng)蛋白質(zhì)變性劑，抑制RNA酶的活性，除去蛋白質(zhì)污染?；蚪MDNA- CTAB法CTAB法原理(植物DNA提取經(jīng)典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲

8、基溴化銨),是一種陽(yáng)離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性.在高離子強(qiáng)度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物,只是不能沉淀核酸.通過(guò)有機(jī)溶劑抽提,去除蛋白,多糖,酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來(lái).注:CTAB溶液在低于15 時(shí)會(huì)形成沉淀析出,因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱,且離心時(shí)溫度不要低于15.基因組DNA- CTAB法CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一個(gè)緩沖環(huán)境,防止核酸被破壞;EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;NaCl 提供一個(gè)高鹽環(huán)境,使DNP充分溶解

9、,存在于液相中;CTAB溶解細(xì)胞膜,并結(jié)合核酸,使核酸便于分離;-巰基乙醇是抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,避免褐變,使酚容易去除基因組DNA- CTAB法CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物,能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì),有效去除多酚,減少DNA中酚的污染;同時(shí)它也能和多糖結(jié)合,有效去除多糖.基因組DNA的提取核酸分離,純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí),應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī)(酚/氯仿)抽提時(shí)應(yīng)充分混勻,但動(dòng)作要輕柔離心分離兩相時(shí),應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間針對(duì)不同材料的特點(diǎn),在提取過(guò)程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法基因組DNA的提取核酸分離,純化蛋白質(zhì)的去除

10、:酚/氯仿抽提使用變性劑變性(SDS,異硫氰酸胍等)高鹽洗滌蛋白酶處理核酸分離,純化多糖的去除:高鹽法:用乙醇沉淀時(shí),在待沉淀溶液中加入1/2體積的5M NaCl,高鹽可溶解多糖.用多糖水解酶將多糖降解.在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積),氯苯可以與多糖的羥基作用,從而去除多糖 .用PEG8000代替乙醇沉淀DNA:在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ,冰浴20min.核酸分離,純化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑:-巰基乙醇,抗壞血酸,半胱氨酸,二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑:如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙

11、二醇),它們與酚類有較強(qiáng)的親和力,可防止酚類與DNA的結(jié)合鹽離子的去除:70%的乙醇洗滌核酸吸附,沉淀和溶解使用合適的吸附材料吸附核酸,其它的雜質(zhì)均被洗掉,達(dá)到純化DNA的目的另一種方式加入1/10體積的NaAc(pH5.2,3M),用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后應(yīng)用70%的乙醇洗滌,以除去鹽離子等若長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNasepH值為8.0,可防止DNA發(fā)生酸解 。基因組DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題DNA中含有蛋白,多糖,多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前,有酒精殘留,酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子有RNA的存留原因?qū)Σ咧匦录兓疍NA,過(guò)吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA,讓酒精充分揮發(fā)增加70%乙醇洗滌的次數(shù)(2-3次)加入RNase降解RNA問(wèn)題一:DNA樣品不純,抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng).DNA提取常見(jiàn)問(wèn)題材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過(guò)程操作過(guò)于劇烈,DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融。盡量取新鮮材料,低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后,應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí),可增加裂解液中螯合劑的含量,細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無(wú)菌水配制,耗