自體造血干細(xì)胞移植物的免疫凈化-- 病理生理學(xué)

1、自體造血干細(xì)胞移植物的免疫凈化- 病理生理學(xué)    摘要 高劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植治療惡性腫瘤失敗的主要原因是疾病的復(fù)發(fā)。目前認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞隨著移植物再次輸入人體是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的重要因素。本文綜述了近年來用免疫學(xué)方法在體外凈化自體造血干細(xì)胞移植的一些新進(jìn)展。高劑量化療聯(lián)合自體造血干細(xì)胞移植已極大地提高了惡性血液系疾病和某些實(shí)體瘤的近期療效，但由于回輸?shù)囊浦参镏泻袣埩舻哪[瘤細(xì)胞，因而復(fù)發(fā)率高，病人的長期無病生存受到嚴(yán)重影響。最近的基因標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證實(shí)了在急性髓性白血病（ aML）和神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人，自體移植物中殘留腫瘤細(xì)胞對(duì)人體的再輸入是復(fù)發(fā)的重要因素。

2、因此，從自體移植物中清除污染的腫瘤細(xì)胞是十分必要的。在體外用免疫學(xué)的方法消除移植中殘留腫瘤細(xì)胞的措施稱為免疫凈化（ immunologic purging），與其它凈化方法相比，它具有特異性高，殺傷力強(qiáng)，費(fèi)時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)，在自體造血干細(xì)胞移植的體外凈化中占有重要地位，術(shù)文僅就近年來此方面的研究進(jìn)展作一簡要綜述。免疫正凈化免疫正凈化（ immunologic positive purging）是指利用免疫學(xué)方法將正常造血干細(xì)胞從移植物中純化。目前從移植物中分離造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞主要依靠其表面的 cD34抗原， cD34+抗原分子是一種酸性糖基化膜蛋白，編碼基因位于人染色體1q32區(qū)，共27kb，有9

3、個(gè)外顯子。 cD34+ mRNA高水平表達(dá)于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞，隨著細(xì)胞的分化成熟，其表達(dá)強(qiáng)度逐漸下降。目前臨床進(jìn)行 cD34+選擇的方法多已商品化，如 ceprate sC和 baxter lsolex 300分離柱等，它們的基本原理都是以抗 cD34單克隆抗體（ mcAb）為探針，利用免疫吸附柱、免疫磁珠、免疫熒光及間接免疫包被（ panning）的方法分離得到高純度的 cD34+細(xì)胞，這一過程使3個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的腫瘤細(xì)胞得到清除1。作為免疫正凈化的產(chǎn)物，移植物中 cD34+細(xì)胞的數(shù)量是決定移植后造血重建能否成功的一個(gè)關(guān)鍵因素， bensinger2強(qiáng)調(diào)，為了保證血小板在2周內(nèi)恢復(fù)到20

4、5;109/L的水平， cD34+細(xì)胞必須5×106/kg;如果低于1×106/kg，那么移植失敗的危險(xiǎn)將大大增加。許多研究者3,4的臨床資料都顯示：高劑量化療后，回輸經(jīng) cD34+正凈化的移植，在中位時(shí)間15天和11天后，中性粒細(xì)胞和血小板可分別達(dá)以0.5×109/L和20×109/L，此結(jié)果與未凈化的移植物產(chǎn)生的效果類似，證明 cD34+細(xì)胞具有完全重建造血的能力。近年深入的研究發(fā)現(xiàn)，許多造血系惡性腫瘤細(xì)胞，包括多數(shù)髓性白血病、部分急性淋巴母細(xì)胞白血病及淋巴瘤細(xì)胞皆可表達(dá) cD34抗原，對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤病人的 cD34+細(xì)胞群是否含有惡性成分，目前仍

5、有爭論。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，有人認(rèn)為1,2,5：在 cD34+細(xì)胞純化的同時(shí)也可能使腫瘤干細(xì)胞富集于移植物中。針對(duì)這一問題，人們已開始嘗試使用 cD34+ thy-1+ Lin-或 cD34+CD38-或 cD34+ hLA-DR為細(xì)胞表面標(biāo)志，以分離真正純凈的造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞。如此雖可得到腫瘤負(fù)荷極低的干細(xì)胞移植物，但常使 t、 b細(xì)胞、 nK細(xì)胞（ cD56+）、單核細(xì)胞（ cD14+）和 t輔助細(xì)胞（ cD4+）丟失，從而導(dǎo)致病人免疫恢復(fù)延遲。免疫負(fù)凈化利用免疫學(xué)方法將腫瘤細(xì)胞從自體移植物中清降稱為免疫負(fù)凈化(immunologic negative purging)，目前常用下列5種方法進(jìn)

6、行臨床和臨床前研究。補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用補(bǔ)體（ c）依賴的細(xì)胞毒作用即將 mcAb與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后再加入補(bǔ)體，從而殺死腫瘤細(xì)胞，達(dá)到凈化造血干細(xì)胞移植物的目的，也稱為 mcAb法。目前補(bǔ)體在臨床的應(yīng)用仍存在一些問題，例如大量補(bǔ)體的細(xì)胞毒作用常有變異，有時(shí)甚至對(duì)正常細(xì)胞也產(chǎn)生非特異性毒性。有人研究發(fā)現(xiàn)，作為補(bǔ)體來源的兔的年齡對(duì)取得最佳細(xì)胞毒效應(yīng)是重要的，取自25天兔血漿的補(bǔ)體優(yōu)于35天或45天兔；另外為避免補(bǔ)體失活帶來的弊端，用 mcAb-C進(jìn)行多次處理比單次處理效果更好。由于腫瘤細(xì)胞存在抗原異質(zhì)性，單一的 m cAb加補(bǔ)體只能清除2個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的胩瘤細(xì)胞，目前臨床研究多使用抗多種不同抗原決定簇的復(fù)

7、合型 mcAb，可除去4個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的腫瘤細(xì)胞。 anderson等6曾報(bào)告了用單抗（抗 cD10、 cD20和 pCA-1）加兔補(bǔ)體對(duì)26例多發(fā)性骨髓瘤病人進(jìn)行骨髓體外凈化的臨床研究結(jié)果：在骨髓回輸后，23例獲造血重建，粒細(xì)胞和血小板恢復(fù)（0.5×109/L和20×109/L）的中位時(shí)間分別為23天和25天。治療后完全緩解（ cR）11例，部分緩解（ pR）14例；隨訪至報(bào)告時(shí)，中位無進(jìn)展生存率（ pFS）達(dá)36個(gè)月，近期和遠(yuǎn)期療效均令人滿意。免疫磁珠用抗腫瘤 mcAb與磁性顆粒結(jié)合，在磁場作用下，可使與免疫磁珠相連的腫瘤細(xì)胞從移植中分離出來。與 mcAb-C法相比，免疫磁珠

8、不僅可清除低密度表達(dá)靶抗原的腫瘤細(xì)胞，而且對(duì)已耐受補(bǔ)體細(xì)胞毒作用的 b細(xì)胞腫瘤也有顯著療效，可清除46個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的腫瘤細(xì)胞，因此已成為目前臨床研究中最常用的體外凈化方法之一5，7。免疫毒素用于體外凈化的免疫毒素是由特異性抗體與細(xì)胞毒素結(jié)合而成，結(jié)合物中的抗體能特異地識(shí)別腫瘤細(xì)胞，使毒素對(duì)其產(chǎn)生選擇性殺傷效應(yīng)。常用的毒素如蓖麻毒素、白喉毒素、皂角毒等，大多通過抑制靶細(xì)胞核糖體的蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生細(xì)胞毒，為減輕這些毒素對(duì)正常造血細(xì)胞的毒性，人們采用單鏈免疫毒素（如苦瓜毒素）凈化移植或?qū)δ承┟庖叨舅氐慕Y(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，如通過封閉蓖麻毒素 b鏈的半乳糖結(jié)合區(qū)來阻止其與“非靶細(xì)胞”的非特異性結(jié)合。目前已發(fā)展了抗

9、 cD5、 cD7、 cD13、 cD14和 cD33、的免疫毒素，與 mcAb-C法相比，此法可更有效地清除腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常造血祖細(xì)胞保持較低毒性8。雙特異抗體最近已有人用雙特異抗體（ bispecific antibody ,BsAb）開展了自體骨髓體外凈化的臨床前研究。 bsAb能夠同時(shí)識(shí)別腫瘤靶細(xì)胞和免疫效應(yīng)細(xì)胞，因此兼有抗體特異性和介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的雙重功能，經(jīng)過合理設(shè)計(jì)的 bsAb能結(jié)合和聚集效應(yīng)細(xì)胞于腫瘤部位，激活效應(yīng)細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞溶解。 kanekno等9用 iL-2和抗 cD3單抗刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生 lAK活性，稱之為 t3LAK細(xì)胞，加用抗 cD3&

10、#215;抗 cD13的 bsAb后，可明顯增強(qiáng)對(duì) cD13+白血病細(xì)胞的殺傷。 silla等10研制的251×3G8的 bsAb，可同時(shí)與 cD33+腫瘤靶細(xì)胞和 cD16+的 nK細(xì)胞結(jié)合，對(duì)正常骨髓中混入的 hL-60白血病細(xì)胞株有較強(qiáng)毒性，但不損害造血祖細(xì)胞。細(xì)胞因子激活的免疫效應(yīng)細(xì)胞自外周血來源的 lAK細(xì)胞體外凈化急性淋巴細(xì)胞白血病病人骨髓獲得成功以來，如何利用人體自身的免疫效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行移植物凈化已成為日益受到重視的研究方向。 margolin等11進(jìn)一步研究了 iL-2激活的骨髓單個(gè)核細(xì)胞（ bone marrow mononuclear cells ,BMMC）后發(fā)現(xiàn)

11、：對(duì)于進(jìn)行自體骨髓移植的緩解期的急性白血病人， bMMC對(duì)耐藥的微小殘留?。?mRD）有顯著的細(xì)胞毒作用，并不影響造血細(xì)胞的生長。在許多慢性髓性白血病（ cML）病例， lAK細(xì)胞卻不能有效地殺傷腫瘤細(xì)胞，關(guān)于 cML細(xì)胞對(duì) lAK細(xì)胞產(chǎn)生抵抗的原因目前尚不清楚。有學(xué)者報(bào)告，用外周血淋巴細(xì)胞與 iFN-孵育1天后再加入 iL-1、涸和 cD3單抗共同孵育1天，可得到細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（ cytokine induced kill cells CIK cells）它能高效地殺滅 cML細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)顯示12： cIK細(xì)胞對(duì) cML細(xì)胞顯著的細(xì)胞毒作用主要來自細(xì)胞因子刺激產(chǎn)生的 cD3+/CD56

12、+細(xì)胞。 dickinson等13的研究表明， iL-2聯(lián)用 iFN-或 tNF-與骨髓在體外共同孵育，不僅激活骨髓中 nK細(xì)胞產(chǎn)生 lAK活性，而且使 cD3+、 cD8+、 cD25+和 cD56+細(xì)胞數(shù)量明顯增多，這些被激活的免疫效應(yīng)細(xì)胞共同發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，使細(xì)胞毒作用顯著增強(qiáng)。 免疫雙凈化將免疫正、負(fù)凈化法結(jié)合起來進(jìn)行移植物體外凈化被稱為免疫雙凈化（ immunologic double purging）。1996年 nimgaonker等14報(bào)道了用 cD34+正凈化聯(lián)合 mcAb-C負(fù)凈化對(duì) aML病人移植物進(jìn)行雙凈化，證實(shí)此法能使凈化效果明顯提高，使白血病細(xì)胞減少7個(gè)對(duì)數(shù)

13、級(jí)， cD15+細(xì)胞減少14個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，造血細(xì)胞無明顯損失。最近的臨床研究表明，用免疫磁珠 cD34+正凈化聯(lián)合抗 b細(xì)胞抗體的免疫磁珠負(fù)凈化明顯優(yōu)于單一的免疫正凈化或負(fù)凈化，而外周血造血祖細(xì)胞重建造血功能并未降低。研究者們5將此法用于被腫瘤嚴(yán)重污染的慢性淋巴細(xì)胞白血?。?cLL）病人骨髓，清除了超過6個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)的 cLL細(xì)胞，他們認(rèn)為此法不僅可達(dá)到更為徹底的凈化，而且可清除 cD34+細(xì)胞純化后可能存在于移植物中的腫瘤干細(xì)胞（ cD34+ cD19+）。 beaujean等7的臨床研究也得到了類似的結(jié)果。綜上所述，免疫凈化法因其特異性強(qiáng)、殺傷腫瘤細(xì)胞效率高，對(duì)造血細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于臨

14、床自體造血干細(xì)胞移植的體外凈化。從長遠(yuǎn)看， cD34+正凈化聯(lián)合免疫負(fù)凈化的雙凈化措施可保留高純度的造血干細(xì)胞，最大限度地清除腫瘤細(xì)胞，在自體造血干細(xì)胞移植中有著廣闊的應(yīng)用前景。參考文獻(xiàn)1 cremer FW, Kiel k,Sucker C et al .Leukemia,1997;11(Suppl 5):S41-S462 bensinger WI.Bone marrow Transplant,1998;21:113-1153 koc ON, Gerson sL,Phillips GL et al.Bone Marrow Transplant,1998;21:337-3434 hohaus

15、S,Pforsich M, murea S et al .Br J Haematol,1997;97:881-8885 paulus U,Schmitz n,Viehmann K et al.Bone Marrow Transplant,1997;20:415-4206 anderson KC,Anderson j,Soiffer R et al. Blood,1993;82(8):2568-25767 beaujean F, Bennaceur aL,Brault P et al.Bone Marrow Transplant,1997;19(Suppl 1):S538 roy DC,Perreault c,Belanger R et al.Clin Immunol,1995;15:51-579 kanekno T, Fusanch Y, kakui Y et al .Leuk Lymphoma,1994;14(3-4):219-22910 silla IM,Chen J ,Zhong rK et al.Br J Haematol,1995;89:712-71811 margolin KA,Wright C, foman SJ et al .Leukemia,1997;11(57):723-72812