腎活檢組織標(biāo)本的制作

1、第三章第10節(jié)腎活檢組織標(biāo)本的制作前 言 腎活檢病理是診斷腎臟疾病的重要手段，許多疾病的命名主要源于腎活檢組織學(xué)改變，如局灶節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎病。腎活檢病理診斷的正確性與腎組織標(biāo)本制作質(zhì)量關(guān)系密切，質(zhì)量不過(guò)關(guān)（如切片不夠薄，染色不清晰）將直接造成診斷錯(cuò)誤，因此，應(yīng)重視腎活檢標(biāo)本處理（取材、固定、包埋、切片到染色）的各個(gè)環(huán)節(jié)，以保證病理診斷的正確性。腎臟病理包括尸檢和活檢標(biāo)本，對(duì)于腎臟疾病而言，主要是活檢標(biāo)本，本章主要介紹腎活檢標(biāo)本的處理。目前常規(guī)腎活檢標(biāo)本來(lái)源有兩類：一類為切割式活檢，一類為穿刺抽吸式活檢，前者所取組織較多，但對(duì)腎臟損傷較大，不便在臨床推廣，臨床常采用穿刺抽吸式活檢。一、

2、腎組織取材 腎活檢穿刺時(shí)病理技術(shù)員必須到場(chǎng)，以便對(duì)腎組織標(biāo)本進(jìn)行正確的處理，在技術(shù)員不能到場(chǎng)的情況下，必須按以下要求對(duì)標(biāo)本處理者進(jìn)行培訓(xùn)：處理穿刺所獲組織應(yīng)輕柔，避免牽拉或用力鉗夾組織；分取組織時(shí)應(yīng)在蠟板上進(jìn)行，用鋒利的刀片快速切割，避免用力擠壓組織；盡量用含固定液（光鏡或電鏡）和生理鹽水的專用鑷子把分割好的組織塊移入固定瓶?jī)?nèi)；用鑷子時(shí)避免鉗夾組織過(guò)度而造成組織受擠壓；要求穿刺者盡量取兩條組織。穿刺所獲第一條含皮質(zhì)組織送光鏡檢查，第二條組織在肉眼觀察下進(jìn)行分割，盡量切取皮質(zhì)區(qū)1mm組織送電鏡檢查，余下組織送免疫熒光檢查。如果穿刺僅獲一條組織，所取組織有三種情況（圖3-10-1）：整條均為皮質(zhì)，

3、皮髓組織和皮-髓-皮質(zhì)組織，髓質(zhì)區(qū)血供豐富，顏色略紅，皮質(zhì)區(qū)組織略白，分布的紅色小點(diǎn)是腎小球，根據(jù)穿刺獲取不同組織的情況，如圖3-10-1所示進(jìn)行分取。也有人建議縱切后，一半送光鏡檢查，一半分割后分送免疫熒光和電鏡檢查，但存在組織太細(xì)，不易觀察的缺點(diǎn)，臨床較少使用。分送免疫熒光檢查的組織用無(wú)菌的TRIS或PBS溶液浸濕的沙布輕輕包裹，置于培養(yǎng)皿中，避免直接置于冰塊上，以免局部組織因冷凍收縮，造成結(jié)構(gòu)破壞1,2。腎活檢穿刺組織的分取圖3-10-1 腎活檢穿刺組織的分取LM：光鏡；IF：免疫熒光；EM：電鏡二、光鏡標(biāo)本的處理 （一）固定光鏡標(biāo)本的固定液有多種。目前最常用的固定液為10%的中性福爾馬

4、林。中性福爾馬林固定液的配方：甲醛（40%） 100 ml、蒸餾水 900 ml、磷酸二氫鈉4 g、磷酸氫二鈉 6.5 g，固定時(shí)間至少612 h。（二）前期處理1. 脫水 脫水的目的是去除固定和水洗后組織中的水分，便于后續(xù)的透明和浸蠟，常用的脫水劑是乙醇或丙酮，后者脫水能力比乙醇強(qiáng)，但對(duì)組織收縮較大，致使組織變脆，多用于快速脫水。為了徹底脫水，一般常規(guī)采用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水：70%乙醇 1020 min，2次；80%乙醇 1020 min，2次；90%乙醇 1020 min，2次；95%乙醇 1020 min，2次；無(wú)水乙醇 1020 min，2次。2. 透明 透明的目的是便于石蠟包

5、埋，因?yàn)榻M織脫水后，所用的脫水劑大多數(shù)不能和石蠟相混合，必須通過(guò)透明劑的作用才能浸蠟，所用的透明劑必須既能和脫水劑相混合，又能和石蠟相混合，起到橋梁作用，不但能提出脫水劑，又能代替脫水劑利于石蠟的浸入。當(dāng)組織全部為透明劑占有時(shí)，光線可以透過(guò)，組織可呈現(xiàn)不同程度的透明狀態(tài)，故稱為透明。透明劑都是石蠟溶劑，絕大多數(shù)都不能與水混合，最常用的透明劑包括二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油等。（1）二甲苯：是應(yīng)用最廣的一種透明劑，價(jià)格便宜，沸點(diǎn)為144C，折光率為1.497，易揮發(fā)，無(wú)色透明液體，易溶于乙醇又能溶解于石蠟，不能和水混合，透明力強(qiáng)，作用較快。最大的缺點(diǎn)是容易使組織收縮變硬變脆，所以組織不

6、能停留過(guò)久。通常在組織進(jìn)入二甲苯以前先經(jīng)過(guò)1/2純乙醇和1/2的二甲苯的混合液。（2）甲苯：性質(zhì)同二甲苯，沸點(diǎn)110.8C，價(jià)格亦較便宜，透明較慢，但優(yōu)點(diǎn)是組織在其內(nèi)停留1224 h也不變脆，故優(yōu)于二甲苯。（3）氯仿：組織在其中浸存較久時(shí)收縮不明顯，也不變脆。因?yàn)樗囊讚]發(fā)性，滲入組織的氯仿，高溫時(shí)比二甲苯易揮發(fā)，是其優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是滲透力稍弱，比二甲苯和甲苯慢，故透明時(shí)間較二甲苯時(shí)間延長(zhǎng)2-3倍。3. 浸透和包埋 組織經(jīng)過(guò)脫水和透明后，要讓石蠟等支持劑透入內(nèi)部使組織變硬，并將組織包埋以利于切片，這個(gè)過(guò)程稱為“浸透”和“包埋”。浸透的目的在于去除組織中的透明劑而代之以石蠟，使石蠟滲入組織內(nèi)部后把軟

7、組織變?yōu)橛杏捕鹊南瀴K，便于切片。石蠟是最常用的包埋劑。使用優(yōu)質(zhì)石蠟?zāi)鼙ＷC切片厚度，無(wú)刀痕。根據(jù)石蠟熔點(diǎn)不同，石蠟分為軟蠟和硬蠟，軟蠟熔點(diǎn)低，硬蠟熔點(diǎn)高。一般在室溫高時(shí)用熔點(diǎn)高的蠟，室溫較低時(shí)用熔點(diǎn)低的蠟。4. 切片 將蠟塊修理成小梯形狀，進(jìn)行連續(xù)切片，常規(guī)切片厚度為2 mm，有條件可進(jìn)行1.5 mm的連續(xù)切片。對(duì)于特殊染色，如剛果紅則需厚度為5 mm的切片35。（三）染色腎組織標(biāo)本既要觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)，又要觀察基底膜病變，許多腎臟疾病與免疫復(fù)合物相關(guān)，因此腎活檢標(biāo)本除常規(guī)蘇木素-伊紅（Hematoxyln-Eosin，HE）染色，需要多種特殊染色如PAS（periodic-acid schiff，

8、PAS）、PASM（periodic acid-silver methenamine，PASM）和Masson三色染色等68。1. 蘇木素-伊紅染色法 HE染色法即常規(guī)染色法，主要顯示各種組織正常成分和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行全面觀察。目前關(guān)于病理組織學(xué)的基本知識(shí)，絕大部分都是基于對(duì)HE染色切片的觀察。在HE染色上基本可以觀察到各種組織或細(xì)胞的一般形態(tài)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和病變的發(fā)生、發(fā)展及修復(fù)。（1）蘇木素染液配制方法：將蘇木素溶于乙醇，傾入明礬液中，混合后煮沸，加入氧化汞1 g，以玻棒攪勻，溶液呈深紫色，立即移入冷水中，使之冷卻。靜置過(guò)夜，過(guò)濾封閉保存，用前若加5醋酸則染色較佳。配方為：蘇木素 0.

9、9g、醋酸 12 ml、氧化汞 0.51.0 g、蒸餾水 200 ml、純乙醇 10 ml、甘油 20 ml、鉀明礬 20 g。（2）伊紅乙醇配制方法：將伊紅乙醇溶解后，用滴管滴加醋酸使其呈糊狀，加數(shù)毫升蒸餾水即可，過(guò)濾，將濾出的沉渣在烤箱中烤干，溶于95乙醇200ml中即可。配方為：伊紅 1 g、蒸餾水10 ml、醋酸數(shù)滴。（3）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水；蘇木素染色310 min；自來(lái)水充分沖洗35 min；0.5%1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒鐘；自來(lái)水沖洗15 min；弱堿性水溶液返藍(lán)；自來(lái)水至蒸餾水沖洗510 min或更長(zhǎng)；0.5%1%的伊紅3 min；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。（

10、4）染色結(jié)果：細(xì)胞核被蘇木素染成鮮明的藍(lán)色，軟骨基質(zhì)、鈣鹽顆粒呈深藍(lán)色，黏液呈灰藍(lán)色。細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色至桃紅色，胞質(zhì)內(nèi)嗜酸性細(xì)胞顆粒被染成反光強(qiáng)的鮮紅色，膠原纖維呈淡粉紅色，彈力纖維呈亮粉紅色。高質(zhì)量的HE染色細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)藍(lán)紅相映，且胞核鮮明，核膜、核仁及核染色質(zhì)顆粒均清晰可見（圖3-10-2）。圖3-10-2 HE染色：細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（400）2. PAS染色法 PAS染色法屬于特殊染色，不僅能顯示糖原，而且還能顯示中性和某些酸性黏液性物質(zhì)、軟骨、腦垂體、霉菌、脂質(zhì)、色素、淀粉樣物質(zhì)及基底膜。PAS的染色原理為：過(guò)碘酸是一種氧化劑，它能氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1,

11、 2-乙二醇基，使之變?yōu)槎?；醛與Schiff氏試劑結(jié)合生成一種品紅化合物，顯現(xiàn)為紅色。（1）Schiff氏液配制方法：將蒸餾水煮沸，冷至60，溶入堿性品紅，冷卻后過(guò)濾，至50時(shí)加鹽酸，25時(shí)加偏重亞硫酸鈉，黑暗中貯放過(guò)夜，加入活性碳，搖1 min后過(guò)濾，4暗色瓶中備用。配方為：堿性品紅1 g、偏重亞硫酸鈉2 g、1N鹽酸20 ml、活性碳2 g、蒸餾水 200 ml。（2）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水；1%高碘酸氧化10 min，水洗；Schiff 氏液10 min，水洗；蘇木素染核，鹽酸分化，水洗；脫水，透明，封片。（3）染色結(jié)果：糖原、基底膜及其他PAS陽(yáng)性物質(zhì)均呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（表3

12、-10-1）。腎小球基底膜、系膜基質(zhì)、包曼囊壁、腎小管基底膜陽(yáng)性，淀粉樣物質(zhì)弱陽(yáng)性（圖3-10-3）。3. PASM染色 組織中的粘多糖和蛋白質(zhì)與銀化合物結(jié)合后，再經(jīng)過(guò)甲醛還原成為金屬銀，沉淀于組織內(nèi)及表面，呈黑色，因此，這些物質(zhì)又稱為嗜銀性物質(zhì)（表3-10-2）。同時(shí)再套用Masson紅復(fù)染，以顯示免疫復(fù)合物的沉積。（1）六胺銀液配制（用時(shí)現(xiàn)配，硝酸銀在切片放入染缸前加入并搖勻）。配方為：預(yù)溫蒸餾水 23ml、15六次甲基四胺 6ml、5硼砂 4.5 ml、冰醋酸 1.0 ml、磷鎢酸 0.8g。PAS反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)物質(zhì)種類舉例物質(zhì)染色結(jié)果多糖糖原強(qiáng)陽(yáng)性糖蛋白膠原纖維、網(wǎng)狀纖維、血清白蛋白、球

13、蛋白強(qiáng)陽(yáng)性基底膜腎小球基底膜、腎小管基底膜、包曼囊壁中等強(qiáng)度淀粉樣物質(zhì)淀粉樣物質(zhì)弱陽(yáng)性各種色素脂褐素中等強(qiáng)度軟骨 軟骨強(qiáng)陽(yáng)性霉菌曲菌強(qiáng)陽(yáng)性表3-10-1 PAS反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)圖3-10-3 PAS染色：腎小球系膜區(qū)基質(zhì)，腎小球毛細(xì)血管袢，包曼囊壁及腎小管基底膜呈粉紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（400）（2）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水；3%的碘溶于100ml30%的乙醇，配制成碘乙醇，5 min脫汞，水洗；5%硫代硫酸鈉5 min脫碘，水洗；1%高碘酸氧化20 min，水洗；六胺銀液45 min（根據(jù)光鏡下染色結(jié)果確定染色時(shí)間），水洗；3%硫代硫酸鈉5 min，水洗；Masson紅復(fù)染；快速脫水，透明，封片

14、。（3）染色結(jié)果：腎小球基底膜、包曼囊壁、腎小管基底膜呈黑色，免疫復(fù)合物為紅色（圖3-10-4），本染色對(duì)觀察腎小球基底膜病變，免疫復(fù)合物的沉積非常重要，是腎活檢必不可少的染色。*圖3-10-4 PASM染色：腎小球基底膜及包囊壁呈黑色，免疫復(fù)合物呈紅色，可見內(nèi)皮下（所示）、上皮側(cè)（所示）和系膜區(qū)（*所示）嗜復(fù)紅物沉積（1000）4. Masson三色染色 用多種（3種以上）顏色顯示多種組織（結(jié)締組織）成分，用于判定各種組織、器官的病變與修復(fù)情況，以不同色調(diào)顯示與區(qū)分某些非結(jié)締組織及物質(zhì)成分。（1）Masson紅染液配制方法：變色酸2R 0.6g、蒸餾水 100 ml、亮綠0.3 g、冰醋酸

15、1.0 ml、磷鎢酸 0.8 g。（2）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水；蘇木素染核5 min，鹽酸分化，水洗；Masson紅30 秒，水洗；0.5%亮綠30秒；快速脫水，透明，封片。（3）染色結(jié)果：膠原纖維呈綠色，免疫復(fù)合物呈紅色，纖維素呈紅色（圖3-10-5，表3-10-3）。*g圖3-10-5 Masson三色染色：腎小球基底膜，包囊壁呈藍(lán)色，免疫復(fù)合物呈紅色，可見內(nèi)皮下（所示）、上皮側(cè)（所示）和系膜區(qū)（*所示）（400）5. 剛果紅染色 剛果紅是一種分子為長(zhǎng)線狀的偶氮染色劑，以胺基和淀粉樣物質(zhì)的羥基結(jié)合，平行的附著在淀粉樣纖維上，從而使淀粉樣物質(zhì)被染成橙紅色。（1）剛果紅染液配制方法：1Na

16、OH 0.3 ml、80乙醇氯化鈉剛果紅飽和溶液 30 ml。PASM染色反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)物質(zhì)種類染色結(jié)果各種基底膜：腎小球基底膜、包曼囊壁和腎小管基底膜強(qiáng)陽(yáng)性：黑色系膜基質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性：黑色免疫復(fù)合物紅色淀粉樣物質(zhì)不嗜銀表3-10-2 PASM染色反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)Masson三色染色反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)物質(zhì)種類染色結(jié)果各種基底膜：腎小球基底膜、包曼囊壁和腎小管基底膜強(qiáng)陽(yáng)性：藍(lán)綠色系膜基質(zhì)強(qiáng)陽(yáng)性：藍(lán)綠色免疫復(fù)合物紅色淀粉樣物質(zhì)淡染的藍(lán)綠色膠原及纖維組織藍(lán)綠色表3-10-3 Masson三色染色反應(yīng)陽(yáng)性物質(zhì)（2）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水（切片厚度5 mm）；蘇木素染核，分化，水洗；堿性剛果紅液20 min；快速脫水

17、，透明，封片。（3）染色結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈橙紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（圖3-10-6a）。6. 高錳酸鉀-堿性剛果紅染色 步驟同剛果紅染色，在染剛果紅之前，用高錳酸鉀處理后，AA型淀粉樣物質(zhì)被降解，再行剛果紅染色，不著色，為陰性，以區(qū)分AA型和非AA型淀粉樣變性。（1）染色過(guò)程：切片常規(guī)脫蠟入水（切片厚度5 mm）；高錳酸鉀-硫酸液3 min，水洗；5%草酸漂白3 min，水洗；蘇木素染核，分化，水洗；堿性剛果紅液20 min；快速脫水，透明，封片。（2）染色結(jié)果：淀粉樣物質(zhì)呈橙紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色（圖3-10-6b）。（四）各種染色過(guò)程注意事項(xiàng)常規(guī)脫蠟要徹底；每次染色前雙層濾紙過(guò)濾蘇木素；Schif

18、f氏液要4C保存；PASM-Masson染色標(biāo)本缸要干凈、無(wú)水滴，切片要求90C烤30 min，顯微鏡下控制染色深淺；剛果紅染色切片厚度要求5 mm。ab圖3-10-6 a：剛果紅染色，腎小球系膜區(qū)，部分腎小管基底膜呈磚紅色（400）；b：高錳酸鉀剛果紅染色，經(jīng)高錳酸鉀處理后，非AA型淀粉樣變性剛果紅染色仍陽(yáng)性（400）三、免疫病理標(biāo)本的制作3, 4 免疫病理所采用的標(biāo)本可用石蠟和冰凍切片，冰凍切片的腎組織新鮮，抗原保存好，并能在70C冰箱保存使用。石蠟切片的制備同光鏡標(biāo)本。下面主要介紹冰凍切片的制備。（一）冰凍標(biāo)本的制備腎活檢取材用于制備冰凍切片的標(biāo)本，應(yīng)放在預(yù)先用TRIS或PBS溶液濕潤(rùn)的

19、干凈紗布上，連同紗布放入清潔的玻璃小瓶或培養(yǎng)皿中，迅速放入冰桶中送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冰凍切片，避免直接放于冰塊上，以免局部組織凍壞。也可采用速凍方法進(jìn)行準(zhǔn)備。組織速凍方法分液氮法和干冰-丙酮法。液氮法：將腎活檢后切取組織放入預(yù)先準(zhǔn)備好的小容器中，緩慢放入液氮中，待組織接觸液氮開始?xì)饣?，組織迅速冷凍形成冰塊，取出后在液氮中送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行冰凍切片，如不及時(shí)切片，也可放入液氮中或70C冰箱中保存。干冰-丙酮法：準(zhǔn)備好內(nèi)放有OCT（Optimal cutting temperature，OCT）包埋劑的標(biāo)本盒，將組織塊完全浸沒即可。向裝有干冰的保溫杯內(nèi)加入丙酮，調(diào)成糊狀，將標(biāo)本盒放入干冰中，待包埋劑變成白色凍

20、塊時(shí)，取出保存或切片同液氮法。進(jìn)行組織速凍時(shí)須注意，組織不能直接放入液氮，以免組織膨脹破碎，速凍用的包埋劑應(yīng)適量，新鮮組織不能緩慢冷卻，否則形成冰晶，造成組織結(jié)構(gòu)破壞，冷凍后的組織應(yīng)密封保存，否則會(huì)失水，組織塊復(fù)溫時(shí)，應(yīng)在37C加溫速融，不能自然復(fù)溫，否則造成組織結(jié)構(gòu)破壞9。（二）冰凍切片將腎組織置于恒溫冷凍切片機(jī)的冷凍頭上，加少許OCT進(jìn)行包埋，在20C下進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度為34 m，一般切取20張，用于常規(guī)免疫病理（包括免疫熒光法和免疫組織化學(xué)法）及放入20C冰箱備用。（三）免疫熒光法1. 直接法 用熒光素標(biāo)記的抗體與腎組織直接作用，在熒光顯微鏡下觀察，以達(dá)到檢測(cè)目的（圖3-10-7）

21、。常用于直接法檢測(cè)的熒光抗體包括：抗IgG、IgA、IgM、C3、C4和C1q抗體10。具體步驟：冰凍切片用10%小牛血清封閉（PBS稀釋）；去除多余液體，加稀釋好的抗體，避光，濕盒內(nèi)室溫孵育40 min；流水沖洗，置75%乙醇1 min，無(wú)水乙醇1 min，吹干；甘油封片，熒光顯微鏡觀察。免疫熒光直接法和間接法示意圖直接法間接法熒光標(biāo)記抗體熒光標(biāo)記第二抗體第一抗體組織切片圖3-10-7免疫熒光直接法和間接法示意圖2. 間接法 用特異性抗體（一抗，未標(biāo)記熒光）與腎組織結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，再用針對(duì)一抗的標(biāo)記熒光素的二抗與上述抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光，在熒

22、光顯微鏡下觀察。間接法較直接法敏感510倍，而且只需一種標(biāo)記的熒光抗體（圖3-10-8）。常用間接法檢測(cè)的熒光抗體包括免疫球蛋白輕鏈，載脂蛋白A、E（Apo A,Apo E），乙肝抗原，腎組織IV型膠原等10。具體步驟：冰凍切片如已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干）；10%小牛血清封閉（PBS稀釋）；去除多余液體，加稀釋好的抗體后，避光，室溫1.5 h；PBS沖洗3次；加熒光標(biāo)記的第二抗體，避光，置室溫40 min，水洗；吹干，甘油封片，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。ab圖3-10-8a：直接法，IgG沿腎小球毛細(xì)血管袢分布；b：間接法，腎小球毛細(xì)血管袢內(nèi)Apo E陽(yáng)性（四）免疫

23、酶標(biāo)技術(shù)免疫酶標(biāo)技術(shù)（immunoenzymatic technique）是指用酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)，其原理及操作程序與免疫熒光技術(shù)基本相似，差別在于用酶代替熒光素作為標(biāo)記物，并以底物被酶分解后的顯色深淺來(lái)反映組織中抗原或抗體的含量及位置，常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidese，HRP）和堿性磷酸酶（alkaline phosphatese，AKP），常用的顯色劑 有DAB（3,3-二氨基聯(lián)苯胺）和AEC（3-氨基-9-乙基卡巴唑），前者為棕色（圖3-10-9a），可長(zhǎng)期保存，后者為紅色（圖3-10-9b），易于褪色。免疫酶技術(shù)用于正常和病

24、理組織中，稱為酶免疫組織化學(xué)技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)為：可用普通光學(xué)顯微鏡觀察，酶標(biāo)記抗體染色后，標(biāo)本還可用其他染料復(fù)染，以顯示細(xì)胞形態(tài)或細(xì)胞核，標(biāo)本可長(zhǎng)期保存。最常用的是過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶法，簡(jiǎn)稱PAP法，此外還有生物素和親和素（ABC）法。免疫酶標(biāo)技術(shù)分為間接法和直接法，其原理同免疫熒光直接法和間接法12。下面分別介紹其步驟。ab圖3-10-9免疫酶標(biāo)染色a：胰島Amylin染色，DAB顯色為棕色；b：腎組織Cytokeratin染色，AEC顯色為紅色1. 直接法 標(biāo)本固定，冰凍切片已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干），石蠟切片脫蠟、入水；PBS洗滌23 min； 3.1

25、H2O2（或1 H2O2 甲醇）抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物，室溫1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室溫20 min；滴加酶標(biāo)記的抗體371 h或4過(guò)夜；PBS洗滌33 min；DABH2O2顯色510 min，鏡下控制染色結(jié)果。DABH2O2應(yīng)用前15 min配制；充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。2. 間接法 標(biāo)本固定，冰凍切片已干燥，可直接染色（如從低溫冰箱取出的冰凍切片，須充分吹干），石蠟切片脫蠟、入水；PBS洗滌23 min；1H2O2（或1H2O2 甲醇）抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物，室溫1020 min；正常血清（1 : 10）孵育，室溫20 min；滴加第一抗體，371 h或

26、4過(guò)夜；PBS洗滌33 min；滴加酶標(biāo)二抗，室溫1 h；PBS洗滌33 min；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min；充分水洗后，復(fù)染、脫水、透明、封片、鏡檢。3. 單PAP法 標(biāo)定固定后，PBS洗滌；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物，室溫1020 min；PBS洗滌23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室溫20 min；滴加一抗，室溫1 h或4過(guò)夜；PBS洗滌33 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS洗滌33 min；加PAP復(fù)合物，室溫60 min；PBS洗滌33 min；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min（圖3-10-9）；

27、充分水洗； 蘇木素復(fù)染，封片觀察。4. PAP四層法（圖3-10-10）：同單PAP法；二次加酶標(biāo)二抗；PBS沖洗；二次加PAP；PBS沖洗；0.04DAB0.03 H2O2顯色510 min；蘇木素復(fù)染核，封片，鏡檢。5. 生物素和親和素法（ABC法） 標(biāo)定固定后，PBS洗滌；1H2O2（或1H2O2 甲醇）阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物，室溫1020 min；PBS洗滌23 min；正常血清（二抗的正常血清）孵育，室溫20 min；滴加一抗，室溫1 h或4過(guò)夜；PBS洗滌33 min；滴加二抗，室溫30 min；PBS洗滌33 min；加ABC液，室溫60 min；PBS洗；0.04DAB0.03 H

28、2O2顯色510 min（圖3-10-11）；充分水洗；蘇木素復(fù)染核，封片，鏡檢。過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶抗體復(fù)合物四層法圖3-10-10 過(guò)氧化物酶抗過(guò)氧化物酶抗體復(fù)合物四層法生物素和親和素法（ABC法）圖3-10-11 生物素和親和素法（ABC法）四、電鏡標(biāo)本的制備 許多腎臟疾病必須依靠電子顯微鏡觀察腎小球基底膜、電子致密物的沉積部位，沉積物的特點(diǎn)以及細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)的變化來(lái)明確診斷。電鏡標(biāo)本的制作過(guò)程與石蠟切片相似，也包括取材、固定、脫水、滲透、包埋、聚合、切片和染色等幾個(gè)環(huán)節(jié)1215。而與石蠟切片不同的是，電鏡標(biāo)本的制備操作過(guò)程更為細(xì)致與復(fù)雜，要求更為嚴(yán)格，而且所用的試劑及配方也不盡相同

29、。（一）取材取材是電鏡標(biāo)本制備的第一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。取材是否正確與制備出來(lái)的樣品能否符合觀察要求直接相關(guān)。由于生物體內(nèi)代謝非常迅速，生物組織離體后，細(xì)胞將會(huì)釋放出各種水解酶引起細(xì)胞自溶，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生微細(xì)的結(jié)構(gòu)變化。這些微細(xì)的改變?cè)诠忡R下也許無(wú)法察覺，在電鏡下則會(huì)呈現(xiàn)為明顯的變化。因此，取材應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：在冷板上分離切取組織，動(dòng)作應(yīng)迅速，盡快使組織浸入4C固定液中，從而最大程度地保存組織在生活狀態(tài)時(shí)的結(jié)構(gòu)；組織塊大小不超過(guò)1 mm3； 取樣時(shí)所用的器具必須干凈，刀、剪等必須鋒利，在操作時(shí)盡量避免拉、鋸、壓等動(dòng)作對(duì)組織細(xì)胞造成的機(jī)械損傷；腎活檢超微結(jié)構(gòu)觀察主要是腎小球，應(yīng)取腎皮質(zhì)部位的組織，含腎小球

30、13個(gè)，因組織塊不能太大，應(yīng)取34塊，以避免未取到腎小球，影響觀察。（二）固定、脫水和包埋固定是制樣過(guò)程中最關(guān)鍵的一步。它的失敗將導(dǎo)致整個(gè)制樣過(guò)程的后續(xù)步驟完全無(wú)效。固定是終止組織細(xì)胞的生化過(guò)程，同時(shí)把它們的超微結(jié)構(gòu)改變控制在最小范圍內(nèi)，并保護(hù)這些結(jié)構(gòu)在后續(xù)的脫水、包埋等過(guò)程中不被破壞?？晒┻x擇使用的固定劑種類和固定方法及方式很多，它們各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。判斷固定良好的標(biāo)準(zhǔn)見表3-10-4。目前腎活檢組織常用的固定方法是化學(xué)固定法，浸泡方式固定，采用戊二醛和四氧化鋨雙重固定。1. 常用的固定劑和包埋劑（1）戊二醛（glutaraldehyde）：戊二醛是一種五碳醛，含有兩個(gè)醛基。分子式為C5H8O

31、2，分子量為100。電鏡固定通常采用電鏡專用的25戊二醛水溶液稀釋成需要的濃度。其pH為4.05.0。氧氣、高溫、中性或堿性pH均能使戊二醛發(fā)生聚合失去醛基，并降低交聯(lián)效力，所以平時(shí)這種原液應(yīng)在低溫保存。此外，戊二醛存放時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，pH值會(huì)降低，顏色變黃，固定效力也大大降低，若戊二醛pH值降至3.5以下或含有其他雜質(zhì)時(shí)，必須純化后才能使用。戊二醛對(duì)皮膚有硬化作用，但它的揮發(fā)性較甲醛弱，最好能在通風(fēng)櫥中操作。 戊二醛優(yōu)點(diǎn)：在固定劑中它與蛋白質(zhì)的交聯(lián)能力最好，也能固定糖原和核酸，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微管和一些酶的活性保存較好，是保存精細(xì)結(jié)構(gòu)最好的醛；反應(yīng)速度快，是優(yōu)良的前固定劑，滲透速度比四氧化鋨快；能彌補(bǔ)

32、四氧化鋨的不足，對(duì)糖原、核酸，尤其是對(duì)微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞基質(zhì)固定效果較好；戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以長(zhǎng)時(shí)間固定（但最好不要超過(guò)1個(gè)星期），因而適用于遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室或野外現(xiàn)場(chǎng)取材。但戊二醛在稀釋溶液中會(huì)自行發(fā)生一系列反應(yīng)，因而固定液應(yīng)盡可能新鮮配制，配制好的固定液和戊二醛前固定后的樣品應(yīng)在4下儲(chǔ)存。戊二醛的缺點(diǎn)：它不能固定脂質(zhì)，致其在以后的脫水過(guò)程中被有機(jī)溶劑溶去，不宜作單獨(dú)的固定劑使用。無(wú)法提供高反差，需與四氧化鋨同時(shí)進(jìn)行前后固定，相互彌補(bǔ)不足。戊二醛固定不影響細(xì)胞的滲透性，對(duì)緩沖液和滲透壓要求較高。（2）四氧化鋨（Osmium tetroxide）：四氧化鋨是一種很強(qiáng)的氧化劑，呈淺黃色結(jié)晶

33、，其分子式OsO4，分子量254，熔點(diǎn)41，沸點(diǎn)131，飽和水溶液的濃度為7.24（25），它的水溶液為中性，有極大毒性。商品化產(chǎn)品有密封的四氧化鋨晶體和2%的四氧化鋨水溶液兩種。四氧化鋨晶體溶于水的速度很慢，必要時(shí)可以使用超聲波設(shè)備來(lái)加速溶解。配制好的2四氧化鋨水溶液使用方便，較常使用。但要特別注意的是無(wú)論是四氧化鋨晶體還是水溶液都會(huì)揮發(fā)出四氧化鋨氣體，即使在0時(shí)也有四氧化鋨氣體釋放，因此，應(yīng)將四氧化鋨置于密閉容器（玻璃容器）中保存。四氧化鋨氣體對(duì)呼吸系統(tǒng)有刺激，對(duì)眼睛有嚴(yán)重的破壞作用，因此，在使用時(shí)應(yīng)特別小心，盡可能在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，并且嚴(yán)格控制用量。廢棄的四氧化鋨溶液應(yīng)加入乙醇水溶液或硫酸

34、亞鐵溶液，使四氧化鋨轉(zhuǎn)化為黑色沉淀，以降低毒性，方便收集處理。判斷電鏡標(biāo)本固定良好的標(biāo)準(zhǔn)部位標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞膜低倍下呈完整清晰的單層結(jié)構(gòu)，高倍下見雙層結(jié)構(gòu)核膜內(nèi)外膜完整，基本平行，可見核孔線粒體飽滿，外膜完整光滑，內(nèi)嵴連續(xù)，內(nèi)、外膜間保持一定距離，沒有腫脹或收縮粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池完整，膜上核糖體可辨，沒有脫落或丟失滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈分枝小管狀或泡狀，膜完整高爾基復(fù)合體扁平囊成堆疊排列，膜完整核內(nèi)含物核仁、核液及染色質(zhì)保存完好，并層次清楚可辨糖原顆粒致密，保存良好，沒有丟失細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)呈精細(xì)顆粒狀，分布均勻，未見明顯的空白區(qū)表3-10-4判斷電鏡標(biāo)本固定良好的標(biāo)準(zhǔn)四氧化鋨固定劑的優(yōu)點(diǎn)： 四氧化鋨可以與脂類、糖類

35、和蛋白質(zhì)反應(yīng)。對(duì)脂類的固定作用可以補(bǔ)充醛類固定劑對(duì)脂類固定不足的缺點(diǎn)；能增加膜的反差，起到電子染色作用，使被固定的樣品圖像有較好的反差。 四氧化鋨會(huì)破壞大部分細(xì)胞膜的半透膜特性，配制四氧化鋨固定液對(duì)緩沖液的要求不高 。四氧化鋨的缺點(diǎn)： 四氧化鋨滲透力弱，要求組織塊要小，否則組織內(nèi)部自溶過(guò)程繼續(xù)進(jìn)行，引起組織塊內(nèi)部固定不好。 不能保存糖原，也不能有效固定核酸，而且對(duì)微管固定效果也不理想。四氧化鋨能與乙醇或醛類起氧化-還原反應(yīng)，生成沉淀。所以，醛類處理過(guò)的樣品轉(zhuǎn)入四氧化鋨固定前或四氧化鋨固定后轉(zhuǎn)入乙醇溶液脫水前都必須用相應(yīng)的緩沖液充分漂洗干凈。四氧化鋨具有揮發(fā)性，對(duì)黏膜有毒性作用。（3）Epon8

36、12包埋劑：Epon812是目前國(guó)際上普遍采用的一種優(yōu)良包埋劑，一種長(zhǎng)鏈的脂肪族環(huán)氧化合物，黏度為150210cP（在25）。該包埋劑的配制方法很多，但一般都按1961年Luft提出的配方進(jìn)行。其配方如下：A液：Epon812 62 ml、DDSA（十二烷基琥珀酸酐） 100 ml；B液：Epon812 100 ml、MNA（甲基內(nèi)次甲基四氫鄰苯二甲酸酐）89 ml。改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊硬度，A液多則軟，B液多則硬。通常冬天時(shí)A : B=2 : 8；夏天時(shí)A : B=1 : 9，可視組織的硬度和氣候不同調(diào)節(jié)其比例。2. 組織處理過(guò)程 將活檢標(biāo)本切為0.51 mm3左右的小塊，放入

37、4C 的2%4%的戊二醛固定液，或者2%的多聚甲醛+2%或2.5%的戊二醛混合固定液中，4下固定24 h或更長(zhǎng)。4下用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液充分漂洗組織一晝夜，中間換液5-8次，最好每12 h換液1次。4下用臨時(shí)配制的1%鋨酸固定液再固定1.52 h。0.1 mmol/L的磷酸鹽組緩沖液充分漂洗組織10 min，再用丙酮或乙醇逐級(jí)（一般30%、50%、70%、90%）脫水，每級(jí)1015 min，但純丙酮或純乙醇中脫水2030 min共 2次。將脫水后的標(biāo)本移入包理劑（已預(yù)先配好）與純丙酮1：1的配制液中浸透30 min以上，再移入2 : 1的配制液中3 h，入純包理劑3 h 。預(yù)先

38、烤干的2號(hào)藥用膠囊（內(nèi)放標(biāo)本號(hào)）注入包埋劑八成滿，再放樣品于膠囊中央，待樣品沉到膠囊底部后移入烤箱，371224 h，4512 h，601224 h聚合。3. 修塊與定位 在進(jìn)行超薄切片前，首先必須對(duì)包埋塊進(jìn)行修整。修塊的目的便于連續(xù)切片。修整可以用雙面或單面刀片手工修整，將已聚合好的樹脂包埋塊放入專用的樣品夾中，在解剖顯微鏡下用單面刀片修去頂端和多余的包埋介質(zhì)，把要觀察的部分修成錐體，并將頂端的平面修成邊界明顯的平整梯形或方形。由于超微結(jié)構(gòu)觀察的部位很小，為了便于尋找要觀察的部位，超薄切片前要進(jìn)行定位。將修好的包埋塊置于超薄切片或修塊機(jī)上進(jìn)行半薄切片（0.52 mm）。半薄切片的觀察須借助染

39、色，染色前不必去除包埋劑，常用的染色方法有1%的甲苯胺藍(lán)染液、姬姆薩染液、或甲基藍(lán)-堿性復(fù)紅。甲苯胺藍(lán)染色的具體步驟如下：0.5-1mm半薄切片撈于載玻片上，0.5-1%的甲苯胺藍(lán)水溶液置于50-60C溫箱內(nèi)浸染5分鐘，蒸餾水稍洗，中性樹脂封片，鏡下觀察。根據(jù)定位結(jié)果，腎活檢主要觀察腎小球，進(jìn)一步修好包埋塊，保留12個(gè)腎小球，或所需觀察的腎小管間質(zhì)或其他部位，把其他部分削去后進(jìn)行超薄切片。在此需要強(qiáng)調(diào)，甲苯胺藍(lán)染色除用于半薄切片的定位，在Fabry病的診斷中具有重要意義，可見足細(xì)胞胞漿中甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性的顆粒狀物質(zhì)，少數(shù)見于腎小管上皮細(xì)胞、動(dòng)脈及管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中（圖3-10-12）。

40、圖3-10-12 甲苯胺藍(lán)染色，足細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)見陽(yáng)性顆粒（400）4. 超薄切片 在超薄切片機(jī)上用玻璃刀或鉆石刀進(jìn)行超薄切片，厚度為7090 nm。再用預(yù)先覆有支持膜或無(wú)支持膜的銅網(wǎng)、鎳網(wǎng)撈取超薄切片晾干，以備染色。5. 超薄切片染色 電鏡所用的光源是電子束，電鏡圖像的反差是樣品中不同物質(zhì)對(duì)電子束不同散射能力差異所形成的。散射的電子數(shù)越多，圖像越暗，反之，散射的電子數(shù)越少，圖像越亮。超薄切片染色是利用重金屬離子對(duì)不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)的結(jié)合能力不同，使細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)對(duì)電子束的散射能力不同，從而造成反差。目前常用的為鈾和鉛雙重染色，先染鈾再染鉛，具體染色方法有多種。傳統(tǒng)的醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法具體步驟如下：

41、在預(yù)先制作好的蠟板上滴加醋酸鈾染液，將撈有切片的銅網(wǎng)覆于染液上1530 min，期間加蓋，放于暗處。用雙蒸水沖洗、吸干。從醋酸鈾染液中取出銅網(wǎng)，用雙蒸水沖洗、吸干。在蠟板上放置少許氫氧化鈉固體，在其旁邊滴加檸檬酸鉛染液。注意避免檸檬酸鉛染液與氫氧化鈉固體接觸。把載有切片的銅網(wǎng)覆于染液上510 min。注意放置銅網(wǎng)時(shí)不要對(duì)著檸檬酸鉛染液呼氣，且盡快放置好銅網(wǎng)并加蓋。當(dāng)需要染色的銅網(wǎng)數(shù)量較多時(shí)，可以在一塊干凈的橡膠上切割數(shù)條短裂縫，把銅網(wǎng)逐個(gè)直立夾在裂縫中，并將橡膠放置于干凈的培養(yǎng)皿中，將醋酸鈾染液小心地滴在銅網(wǎng)貼有切片的一面，使其充分接觸，1530 min后，將橡膠取出。用雙蒸水沖洗，將銅網(wǎng)上的

42、水吸干。充分干燥后，將染色好的銅網(wǎng)放入透射電子顯微鏡中觀察（圖3-10-13）。五、免疫電鏡技術(shù) 免疫電鏡技術(shù)是免疫化學(xué)技術(shù)與電鏡技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是在超微結(jié)構(gòu)水平研究和觀察抗原、抗體結(jié)合定位的一種方法。主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術(shù)，即采用抗原抗體凝集反應(yīng)后，再經(jīng)負(fù)染色直接在電鏡下觀察；另一類則是免疫電鏡定位技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)是利用帶有特殊標(biāo)記的抗體與相應(yīng)抗原相結(jié)合，在電鏡下觀察，由于標(biāo)準(zhǔn)物形成一定的電子密度而提示出相應(yīng)抗原所在的部位。免疫電鏡的應(yīng)用，使得抗原和抗體定位的研究進(jìn)入亞細(xì)胞的水平。本章主要介紹后者。（一）取材和固定為了既能將抗原準(zhǔn)確定位甚至定量，又能觀察到近似于生理狀態(tài)下的細(xì)胞

43、超微結(jié)構(gòu)，必須選擇合適的固定劑，取組織塊時(shí)做到越快越好。常用的固定方式有以下兩種。灌注固定：效果最好，能夠很好保存超微結(jié)構(gòu)。但只適用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，不適宜人腎活檢標(biāo)本。 浸沒固定：將手術(shù)、腎活檢取材或灌注后切成的標(biāo)本塊浸沒在固定液中固定，組織塊浸沒固定時(shí)間常為25 h，游離細(xì)胞固定0.51 h。目前常用的固定劑有：4%多聚甲醛、1.5%2%戊二醛、1%多聚甲醛1%戊二醛、4%多聚甲醛0.5%苦味酸0.25%戊二醛、96%乙醇1%醋酸。不論采用何種固定劑，使用前必須用已知效價(jià)的抗原做一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)。確定固定劑的種類、濃度、溫度、pH值及固定時(shí)間等以達(dá)到最佳固定效果。（二）包埋劑的選擇免疫電鏡的包埋劑類

44、型包括環(huán)氧樹脂包埋劑和低溫包埋劑。根據(jù)免疫標(biāo)記的時(shí)間不同，應(yīng)選擇不同的包埋劑。ab圖3-10-13腎組織超薄切片鈾-鉛雙重染色a：腎小球基底膜內(nèi)皮下及系膜區(qū)大量團(tuán)塊高密度電子致密物分布；b：正常線粒體包埋前免疫標(biāo)記：對(duì)已固定的樣品先進(jìn)行免疫標(biāo)記，然后進(jìn)行包埋、超薄切片并觀察，一般選用環(huán)氧樹脂包埋劑。環(huán)氧樹脂具疏水性，在包埋前樣品必須先完全脫水，然后在溫箱中熱聚合。熱聚合會(huì)使大多數(shù)抗原變性，因此，該包埋劑不適用于包埋后免疫標(biāo)記。 包埋后免疫標(biāo)記：指組織標(biāo)本經(jīng)固定及樹脂包埋，制作成超薄切片后再進(jìn)行免疫化學(xué)標(biāo)記的方法，此方法多用低溫包埋劑，如Lowicryl系列包埋劑、LR White包埋劑和LRG

45、old包埋劑。這3種包埋劑均能在低溫下（35-80）用紫外光（波長(zhǎng)315360 nm）進(jìn)行聚合，避免高溫對(duì)抗原性的負(fù)面影響，提高了陽(yáng)性標(biāo)記率，而且對(duì)膠體金的非特異性吸附少，對(duì)溫度敏感的抗原應(yīng)選擇使用低溫包埋劑。（三）免疫標(biāo)記及染色根據(jù)免疫標(biāo)記與標(biāo)本包埋之間的不同關(guān)系，分為包埋前免疫標(biāo)記、包埋后免疫標(biāo)記和不用包埋的冷凍超薄切片免疫標(biāo)記。根據(jù)具體的標(biāo)本、抗原的部位及性質(zhì)并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的具體條件選擇適當(dāng)?shù)姆椒?。三者均包括非特異性位點(diǎn)的封閉、抗體與抗原特異性結(jié)合的免疫反應(yīng)、反應(yīng)部位的示蹤顯示等基本步驟。包埋前免疫標(biāo)記主要用于細(xì)胞膜表面抗原的免疫定位，以及用于某些易被脫水劑和樹脂成分溶解和變性的抗原檢測(cè)。

46、包埋后免疫標(biāo)記具有超微結(jié)構(gòu)保存較好、方法簡(jiǎn)便可靠、陽(yáng)性結(jié)果重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，并可對(duì)同一組織塊的連續(xù)切片做各種對(duì)照免疫標(biāo)記，能十分準(zhǔn)確地解釋免疫標(biāo)記結(jié)果，而且還能在同一張切片上進(jìn)行多重免疫標(biāo)記，尤其適合于顆粒性標(biāo)記物（膠體金標(biāo)記）的免疫化學(xué)定位標(biāo)記，是目前應(yīng)用最廣的免疫電鏡技術(shù)。但是該方法也有明顯的缺點(diǎn)，抗原在脫水、浸透及樹脂包埋過(guò)程中可能被破壞，且抗原被樹脂遮蓋，不易與抗體接觸，使免疫標(biāo)記的陽(yáng)性率下降。尤其是后固定劑鋨酸對(duì)抗原的破壞較嚴(yán)重，限制了在臨床應(yīng)用。包埋前和包埋后免疫電鏡的超薄切片同常規(guī)電鏡，但免疫電鏡用載網(wǎng)要選用鎳網(wǎng)或金網(wǎng)，而不用銅網(wǎng)，因銅網(wǎng)會(huì)與某些化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)，影響標(biāo)記結(jié)果。 冷

47、凍超薄切片免疫電鏡技術(shù)的特點(diǎn)是組織不經(jīng)脫水包埋直接冷凍，在冷凍狀態(tài)下進(jìn)行超薄切片，然后進(jìn)行免疫標(biāo)記。該項(xiàng)技術(shù)克服了上述兩種方法的缺點(diǎn)，能更理想地保存一些生物大分子的活性，極大地提高了免疫標(biāo)記的敏感性，隨著冷凍超薄切片技術(shù)的不斷改進(jìn)，該項(xiàng)技術(shù)更加完美，應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。但該項(xiàng)技術(shù)必須有特殊的冷凍超薄切片機(jī)，實(shí)際操作難度較高。標(biāo)記染色法分為直接染色法與間接染色法兩種。前者的特點(diǎn)是特異性較高，敏感性低，標(biāo)記抗體只能用于檢測(cè)一種抗原。后者敏感性較強(qiáng)，一種標(biāo)記抗體可用于多種抗原的檢測(cè)，缺點(diǎn)是特異性較差。標(biāo)記物采用膠體金標(biāo)記的抗體，可以自備或購(gòu)買膠體金標(biāo)記好的抗體，一般膠體金的直徑為5、10、15或20 nm（圖3-10-14），可根據(jù)實(shí)際需要選擇。下面介紹常用的包埋后免疫電鏡技術(shù)的間接免疫標(biāo)記和染色步驟。超薄切片室溫下1%H2O2蝕刻10 min左右；雙蒸水沖洗切片35次；用含1%小牛血清的PBS孵育15 min；PBS沖洗切片5次；用適當(dāng)稀釋的一抗室溫孵育12 h。一抗用含1%小牛血清的PBS稀釋；漂洗同步驟4；室溫下用適當(dāng)稀釋的膠體金探針?lè)跤?0 min；漂洗同步驟4；雙蒸水沖洗切片；常規(guī)醋酸鈾和硝酸鉛染色后在透射電鏡下觀察。為了證實(shí)免疫標(biāo)記結(jié)果的特異性，必須同時(shí)進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)： 用未經(jīng)免疫的同種動(dòng)物正