氣相色譜中的內(nèi)標法或外標法

1、談?wù)剝?nèi)標準品（內(nèi)標物質(zhì)）傳統(tǒng)上在教科書中都會很模糊的告訴學生內(nèi)標準的選擇方式,例如說要選安定性好;與分析物性質(zhì)要相近;在分析的基質(zhì)中不能出現(xiàn)等,現(xiàn)在我對這些個" 選擇方式"沒有太大的興趣,因為這個大家都知道,那現(xiàn)在就從另一個角度的來看看內(nèi)標準品的選擇還有哪些需要注意的. 1. 只選一個內(nèi)標準品?當然, 如果你的分析目標物就只有一個, 在正常的狀況下,內(nèi)標準"應(yīng)該"也只會有一個才對! 但是如果你的分析是多成份的,那就必須十分小心地看待在一個分析方法內(nèi)標準品的選擇, 如果分析物的在層析圖中是平均分布在各處, 那你就必須看看你的檢測方法中是否有規(guī)定內(nèi)標物與分析

2、物之間的滯留時間差范圍是多少,依此規(guī)定來選擇內(nèi)標,但是如果并沒有規(guī)定,最好也是選擇一個以上的內(nèi)標來使用,因為即使化學性質(zhì)不會差太多,但在沸點方面卻會有滿大的差異, 內(nèi)標與分析物的沸點差異過大,在GC的注射口中就無法把因為discrimibation（分辨）所造成的誤差校正回來.如果你的分析物是性質(zhì)相差頗大的 (例如說同時含有醇,酸.,那別懷疑一定是要使用一個以上的內(nèi)標準品,如果多個物種再加上多成份,那就很復(fù)雜了. 最低的限度也要依照分析物的沸點高低來使用多個不同的內(nèi)標準品. 在美國環(huán)保署的檢驗方法USEPA 8270C,是一個檢測半揮發(fā)性的污染物的規(guī)范,前后列了不下一百種的分析物,就使用了六個

3、不同的內(nèi)標準品作為校正的依據(jù),來照顧到各個不同沸點的分析物!濫用藥物分析大概是最嚴謹?shù)牧?即使是結(jié)構(gòu)性質(zhì)極相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析時為求準確,都是以各自的D同位素取代的標準品作為內(nèi)標.2.基質(zhì)中一定不能存在?這個問題當然是肯定的, 不然定量結(jié)果會很不穩(wěn)定或者是很凄慘. 但是有些時候你根本不知道哪些東西在分析樣品的基質(zhì)中不會存在! 這時候怎么辦? 找以往的文獻看看別人是用甚么,這是一個方法, 但要注意的是文獻不一定就是對的! 使用分析物的氫同位素(D取代物,是最妥當?shù)?但問題是價格昂貴,而且不是每一種分析物

4、的氫同位素(D取代物都有販售,當然,如果本錢夠,你可以去訂購專門替你合成氫同位素(D取代物. 如果要自己選, 那就必須了解一下分析物的成分了.以前曾經(jīng)替人定性和定量過一陣子海水魚中所含不飽和脂肪酸,這魚中不飽和脂肪酸的碳數(shù)都是奇數(shù)(或是偶數(shù), 我已經(jīng)忘了, 所以內(nèi)標就使用了幾個偶數(shù)(或奇數(shù)的不飽和脂肪酸, 像這種內(nèi)標物絕不可能出現(xiàn)在分析物中,且性質(zhì)十分相近,所以定量的結(jié)果一般誤差都不會太大! 如果完全無法確定怎辦? 有時候就是賭一賭啰.舉例來說:如果你的分析物結(jié)構(gòu)中含有氯的話,就可以尋找一個化合物,而這個化合物是把其中的氯換成氟或溴,例如你可以使用2-氟聯(lián)苯或2-溴聯(lián)苯來當作分析2-氯聯(lián)苯的內(nèi)

5、標準品. 以環(huán)境分析為例,通常在自然界中的氟及溴化物并不多, 在EPA的方法中,就經(jīng)常把結(jié)構(gòu)相似的氟及溴化物添加入樣品中,來做為分析含氯化合物的QC樣品.所以找氟及溴來取代氯原子的化合物來作為內(nèi)標,基本上還算是很安全的.如果實在連上述轉(zhuǎn)換一個基團的內(nèi)標都找不到,那至少在選擇時一定要找同一類的,分析酸就找酸當內(nèi)標,分析醇就找醇當內(nèi)標,直鏈接構(gòu)分析物就不要找一個環(huán)狀的化合物來當內(nèi)標,分子量不要相差太大,這算是最基本的要求!3.內(nèi)標和分析物的滯留時間必須接近?這個說法原則上沒錯,因為如果滯留時間接近,它們的物理或者是化學的性質(zhì)在某種程度上是接近的,所以有些分析方法會有這樣的規(guī)定. 但在某些特殊的狀況

6、下卻出了問題, 事實上還真的碰過, 結(jié)果在更換到第三個內(nèi)標準品后, 它的RT遠離分析物, 反而解決了定量誤差的問題! 這個案例以后有空在來聊聊. 4.內(nèi)標的濃度應(yīng)該是多少?除了某些分析方法會規(guī)定必須加入多少濃度的內(nèi)標外,其它的就只能靠分析員自己來決定了. 以我為例, 通常會先決定一個分析方法的檢量線范圍,然后開始配制不同濃度的內(nèi)標準品來注射入儀器中,分析完后選出一個大概是檢量線最高濃度的波峰高度三分之二左右的濃度,作為該項分析的內(nèi)標濃度. 這樣的選擇方式,可以兼顧到高低濃度的需要,一般來說,內(nèi)標濃度過高除了會增加成本之外,對于低濃度的校正是會產(chǎn)某些程度的誤差.在某些分析方法中會強制你使用內(nèi)標法

7、而不是外標法或線性回歸的方式來定量,但是如果你的基質(zhì)很復(fù)雜,一針打進儀器中,結(jié)果大大小小的出來一堆波峰, 這個時候如果你又不是使用質(zhì)譜作為偵測器的話,就必須考慮加大內(nèi)標準品的使用濃度, 來降低內(nèi)標準品的可能發(fā)生的積分誤差!5.內(nèi)標準怎么配制?一旦決定了添加內(nèi)標準品的濃度,就可以開始配制分析時所用的內(nèi)標準品標準溶液,相對于測試時的小量, 分析員必須先估計你在這一批的分析樣品有多少, 然后計算整個分析需要添加入多少的量,例如說妳需要大概100mL的內(nèi)標準品標準溶液,這時就必須再加多30%以上,一次就配好整個分析要用的量! 分裝或者是整瓶放到-20度的冰箱中存放,免得做到一半發(fā)覺內(nèi)標準品標準溶液用完

8、了,再重新配制一次,如果你是分析的新手, 搞不好前后兩次配得不一樣濃度,那就會很凄慘了.有些領(lǐng)域的分析,很重視這種內(nèi)標波峰的積分值是否是有一定的再現(xiàn)性!ABC讀本-用內(nèi)標還是外標法?轉(zhuǎn)自中國色譜網(wǎng)，作者：cation內(nèi)標與外標法的詳細計算及操作方式,在這里就不再敘述,不懂得網(wǎng)友就請自行去找找相關(guān)的文章.一個分析要選擇內(nèi)標或外標的方式來進行定量, 大概可以依照下述幾個方面來討論! 1. 適合的內(nèi)標準品? 以前當學生時,老師給大家記憶很深的一句話:”采樣員隨便采, 那你就隨便分析!”, 反正采得的樣品也不具代表性, 隨便分析也沒關(guān)系! 換到這里, 大概可以改成”如果分析方法的內(nèi)標準品用得不適當,

9、那你就隨便分析!”, 反正做了也不知道正不正確! 這種情形對于GC分析的特性而言, 是很可能發(fā)生的事. 對于一位以GC或GC/MS為定量儀器的分析員而言, 必須有下面的認識: a. 不適當?shù)膬?nèi)標準品, 即使你操作處理無誤, 有可能會把原本該得到的正確結(jié)果,校正成一個錯誤的結(jié)果. b. 不要迷信內(nèi)標準法的定量結(jié)果一定會優(yōu)于外標法或線性回歸法! 現(xiàn)在來看看一個我這邊發(fā)生的一個實際例子:案例是由于實驗室的某一項分析由于注射入GC時濃度的需要,在SPE凈化后需要不同的最終體積, 一是1 mL另一是10 mL, 所以在這兩組中基質(zhì)的干擾,前者是后者的十倍, 這個測試是使用空白的樣品在經(jīng)過SPE凈化后,調(diào)

10、整體積至所需的體積,再添加入同樣濃度的分析物標準品及內(nèi)標準品A, 在正常的狀況下,兩者分析后所得的樣品濃度應(yīng)該是一樣的! 體積為1 mL的樣品 體積為10 mL的樣品 標準品(無基質(zhì)干擾 內(nèi)標峰面積 54870.50 40705.10 42811.30 分析物面積 6224.90 6423.80 7164.38 計算后濃度 649.90 ug/g 865.08 ug/g 1000 ug/g 兩個樣品很明顯的都有受到基值得干擾, 1 mL體積的樣品所遭受的影響當然大于體積為10 mL的樣品, 但是A內(nèi)標準無法把這種干擾校正回來, 所以很明顯的, A對于這個分析方法,并不是一個適合的內(nèi)標準品! 同

11、樣的方法, 在使用B內(nèi)標準時會產(chǎn)生以下的數(shù)據(jù): 體積為1 mL的樣品 體積為10 mL的樣品 標準品(無基質(zhì)干擾 內(nèi)標峰面積 66423.40 67859.40 73846.70 分析物面積 6224.92 6243.80 7194.38 計算后濃度 894.09 ug/g 859.15 ug/g 1000 ug/g 兩個樣品的回收率都超過85%, 樣品之間的誤差也不大.所以最后修改SOP, 把A換成了B !一個分析要選擇內(nèi)標或外標的方式來進行定量, 大概可以依照下述幾個方面來討論.在前面我們討論了第一個條件"適合的內(nèi)標準品", 現(xiàn)在繼續(xù)下去!2. 要考慮分析物的組成平常的

12、分析物一般大都是單一物質(zhì)單一成分,也就是如農(nóng)藥中的Aldrine, 這東西當你在分析的時候,圖譜上就僅僅會出現(xiàn)單一的一個波峰, 某些東西會有結(jié)構(gòu)異構(gòu)物, 如BHC會有alpha, beta, gamma及sigma等四種形式的BHC. 另外DDT也是有一系列異構(gòu)物出現(xiàn), 前述的那些分析物,再對內(nèi)標物的選擇和定量上, 都不會有太大的問題, 但是, 如果是多成分分析物時, 不僅僅是內(nèi)標物的選擇, 甚至于選用外標或內(nèi)標法定量, 都必須特別的小心!多氯聯(lián)苯PCBs在環(huán)境或食品中都會有它的蹤跡, PCBs是個多成分的東西, 商業(yè)化的PCBs多以AC1242, AC1016, AC1232.等代號來命名,

13、 那些數(shù)字實際上是具有意義的, 每一種類的PCBs都是多成分的,也就是說如果你以DB-5或 DB-1的管柱來分離, 都會獲得數(shù)十支波峰, 至于多或少, 那就要看分析員的功力和儀器的設(shè)定了. 在這里我要講的重點是, 如果今天是以內(nèi)標法來分析PCBs, 所面臨的問題是分析物成分不止一個, 甚至于多到三十多個.如果你要選擇內(nèi)標準品,勢必要選擇避免會和分析物產(chǎn)生重迭但性質(zhì)又不能差太多的內(nèi)標準品, 在這個例子中, 并不見簡單的事, 在 USEPA 8082A的方法中對于Aroclor的分析采用外標法, 雖然外標法對于GC/ECD的檢測十分不利. 但在同分析法中對PCBs Congeners( PCBs同

14、源物,指的是單一成分PCB即采取內(nèi)標法定量, 內(nèi)標準是使用十氯聯(lián)苯或四氯間二甲苯.在某些方法中你可以看到PCBs Aroclor是以十氯聯(lián)苯或四氯間二甲苯來作為內(nèi)標準品定量, 之所以會使用這兩種東西作為內(nèi)標的原因是, 十氯聯(lián)苯是PCBs中分子量最大, 滯留時間當然也是最久, 不會干擾到到其它PCBs的分析 , 但在實際操作上會發(fā)現(xiàn)以十氯聯(lián)苯作為內(nèi)標準品, 對于分子量較大的AC1260或AC1254( AC1260及AC1254含氯數(shù)及分子量較接近十氯聯(lián)苯 會有較準確的結(jié)果, 但對于 AC1232或1242則較差. 所以AC1242或AC1232的定量以四氯間二甲苯較適宜, 但是四氯間二甲苯的滯

15、留時間不長( 在AC1232出管柱前面, 也因此不會干擾PCBs定量, 很容易受到基質(zhì)中低分子量雜質(zhì)的干擾, 這個干擾再沒有前處理凈化的狀態(tài)下更嚴重, 所以類似多成分的分析物在分析研發(fā)階段, 要采取內(nèi)標或外標, 采取內(nèi)標方法后要用甚么內(nèi)標準品, 都必須要多方考量才可以.多成分的東西其實并不少 , 例如農(nóng)藥中的Toxaphene和Chlordane等都是.內(nèi)標法與外標法一、內(nèi)標法 什么叫內(nèi)標法?怎樣選擇內(nèi)標物? 內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。 內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中

16、是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標法時，在樣品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標物應(yīng)當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(zhì)(如化學結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心

17、化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。 在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的比值? 影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。 由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)。 化學方面的因素包括： 1、內(nèi)標物在樣品里混合不好； 2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)， 3、內(nèi)標物純度可變等。 對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏對絕對

18、面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定， 在制作內(nèi)標標準曲線時應(yīng)注意什么? 在用內(nèi)標法做色話定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲

19、線即為標準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標準曲線時所用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等，還應(yīng)注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應(yīng)定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標法定量。 二、外標法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是

20、用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法定量。 外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量： WA(W(A 式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W及(A分別代表在對照品溶液進樣

21、體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。 外標法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性

22、。 三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法(來源：藥物分析網(wǎng)） 選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)。用內(nèi)標法公式計算即可。 內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。 選擇內(nèi)標物有4個要求：1.內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被測組分；4.色譜峰的位置應(yīng)

23、與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。 內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。 外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。 內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重

24、要的。氣相色譜中的內(nèi)標法與外標法1、 以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同

25、一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達不到一定的要求，而還必須

26、進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。 2、上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是

27、在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標了，如果內(nèi)標結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內(nèi)標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。 3、而對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應(yīng)用空間。 4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內(nèi)標優(yōu)于外標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標，RTX-5 amine（堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含

28、有內(nèi)標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過這一實例的結(jié)果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了，當然是內(nèi)標更好了。當然這個化合物的檢測方法最后根據(jù)上面的驗證數(shù)據(jù)用內(nèi)標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內(nèi)標與外標精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實。 結(jié)論：應(yīng)用外標法能夠滿足要求，首選還是外標法了，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、結(jié)果準確度會產(chǎn)生重大影響、實驗室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標法還是必要的。無論應(yīng)用那種方法，方法的驗證和確認都是很重要的

29、，只要是按照程序經(jīng)過驗證和確認的方法，都有其應(yīng)用的空間的。什么叫內(nèi)標法?怎樣選擇內(nèi)標物? 內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準確度。內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標法時，在樣品中加入一定量的標準物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應(yīng)值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標物應(yīng)當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣

30、品中去，它應(yīng)當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(zhì)(如化學結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個同系物。當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺物在一個復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。由化

31、學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時出現(xiàn)?；瘜W方面的因素包括：1、內(nèi)標物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標物純度可變等。對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置

32、和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定，在制作內(nèi)標標準曲線時應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標法做色譜定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標準曲線時所用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等，還應(yīng)注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應(yīng)定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于

33、2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標法定量。 外標法 用待測組分的純品作對照物質(zhì)，以對照物質(zhì)和樣品中待測組分的響應(yīng)信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質(zhì)配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法定量。外標一點法是用一種濃度的對照品

34、溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：WA(W(A式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W及(A分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復(fù)性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應(yīng)盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物

35、質(zhì)加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應(yīng)與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性。定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)。用內(nèi)標法公式計算即可。 內(nèi)標法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色

36、譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。 選擇內(nèi)標物有4個要求：1.內(nèi)標物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的量應(yīng)接近于被測組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。 內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結(jié)果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。 外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造

37、成分析誤差，得不到準確的測量結(jié)果。內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣

38、品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結(jié)果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。2、上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，