氣相色譜中的內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法

1、談?wù)剝?nèi)標(biāo)準(zhǔn)品（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)）傳統(tǒng)上在教科書中都會(huì)很模糊的告訴學(xué)生內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)的選擇方式,例如說要選安定性好;與分析物性質(zhì)要相近;在分析的基質(zhì)中不能出現(xiàn)等,現(xiàn)在我對(duì)這些個(gè)" 選擇方式"沒有太大的興趣,因?yàn)檫@個(gè)大家都知道,那現(xiàn)在就從另一個(gè)角度的來看看內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇還有哪些需要注意的. 1. 只選一個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品?當(dāng)然, 如果你的分析目標(biāo)物就只有一個(gè), 在正常的狀況下,內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)"應(yīng)該"也只會(huì)有一個(gè)才對(duì)! 但是如果你的分析是多成份的,那就必須十分小心地看待在一個(gè)分析方法內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇, 如果分析物的在層析圖中是平均分布在各處, 那你就必須看看你的檢測(cè)方法中是否有規(guī)定內(nèi)標(biāo)物與分析

2、物之間的滯留時(shí)間差范圍是多少,依此規(guī)定來選擇內(nèi)標(biāo),但是如果并沒有規(guī)定,最好也是選擇一個(gè)以上的內(nèi)標(biāo)來使用,因?yàn)榧词够瘜W(xué)性質(zhì)不會(huì)差太多,但在沸點(diǎn)方面卻會(huì)有滿大的差異, 內(nèi)標(biāo)與分析物的沸點(diǎn)差異過大,在GC的注射口中就無法把因?yàn)閐iscrimibation（分辨）所造成的誤差校正回來.如果你的分析物是性質(zhì)相差頗大的 (例如說同時(shí)含有醇,酸.,那別懷疑一定是要使用一個(gè)以上的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品,如果多個(gè)物種再加上多成份,那就很復(fù)雜了. 最低的限度也要依照分析物的沸點(diǎn)高低來使用多個(gè)不同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品. 在美國(guó)環(huán)保署的檢驗(yàn)方法USEPA 8270C,是一個(gè)檢測(cè)半揮發(fā)性的污染物的規(guī)范,前后列了不下一百種的分析物,就使用了六個(gè)

3、不同的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品作為校正的依據(jù),來照顧到各個(gè)不同沸點(diǎn)的分析物!濫用藥物分析大概是最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牧?即使是結(jié)構(gòu)性質(zhì)極相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析時(shí)為求準(zhǔn)確,都是以各自的D同位素取代的標(biāo)準(zhǔn)品作為內(nèi)標(biāo).2.基質(zhì)中一定不能存在?這個(gè)問題當(dāng)然是肯定的, 不然定量結(jié)果會(huì)很不穩(wěn)定或者是很凄慘. 但是有些時(shí)候你根本不知道哪些東西在分析樣品的基質(zhì)中不會(huì)存在! 這時(shí)候怎么辦? 找以往的文獻(xiàn)看看別人是用甚么,這是一個(gè)方法, 但要注意的是文獻(xiàn)不一定就是對(duì)的! 使用分析物的氫同位素(D取代物,是最妥當(dāng)?shù)?但問題是價(jià)格昂貴,而且不是每一種分析物

4、的氫同位素(D取代物都有販?zhǔn)?當(dāng)然,如果本錢夠,你可以去訂購(gòu)專門替你合成氫同位素(D取代物. 如果要自己選, 那就必須了解一下分析物的成分了.以前曾經(jīng)替人定性和定量過一陣子海水魚中所含不飽和脂肪酸,這魚中不飽和脂肪酸的碳數(shù)都是奇數(shù)(或是偶數(shù), 我已經(jīng)忘了, 所以內(nèi)標(biāo)就使用了幾個(gè)偶數(shù)(或奇數(shù)的不飽和脂肪酸, 像這種內(nèi)標(biāo)物絕不可能出現(xiàn)在分析物中,且性質(zhì)十分相近,所以定量的結(jié)果一般誤差都不會(huì)太大! 如果完全無法確定怎辦? 有時(shí)候就是賭一賭啰.舉例來說:如果你的分析物結(jié)構(gòu)中含有氯的話,就可以尋找一個(gè)化合物,而這個(gè)化合物是把其中的氯換成氟或溴,例如你可以使用2-氟聯(lián)苯或2-溴聯(lián)苯來當(dāng)作分析2-氯聯(lián)苯的內(nèi)

5、標(biāo)準(zhǔn)品. 以環(huán)境分析為例,通常在自然界中的氟及溴化物并不多, 在EPA的方法中,就經(jīng)常把結(jié)構(gòu)相似的氟及溴化物添加入樣品中,來做為分析含氯化合物的QC樣品.所以找氟及溴來取代氯原子的化合物來作為內(nèi)標(biāo),基本上還算是很安全的.如果實(shí)在連上述轉(zhuǎn)換一個(gè)基團(tuán)的內(nèi)標(biāo)都找不到,那至少在選擇時(shí)一定要找同一類的,分析酸就找酸當(dāng)內(nèi)標(biāo),分析醇就找醇當(dāng)內(nèi)標(biāo),直鏈接構(gòu)分析物就不要找一個(gè)環(huán)狀的化合物來當(dāng)內(nèi)標(biāo),分子量不要相差太大,這算是最基本的要求!3.內(nèi)標(biāo)和分析物的滯留時(shí)間必須接近?這個(gè)說法原則上沒錯(cuò),因?yàn)槿绻麥魰r(shí)間接近,它們的物理或者是化學(xué)的性質(zhì)在某種程度上是接近的,所以有些分析方法會(huì)有這樣的規(guī)定. 但在某些特殊的狀況

6、下卻出了問題, 事實(shí)上還真的碰過, 結(jié)果在更換到第三個(gè)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品后, 它的RT遠(yuǎn)離分析物, 反而解決了定量誤差的問題! 這個(gè)案例以后有空在來聊聊. 4.內(nèi)標(biāo)的濃度應(yīng)該是多少?除了某些分析方法會(huì)規(guī)定必須加入多少濃度的內(nèi)標(biāo)外,其它的就只能靠分析員自己來決定了. 以我為例, 通常會(huì)先決定一個(gè)分析方法的檢量線范圍,然后開始配制不同濃度的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品來注射入儀器中,分析完后選出一個(gè)大概是檢量線最高濃度的波峰高度三分之二左右的濃度,作為該項(xiàng)分析的內(nèi)標(biāo)濃度. 這樣的選擇方式,可以兼顧到高低濃度的需要,一般來說,內(nèi)標(biāo)濃度過高除了會(huì)增加成本之外,對(duì)于低濃度的校正是會(huì)產(chǎn)某些程度的誤差.在某些分析方法中會(huì)強(qiáng)制你使用內(nèi)標(biāo)法

7、而不是外標(biāo)法或線性回歸的方式來定量,但是如果你的基質(zhì)很復(fù)雜,一針打進(jìn)儀器中,結(jié)果大大小小的出來一堆波峰, 這個(gè)時(shí)候如果你又不是使用質(zhì)譜作為偵測(cè)器的話,就必須考慮加大內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的使用濃度, 來降低內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的可能發(fā)生的積分誤差!5.內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)怎么配制?一旦決定了添加內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度,就可以開始配制分析時(shí)所用的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液,相對(duì)于測(cè)試時(shí)的小量, 分析員必須先估計(jì)你在這一批的分析樣品有多少, 然后計(jì)算整個(gè)分析需要添加入多少的量,例如說妳需要大概100mL的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液,這時(shí)就必須再加多30%以上,一次就配好整個(gè)分析要用的量! 分裝或者是整瓶放到-20度的冰箱中存放,免得做到一半發(fā)覺內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)溶液用完

8、了,再重新配制一次,如果你是分析的新手, 搞不好前后兩次配得不一樣濃度,那就會(huì)很凄慘了.有些領(lǐng)域的分析,很重視這種內(nèi)標(biāo)波峰的積分值是否是有一定的再現(xiàn)性!ABC讀本-用內(nèi)標(biāo)還是外標(biāo)法?轉(zhuǎn)自中國(guó)色譜網(wǎng)，作者：cation內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)法的詳細(xì)計(jì)算及操作方式,在這里就不再敘述,不懂得網(wǎng)友就請(qǐng)自行去找找相關(guān)的文章.一個(gè)分析要選擇內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)的方式來進(jìn)行定量, 大概可以依照下述幾個(gè)方面來討論! 1. 適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品? 以前當(dāng)學(xué)生時(shí),老師給大家記憶很深的一句話:”采樣員隨便采, 那你就隨便分析!”, 反正采得的樣品也不具代表性, 隨便分析也沒關(guān)系! 換到這里, 大概可以改成”如果分析方法的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品用得不適當(dāng),

9、那你就隨便分析!”, 反正做了也不知道正不正確! 這種情形對(duì)于GC分析的特性而言, 是很可能發(fā)生的事. 對(duì)于一位以GC或GC/MS為定量?jī)x器的分析員而言, 必須有下面的認(rèn)識(shí): a. 不適當(dāng)?shù)膬?nèi)標(biāo)準(zhǔn)品, 即使你操作處理無誤, 有可能會(huì)把原本該得到的正確結(jié)果,校正成一個(gè)錯(cuò)誤的結(jié)果. b. 不要迷信內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法的定量結(jié)果一定會(huì)優(yōu)于外標(biāo)法或線性回歸法! 現(xiàn)在來看看一個(gè)我這邊發(fā)生的一個(gè)實(shí)際例子:案例是由于實(shí)驗(yàn)室的某一項(xiàng)分析由于注射入GC時(shí)濃度的需要,在SPE凈化后需要不同的最終體積, 一是1 mL另一是10 mL, 所以在這兩組中基質(zhì)的干擾,前者是后者的十倍, 這個(gè)測(cè)試是使用空白的樣品在經(jīng)過SPE凈化后,調(diào)

10、整體積至所需的體積,再添加入同樣濃度的分析物標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品A, 在正常的狀況下,兩者分析后所得的樣品濃度應(yīng)該是一樣的! 體積為1 mL的樣品 體積為10 mL的樣品 標(biāo)準(zhǔn)品(無基質(zhì)干擾 內(nèi)標(biāo)峰面積 54870.50 40705.10 42811.30 分析物面積 6224.90 6423.80 7164.38 計(jì)算后濃度 649.90 ug/g 865.08 ug/g 1000 ug/g 兩個(gè)樣品很明顯的都有受到基值得干擾, 1 mL體積的樣品所遭受的影響當(dāng)然大于體積為10 mL的樣品, 但是A內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)無法把這種干擾校正回來, 所以很明顯的, A對(duì)于這個(gè)分析方法,并不是一個(gè)適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品! 同

11、樣的方法, 在使用B內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)會(huì)產(chǎn)生以下的數(shù)據(jù): 體積為1 mL的樣品 體積為10 mL的樣品 標(biāo)準(zhǔn)品(無基質(zhì)干擾 內(nèi)標(biāo)峰面積 66423.40 67859.40 73846.70 分析物面積 6224.92 6243.80 7194.38 計(jì)算后濃度 894.09 ug/g 859.15 ug/g 1000 ug/g 兩個(gè)樣品的回收率都超過85%, 樣品之間的誤差也不大.所以最后修改SOP, 把A換成了B !一個(gè)分析要選擇內(nèi)標(biāo)或外標(biāo)的方式來進(jìn)行定量, 大概可以依照下述幾個(gè)方面來討論.在前面我們討論了第一個(gè)條件"適合的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品", 現(xiàn)在繼續(xù)下去!2. 要考慮分析物的組成平常的

12、分析物一般大都是單一物質(zhì)單一成分,也就是如農(nóng)藥中的Aldrine, 這東西當(dāng)你在分析的時(shí)候,圖譜上就僅僅會(huì)出現(xiàn)單一的一個(gè)波峰, 某些東西會(huì)有結(jié)構(gòu)異構(gòu)物, 如BHC會(huì)有alpha, beta, gamma及sigma等四種形式的BHC. 另外DDT也是有一系列異構(gòu)物出現(xiàn), 前述的那些分析物,再對(duì)內(nèi)標(biāo)物的選擇和定量上, 都不會(huì)有太大的問題, 但是, 如果是多成分分析物時(shí), 不僅僅是內(nèi)標(biāo)物的選擇, 甚至于選用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)法定量, 都必須特別的小心!多氯聯(lián)苯PCBs在環(huán)境或食品中都會(huì)有它的蹤跡, PCBs是個(gè)多成分的東西, 商業(yè)化的PCBs多以AC1242, AC1016, AC1232.等代號(hào)來命名,

13、 那些數(shù)字實(shí)際上是具有意義的, 每一種類的PCBs都是多成分的,也就是說如果你以DB-5或 DB-1的管柱來分離, 都會(huì)獲得數(shù)十支波峰, 至于多或少, 那就要看分析員的功力和儀器的設(shè)定了. 在這里我要講的重點(diǎn)是, 如果今天是以內(nèi)標(biāo)法來分析PCBs, 所面臨的問題是分析物成分不止一個(gè), 甚至于多到三十多個(gè).如果你要選擇內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品,勢(shì)必要選擇避免會(huì)和分析物產(chǎn)生重迭但性質(zhì)又不能差太多的內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品, 在這個(gè)例子中, 并不見簡(jiǎn)單的事, 在 USEPA 8082A的方法中對(duì)于Aroclor的分析采用外標(biāo)法, 雖然外標(biāo)法對(duì)于GC/ECD的檢測(cè)十分不利. 但在同分析法中對(duì)PCBs Congeners( PCBs同

14、源物,指的是單一成分PCB即采取內(nèi)標(biāo)法定量, 內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是使用十氯聯(lián)苯或四氯間二甲苯.在某些方法中你可以看到PCBs Aroclor是以十氯聯(lián)苯或四氯間二甲苯來作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品定量, 之所以會(huì)使用這兩種東西作為內(nèi)標(biāo)的原因是, 十氯聯(lián)苯是PCBs中分子量最大, 滯留時(shí)間當(dāng)然也是最久, 不會(huì)干擾到到其它PCBs的分析 , 但在實(shí)際操作上會(huì)發(fā)現(xiàn)以十氯聯(lián)苯作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品, 對(duì)于分子量較大的AC1260或AC1254( AC1260及AC1254含氯數(shù)及分子量較接近十氯聯(lián)苯 會(huì)有較準(zhǔn)確的結(jié)果, 但對(duì)于 AC1232或1242則較差. 所以AC1242或AC1232的定量以四氯間二甲苯較適宜, 但是四氯間二甲苯的滯

15、留時(shí)間不長(zhǎng)( 在AC1232出管柱前面, 也因此不會(huì)干擾PCBs定量, 很容易受到基質(zhì)中低分子量雜質(zhì)的干擾, 這個(gè)干擾再?zèng)]有前處理凈化的狀態(tài)下更嚴(yán)重, 所以類似多成分的分析物在分析研發(fā)階段, 要采取內(nèi)標(biāo)或外標(biāo), 采取內(nèi)標(biāo)方法后要用甚么內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品, 都必須要多方考量才可以.多成分的東西其實(shí)并不少 , 例如農(nóng)藥中的Toxaphene和Chlordane等都是.內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法一、內(nèi)標(biāo)法 什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物? 內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。 內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中

16、是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心

17、化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。 在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值? 影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。 由化學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)。 化學(xué)方面的因素包括： 1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好； 2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)， 3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。 對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏對(duì)絕對(duì)

18、面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定， 在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么? 在用內(nèi)標(biāo)法做色話定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲

19、線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。 二、外標(biāo)法 用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是

20、用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法定量。 外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量： WA(W(A 式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W及(A分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣

21、體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。 外標(biāo)法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性

22、。 三、定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法(來源：藥物分析網(wǎng)） 選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。 內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色譜峰面積之比，來計(jì)算被測(cè)組分的含量。 選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)

23、與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。 外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。 內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來滿足要求才是最重

24、要的。氣相色譜中的內(nèi)標(biāo)法與外標(biāo)法1、 以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同

25、一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須

26、進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來了。 2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，RSD都滿足1.5%的要求時(shí)，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結(jié)果小于1%，那這個(gè)方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結(jié)果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動(dòng)時(shí)，這個(gè)方法的可行性就將受到質(zhì)疑，畢竟這是方法驗(yàn)證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是

27、在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標(biāo)了，如果內(nèi)標(biāo)結(jié)果的RSD很好，就證明你的這個(gè)方法受實(shí)驗(yàn)條件的影響很大，只能用內(nèi)標(biāo)了，或者干脆將原方法做大的變動(dòng)，再嘗試用外標(biāo)法測(cè)試。 3、而對(duì)于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標(biāo)準(zhǔn)要求對(duì)于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時(shí)可以允許達(dá)到10%甚至更高，這時(shí)可能外標(biāo)法有更大的應(yīng)用空間。 4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個(gè)人認(rèn)為還是內(nèi)標(biāo)優(yōu)于外標(biāo)。曾經(jīng)做過一個(gè)中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標(biāo)，RTX-5 amine（堿改性） 15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含

28、有內(nèi)標(biāo)物）自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標(biāo)物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對(duì)這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結(jié)果為0.71%，通過這一實(shí)例的結(jié)果大家就會(huì)發(fā)現(xiàn)到底哪個(gè)方法精密度更好了，當(dāng)然是內(nèi)標(biāo)更好了。當(dāng)然這個(gè)化合物的檢測(cè)方法最后根據(jù)上面的驗(yàn)證數(shù)據(jù)用內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量都是可以的，實(shí)驗(yàn)室可以自由選擇。但內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)精密度結(jié)果的差異是顯然存在的事實(shí)。 結(jié)論：應(yīng)用外標(biāo)法能夠滿足要求，首選還是外標(biāo)法了，畢竟簡(jiǎn)單而省事。對(duì)于精密度要求比較高、結(jié)果準(zhǔn)確度會(huì)產(chǎn)生重大影響、實(shí)驗(yàn)室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標(biāo)法還是必要的。無論應(yīng)用那種方法，方法的驗(yàn)證和確認(rèn)都是很重要的

29、，只要是按照程序經(jīng)過驗(yàn)證和確認(rèn)的方法，都有其應(yīng)用的空間的。什么叫內(nèi)標(biāo)法?怎樣選擇內(nèi)標(biāo)物? 內(nèi)標(biāo)法是一種間接或相對(duì)的校準(zhǔn)方法。在分析測(cè)定樣品中某組分含量時(shí)，加入一種內(nèi)標(biāo)物質(zhì)以校誰和消除出于操作條件的波動(dòng)而對(duì)分析結(jié)果產(chǎn)生的影響，以提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。內(nèi)標(biāo)法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術(shù)。使用內(nèi)標(biāo)法時(shí)，在樣品中加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測(cè)定內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)組分的峰面積與相對(duì)響應(yīng)值，即可求出待測(cè)組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，內(nèi)標(biāo)物的選擇是一項(xiàng)十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標(biāo)物應(yīng)當(dāng)是一個(gè)能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準(zhǔn)確、已知的量加到樣

30、品中去，它應(yīng)當(dāng)和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學(xué)性質(zhì)(如化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等、色譜行為和響應(yīng)特征，最好是被分析物質(zhì)的一個(gè)同系物。當(dāng)然，在色譜分析條什下，內(nèi)標(biāo)物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關(guān)心化臺(tái)物在一個(gè)復(fù)雜過程中所得到的回收率，此時(shí)，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺(tái)物作內(nèi)標(biāo)，來測(cè)定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。在使用內(nèi)標(biāo)法定量時(shí)，有哪些因素會(huì)影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分的峰高或峰面積的比值?影響內(nèi)標(biāo)和被測(cè)組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學(xué)方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。由化

31、學(xué)方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復(fù)樣品時(shí)出現(xiàn)?；瘜W(xué)方面的因素包括：1、內(nèi)標(biāo)物在樣品里混合不好；2、內(nèi)標(biāo)物和樣品組分之間發(fā)生反應(yīng)，3、內(nèi)標(biāo)物純度可變等。對(duì)于一個(gè)比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏對(duì)絕對(duì)面積的影響比較大，對(duì)面積比的影響則要小一些，但如果絕對(duì)面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個(gè)重要的色譜問題存在，比如進(jìn)樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標(biāo)濃度之間有很大的差別，檢測(cè)器非線性等。進(jìn)樣量應(yīng)足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測(cè)器和積分裝置飽和。如果認(rèn)為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應(yīng)著重檢查積分裝置

32、和設(shè)置、斜率和峰寬定位。對(duì)積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對(duì)恒定，在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)應(yīng)注意什么?在用內(nèi)標(biāo)法做色譜定量分析時(shí)，先配制一定重量比的被測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)樣品的混合物做色譜分析，測(cè)量峰面積，做重量比和面積比的關(guān)系曲線，此曲線即為標(biāo)準(zhǔn)曲線。在實(shí)際樣品分析時(shí)所采用的色譜條件應(yīng)盡可能與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)所用的條件一致，因此，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等，還應(yīng)注明進(jìn)樣體積和內(nèi)標(biāo)物濃度。在制作內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，各點(diǎn)并不完全落在直線上，此時(shí)應(yīng)求出面積比和重量比的比值與其平均位的標(biāo)準(zhǔn)偏差，在使用過程中應(yīng)定期進(jìn)行單點(diǎn)校正，若所得值與平均值的偏差小于

33、2，曲線仍可使用，若大于2，則應(yīng)重作曲線，如果曲線在鉸短時(shí)期內(nèi)即產(chǎn)生變動(dòng)，則不宜使用內(nèi)標(biāo)法定量。 外標(biāo)法 用待測(cè)組分的純品作對(duì)照物質(zhì)，以對(duì)照物質(zhì)和樣品中待測(cè)組分的響應(yīng)信號(hào)相比較進(jìn)行定量的方法稱為外標(biāo)法。此法可分為工作曲線法及外標(biāo)一點(diǎn)法等。工作曲線法是用對(duì)照物質(zhì)配制一系列濃度的對(duì)照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準(zhǔn)確進(jìn)樣與對(duì)照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測(cè)組分的信號(hào)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其濃度，或用回歸方程計(jì)算，工作曲線法也可以用外標(biāo)二點(diǎn)法代替。通常截距應(yīng)為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時(shí)，可用外標(biāo)一點(diǎn)法(直接比較法定量。外標(biāo)一點(diǎn)法是用一種濃度的對(duì)照品

34、溶液對(duì)比測(cè)定樣品溶液中i組分的含量。將對(duì)照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進(jìn)樣，測(cè)得峰面積的平均值，用下式計(jì)算樣品中i組分的量：WA(W(A式中W與A分別代表在樣品溶液進(jìn)樣體積中所含i組分的重量及相應(yīng)的峰面積。(W及(A分別代表在對(duì)照品溶液進(jìn)樣體積中含純品i組分的重量及相應(yīng)峰面積。外標(biāo)法方法簡(jiǎn)便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對(duì)待測(cè)組分定量。但此法的準(zhǔn)確性受進(jìn)樣重復(fù)性和實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標(biāo)一點(diǎn)法的實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)盡量使配制的對(duì)照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。外標(biāo)法 external standard method 色譜分析中的一種定量方法，它不是把標(biāo)準(zhǔn)物

35、質(zhì)加入到被測(cè)樣品中，而是在與被測(cè)樣品相同的色譜條件下單獨(dú)測(cè)定，把得到的色譜峰面積與被測(cè)組分的色譜峰面積進(jìn)行比較求得被測(cè)組分的含量。外標(biāo)物與被測(cè)組分同為一種物質(zhì)但要求它有一定的純度，分析時(shí)外標(biāo)物的濃度應(yīng)與被測(cè)物濃度相接近，以利于定量分析的準(zhǔn)確性。定量分析中怎樣選擇內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法選一與欲測(cè)組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標(biāo)物（當(dāng)然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣得相對(duì)校正因子。再將內(nèi)標(biāo)物加入欲測(cè)組分的樣品中，進(jìn)樣后測(cè)得欲測(cè)組分和內(nèi)標(biāo)物的定量參數(shù)。用內(nèi)標(biāo)法公式計(jì)算即可。 內(nèi)標(biāo)法是將一定量的純物質(zhì)作內(nèi)標(biāo)物，加入到準(zhǔn)確稱量的試樣中，根據(jù)被測(cè)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比及其相應(yīng)的色

36、譜峰面積之比，來計(jì)算被測(cè)組分的含量。 選擇內(nèi)標(biāo)物有4個(gè)要求：1.內(nèi)標(biāo)物應(yīng)是該試樣中不存在的純物質(zhì)；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標(biāo)物的量應(yīng)接近于被測(cè)組分；4.色譜峰的位置應(yīng)與被測(cè)組分的色譜峰的位置相近，或在幾個(gè)被測(cè)組分色譜峰中間。 內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是測(cè)定的結(jié)果較為準(zhǔn)確，由于通過測(cè)量?jī)?nèi)標(biāo)物及被測(cè)組分的峰面積的相對(duì)值來進(jìn)行計(jì)算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標(biāo)法的缺點(diǎn)是操作程序較為麻煩，每次分析時(shí)內(nèi)標(biāo)物和試樣都要準(zhǔn)確稱量，有時(shí)尋找合適的內(nèi)標(biāo)物也有困難。 外標(biāo)法簡(jiǎn)便，但進(jìn)樣量要求十分準(zhǔn)確，要嚴(yán)格控制在與標(biāo)準(zhǔn)物相同的操作條件下進(jìn)行，否則造

37、成分析誤差，得不到準(zhǔn)確的測(cè)量結(jié)果。內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對(duì)著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡(jiǎn)單而有效進(jìn)行定量分析來滿足要求才是最重要的。1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動(dòng)進(jìn)樣器，用外標(biāo)法定量，確實(shí)重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結(jié)果經(jīng)常受到搞合成同事的質(zhì)疑。其實(shí)，仔細(xì)分析原因不一定就是外標(biāo)法不適合這種定量分析，首先我們的實(shí)驗(yàn)室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當(dāng)（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對(duì)稱（也就是樣

38、品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進(jìn)樣方式（如快速進(jìn)樣還是熱針進(jìn)樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗(yàn)證對(duì)于精密度的要求，同一樣品進(jìn)6針以上的RSD和配制6個(gè)樣品的定量結(jié)果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個(gè)方法用外標(biāo)法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談?wù)撨@個(gè)方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當(dāng)中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗(yàn)證過的方法，內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)都有（他們用的都是自動(dòng)進(jìn)樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當(dāng)一個(gè)方法能夠滿足測(cè)試要求的時(shí)候，無論內(nèi)標(biāo)外標(biāo)，都是可行的，當(dāng)然有一個(gè)分析成本和分析時(shí)間的問題，內(nèi)標(biāo)的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當(dāng)然要比外標(biāo)要高和麻煩一些了。而有些時(shí)候，可能受你實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有儀器和附屬設(shè)備的影響，達(dá)不到一定的要求，而還必須進(jìn)行定量分析，有時(shí)外標(biāo)的結(jié)果可能就要差一些，這時(shí)，你可能就要考慮用內(nèi)標(biāo)法了，可以排除手動(dòng)進(jìn)樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時(shí)內(nèi)標(biāo)可能就顯示出它的優(yōu)勢(shì)來了。2、上面已經(jīng)提到當(dāng)做方法驗(yàn)證的時(shí)候，當(dāng)同一樣品配制6個(gè)樣品溶液用所選用的外標(biāo)法進(jìn)行定量的時(shí)候，