草蓯蓉提取物對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白及學(xué)習(xí)

1、草蓯蓉提取物對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞巢蛋白及學(xué)習(xí)                                 作者：周麗莎 朱書(shū)秀 王小月【摘要】  目的探討草蓯蓉提取物對(duì)淀粉樣肽（-AP）所致阿爾茨海默病(AD)模型大鼠的腦內(nèi)巢蛋白（Nestin）表達(dá)的影響，并

2、對(duì)其保護(hù)作用提供理論依據(jù)。方法取健康的SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組和草蓯蓉提取物高、中、低劑量組。用A140微量注射至大鼠雙側(cè)Meynert基底核，建立AD模型，用草蓯蓉提取物進(jìn)行，于治療后用Morris水迷宮檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，用免疫組化染色法檢測(cè)Nestin陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)的表達(dá)。結(jié)果各治療組的逃避潛伏期較模型組明顯縮短，大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分比顯著升高，穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯增加（P<0.01）。草蓯蓉提取物高劑量組大鼠海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量在治療組中表達(dá)最強(qiáng)，與模型組相比，具有顯著性差異（P<0.01）。結(jié)論 草蓯

3、蓉提取物能增強(qiáng)AD模型大鼠海馬神經(jīng)干細(xì)胞Nestin的表達(dá)，提高AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。 【關(guān)鍵詞】  草蓯蓉 阿爾茨海默病模型 巢蛋白阿爾茨海默病（Alzheimer disease,AD）是發(fā)生在早老及老年期、不可逆轉(zhuǎn)的、漸進(jìn)性的、以精神行為異常為主的腦變性疾病。其特征性病理標(biāo)志為腦內(nèi)細(xì)胞外存在大量由淀粉樣蛋白（beta-awyloid protein,A）組成的老年斑，神經(jīng)元纏結(jié)（NFTs）及皮質(zhì)、海馬選擇性神經(jīng)元變性和缺失。其中海馬病變?cè)缬谄べ|(zhì)，在疾病早期海馬區(qū)神經(jīng)元便明顯減少1。研究認(rèn)為，神經(jīng)毒性物質(zhì)A在腦中廣泛沉積，在AD發(fā)病中起中心作用，能引發(fā)神經(jīng)

4、元退化和凋亡等諸多病理過(guò)程，最后引起癡呆2。草蓯蓉為列當(dāng)科寄生草本植物，具有很高的藥用價(jià)值，近年來(lái)報(bào)道，草蓯蓉具有抗炎、抗缺氧、抗疲勞、促進(jìn)記憶及增強(qiáng)免疫功能等效用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)雙側(cè)Meynert基底核微量注射凝聚態(tài)A140建立AD模型，觀察草蓯蓉提取物對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其腦內(nèi)巢蛋白（Nestin）表達(dá)。    1  材料    取SD大鼠60只，體重200250   g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。WDT-微電極推進(jìn)器腦立體定位儀（國(guó)營(yíng)西北光化學(xué)儀器廠）、Morris水電迷宮

5、（醫(yī)學(xué)院藥物研究所）。A140，Nestin一抗（美國(guó)Biosource公司），DAB、即用型SABC染色試劑盒（武漢博士德），16草蓯蓉提取物（江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供）。A孵育：A140加入0.1三氟乙酸后放入38水浴恒溫箱孵育48 h，使其成為凝聚狀態(tài)備用。    2  方法    2.1  分組與處理對(duì)照組為正常組及假手術(shù)組：正常組，不進(jìn)行任何處理及治療，每組10只；假手術(shù)組注射等量生理鹽水，手術(shù)方法見(jiàn)“2.2”項(xiàng)下方法，每組10只。將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為模型組，中藥組。模型組，10只，造模成功后，不進(jìn)行任何治

6、療。中藥組，30只，低劑量組給予每只大鼠中藥草蓯蓉的提取物1  ml(折合生藥0.03 g/ml)灌胃，中劑量組給予每只大鼠中藥草蓯蓉的提取物2 ml灌胃，高劑量組給予每只大鼠中藥草蓯蓉的提取物4 ml灌胃，每組10只，連續(xù)28 d。    2.2  動(dòng)物模型的制作大鼠在10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀。腦立體定位儀固定平顱頭位切開(kāi)皮膚及皮下組織，用棉簽蘸取少量雙氧水輕拭顱骨表面，清除泡沫能清晰顯現(xiàn)前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜，以前囟為原點(diǎn)，向后1.4 mm，旁開(kāi)3.0 mm為穿刺點(diǎn)轉(zhuǎn)穿顱，自腦表面進(jìn)針7.0

7、mm分別至雙側(cè)Meynert基底核，用微量注射器將聚集狀態(tài)的A140各1    l（5 g）在2 min內(nèi)緩慢注入，留針10 min，以使A140充分浸潤(rùn)局部組織，注射完畢后將微量注射器在7 min內(nèi)緩慢抽出。假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。所有操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行，術(shù)后每只大鼠腹腔注射青霉素1萬(wàn)單位，縫合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。    2.3  學(xué)習(xí)記憶觀察治療后進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，首先進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，歷時(shí)3 d，將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。如果大鼠在12

8、0 s內(nèi)未找到平臺(tái)，需將其引至平臺(tái)。這時(shí)潛伏期為120 s。然后于第4天撤除平臺(tái)進(jìn)行空間探索試驗(yàn)，任選1個(gè)入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，考察大鼠對(duì)原平臺(tái)的記憶，記錄其穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)及在原平臺(tái)象限的游泳時(shí)間和距離。訓(xùn)練期間水溫（26±1）。數(shù)據(jù)采集和處理由Morris水迷宮圖象自動(dòng)監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。將各組的成績(jī)進(jìn)行比較。    2.4  標(biāo)本采集最后1次Morris水迷宮測(cè)試24 h后灌注取海馬。大鼠用10%水合氯醛380 mg/kg腹腔注射，麻醉后立即開(kāi)胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動(dòng)脈，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為

9、4多聚甲醛，灌注時(shí)間約30 min，見(jiàn)大鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意；灌注完畢后斷頭取腦，參照大鼠腦立體定位圖譜分離海馬，投入4多聚甲醛溶液中過(guò)夜，石蠟包埋。    2.5  Nestin檢測(cè)取大鼠海馬區(qū)石蠟標(biāo)本，以4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗2 min×3次。再加蒸餾水新鮮配置0.5H2O2，室溫30 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶。雙氧水洗2 min×3次。滴加正常山羊血清，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。滴加一抗Nestin（1800），以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，37下孵育1 h，PBS洗2 min×3次。

10、滴加生物素化二抗IgG（山羊抗兔）3730 min。PBS洗2 min×3次。滴加SABC，203720 min。PBS洗5 min×4次。DAB顯色。蒸餾水反復(fù)洗滌。脫水，透明，封片。標(biāo)本于顯微鏡下觀察照相并計(jì)數(shù)。    2.6  圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Nikon&Spot圖像采集分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，在400倍高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)視野觀察。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析(ANOVA)及q檢驗(yàn)。1   &#

11、160;         3  結(jié)果    3.1  各組水迷宮測(cè)驗(yàn)成績(jī)的比較 見(jiàn)表1。    與正常組及假手術(shù)組相比，模型組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，撤離平臺(tái)后大鼠在原平臺(tái)象限內(nèi)游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分比顯著降低，穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯減少，差異具有顯著性；各組與模型組相比，逃避潛伏期明顯縮短，大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分比顯著升高，穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯增加，具有顯著性差異。表1  各組水迷宮測(cè)驗(yàn)

12、成績(jī)的比較與模型組比較，*P<0.01；與正常組、假手術(shù)組比較，P<0.01；與低劑量組比較，P<0.05；與中劑量組比較，#P<0.01；n60      3.2  各組大鼠海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較  見(jiàn)表2及圖16。在正常組及假手術(shù)海馬區(qū)，僅見(jiàn)零星分布的Nestin陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞呈卵圓形、三角形或梭形，胞漿呈棕黃色，胞核為藍(lán)色。在模型組，該區(qū)域可見(jiàn)到Nestin陽(yáng)性細(xì)胞增多，與正常組及假手術(shù)組相比具有差異。低劑量組和中劑量組也有不同程度的增加，高劑量組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞

13、數(shù)目最多，細(xì)胞密集，胞體肥大，伸出長(zhǎng)短不一、粗細(xì)各異的突起。表2  各組大鼠海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)量比較從以上各組大鼠海馬區(qū)Nestin免疫組化染色圖可見(jiàn)，模型組（圖3）明顯高于正常組（圖1）、假手術(shù)組（圖2），各治療組明顯高于模型組，高劑量組（圖6）作用最強(qiáng)，中劑量組（圖5）次之，低劑量組（圖4）較弱。    4  討論    4.1  藥物作用   中醫(yī)認(rèn)為AD屬于中醫(yī)的“癡呆”或智能減退的范疇。中老年人由于肝腎不足，精氣虛損，痰濁瘀血內(nèi)生，以致風(fēng)火痰瘀相互為患，痰瘀膠著不

14、化，則氣血精津難以上養(yǎng)于腦髓，發(fā)為癡呆。草蓯蓉Boschniakia rossica Fedtsch.et. Flerov為列當(dāng)科草本植物，俗稱不老草，出自吉林中草藥，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)白山區(qū)，系長(zhǎng)白山珍奇植物之一，其地上部分據(jù)藥物成分分析含草蓯蓉醛和草蓯蓉內(nèi)酯等，根莖富含甘露醇和生物堿等?？扇萑胨帲陡氏?、性溫，具有滋補(bǔ)強(qiáng)身、益壽延年之功及補(bǔ)腎壯陽(yáng)、潤(rùn)腸止血之效。    實(shí)驗(yàn)研究表明，草蓯蓉能使亞急性衰老大鼠腦組織的超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)，抑制丙二醛活性并使之含量降低,且抑制單胺氧化酶活性3；草蓯蓉還能使D-半乳糖所致大鼠衰老模型腦內(nèi)的琥珀酸脫氫酶（SDH）活性

15、增強(qiáng),抑制乳酸脫氫酶（LDH）活性，說(shuō)明草蓯蓉能夠改善細(xì)胞的能量代謝，使細(xì)胞處于功能活躍狀態(tài)，且草蓯蓉使神經(jīng)元內(nèi)的脂褐素(LPF)含量明顯減少，由此說(shuō)明草蓯蓉對(duì)衰老大鼠腦組織有明顯保護(hù)作用4。線粒體是細(xì)胞生物氧化的主要結(jié)構(gòu)，當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)外因素干擾時(shí)，線粒體反應(yīng)最早，變化也最明顯。國(guó)外有人認(rèn)為線粒體的改變與衰老關(guān)系密切5，有研究從腦形態(tài)學(xué)角度證實(shí)了草蓯蓉能使衰老大鼠錐體細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹程度減輕，保持核膜較規(guī)則6。因此，草蓯蓉作為一種抗衰老的藥物，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。    4.2  機(jī)理探討   認(rèn)知障礙及學(xué)習(xí)記憶下降是癡呆的臨床特點(diǎn)之

16、一。膽堿能纖維系統(tǒng)潰變則是癡呆的最重要的經(jīng)典病理改變。癡呆患者的學(xué)習(xí)記憶障礙與腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)密切相關(guān)，并且學(xué)習(xí)記憶障礙的程度與膽堿能纖維系統(tǒng)潰變的程度成正比，而基底前腦及海馬是最重要的區(qū)域7。Morris水迷宮是檢測(cè)動(dòng)物記憶水平的重要工具。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，各治療組的逃避潛伏期較模型組明顯縮短，大鼠在原平臺(tái)象限游泳時(shí)間占整個(gè)游泳時(shí)間的百分比顯著升高，穿過(guò)原平臺(tái)所在位置的次數(shù)明顯增加，提示草蓯蓉能提高AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。    許多原因所致的腦損傷早期即可誘導(dǎo)Nestin的表達(dá)，在損傷最重區(qū)域Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目最顯著，故Nestin可作為CNS損傷時(shí)最

17、早、快速應(yīng)答的敏感標(biāo)志物；同時(shí)，Nestin是近年新發(fā)現(xiàn)的第類中間絲蛋白，被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記物8，神經(jīng)干細(xì)胞具有多分化潛能，可以分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，并能自我更新，與神經(jīng)再生密切相關(guān)。當(dāng)發(fā)生腦缺血或其他腦損傷時(shí)，可誘導(dǎo)Nestin增殖、定向遷移及分化，對(duì)受損的腦組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行修復(fù)和重塑9。Nestin的高表達(dá)可能預(yù)示了神經(jīng)干細(xì)胞的激活，從而在腦損傷的修復(fù)中發(fā)揮重要作用。有人認(rèn)為，Nestin的表達(dá)可能增加細(xì)胞的抗損傷能力，為判斷CNS神經(jīng)可塑性和損傷修復(fù)能力提供依據(jù)10。因此，在臨床對(duì)于腦損傷的治療中，有研究推測(cè)，凡能誘導(dǎo)巢蛋白表達(dá)增加的因素均可促進(jìn)腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)。實(shí)驗(yàn)顯示

18、，草蓯蓉提取物各治療組的Nestin的陽(yáng)性表達(dá)總體上存在差異有顯著性意義，說(shuō)明草蓯蓉可明顯增強(qiáng)大鼠海馬Nestin的免疫活性表達(dá)，誘導(dǎo)AD大鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞增殖，參與了AD大鼠神經(jīng)缺損的修復(fù)，并且改善了AD大鼠的認(rèn)知能力，從而為中藥草蓯蓉臨床防治AD提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【】  1 徐慶中，盧德宏，董 彬，等. Alzheimer's型老年性癡呆的神經(jīng)病A盛樹(shù)力.老年性癡呆,從分子生物學(xué)到臨床診治，第2版M.北京：技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1998：79.2 Zhu H,Fu W.The catalytic subunit of telomerase protects neurons against amyloid bete peptide incduced apoptosisJ.neurochem，2000，75(1):117.3 樸 龍，蔡英蘭，金香子，等.草蓯蓉提取物對(duì)亞急性衰老大鼠的抗衰老作用J.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(1):18.4 樸 龍，張學(xué)武，金 政，等.草蓯蓉提取物對(duì)D-半乳糖致衰老大鼠腦組織保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中醫(yī)藥科技，2003，10(5)：294.5 Brusque AM,Borba R,Schuck PF,et al.Inhibition of themitochondrial respiratory