軟骨組織工程種子細胞源的研究進展

1、軟骨組織工程種子細胞源的研究進展                      作者：王翠芳，馮萬文，武天佑 ，孫正義【關(guān)鍵詞】  軟骨組織工程種子細胞源多種原因造成的關(guān)節(jié)軟骨病變比較常見，軟骨損傷后缺乏自愈能力，軟骨缺損的修復(fù)一直是臨床的難題。隨著細胞生物學(xué)和材料科學(xué)的迅速發(fā)展，應(yīng)用組織工程學(xué)技術(shù)修復(fù)軟骨病損已成為可能，而優(yōu)化種子細胞源是應(yīng)用這一技術(shù)的前提和關(guān)鍵1。本文就有關(guān)軟骨

2、組織工程種子細胞源的優(yōu)化獲取、存在的問題及其解決等研究進展作一綜述。    1  軟骨組織工程對種子細胞源的要求    組織工程軟骨的種子細胞應(yīng)符合下列要求：來源豐富，取材方便；有較強的增殖傳代能力；與載體材料接種后能保持增殖能力和較高的黏附率，植入受區(qū)后能保持修復(fù)組織的表型；對機體或供區(qū)損傷小，臨床應(yīng)用的生物安全性和無明顯的免疫排斥和其他潛在危險2。    2  軟骨組織工程的種子細胞源2.1  自體軟骨細胞    理論上講自體軟骨細胞是軟骨組

3、織工程最理想的種子細胞源，不僅功能相同，不存在免疫排斥反應(yīng)，而且不需要誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。但研究表明種子細胞濃度為(56)×107/ml時，形成的新生軟骨形態(tài)最佳，但是自體軟骨組織取材受限，軟骨細胞增殖能力低，難以達到應(yīng)有的細胞數(shù)量，體外培養(yǎng)擴增容易發(fā)生去分化而失去原有的表型3，因此直接源于自體軟骨組織的種子細胞，體外單層培養(yǎng)難以獲取大量的細胞以滿足組織工程對種子細胞的需求。    為解決上述難題，使用生物反應(yīng)器三維培養(yǎng)可使軟骨細胞快速擴增，建立能夠長期培養(yǎng)、表型穩(wěn)定的永生化軟骨細胞。生物反應(yīng)器能控制pH、機械能力、營養(yǎng)供給條件等，為細胞的生長、分化提供最適宜

4、的環(huán)境。根據(jù)自體軟骨細胞培養(yǎng)所需的條件，仿生性地設(shè)計接近體內(nèi)環(huán)境的軟骨生物反應(yīng)器，模擬了體內(nèi)的細胞外基質(zhì)微環(huán)境。相同容積的生物反應(yīng)器比普通培養(yǎng)方式，多出數(shù)10倍甚至上100倍的細胞。可減少細胞去分化現(xiàn)象，有利于細胞表型的維持，提高種子細胞的質(zhì)量。有利于軟骨細胞的培養(yǎng)、擴增及表型維持。2.2  同種異體軟骨細胞    與體內(nèi)其他組織相比，軟骨有其獨特的結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特點。軟骨無血管、淋巴管和神經(jīng)，細胞包埋在由軟骨基質(zhì)形成的軟骨囊內(nèi)，可阻擋免疫細胞直接與其接觸，不易被機體免疫系統(tǒng)攻擊，軟骨基質(zhì)抗原性低，一般不引起或僅有輕微的免疫反應(yīng)，獲取種子細胞時要經(jīng)過消化分

5、離和體外培養(yǎng)等一系列處理，軟骨細胞表面抗原可被進一步消弱。同種異體軟骨來源廣，易獲取，一次可獲取大量軟骨細胞，所以同種異體軟骨是值得研究的種子細胞來源。應(yīng)用同種異體軟骨細胞作種子細胞，在具有免疫力動物體內(nèi)形成同種異體工程化軟骨，并用于軟骨缺損修復(fù)的實驗報道，未發(fā)現(xiàn)明顯的免疫排斥反應(yīng)6。研究表明胚胎來源的軟骨細胞較成體軟骨細胞引起的異體排斥反應(yīng)微弱，提示在同種異體軟骨組織工程中，胚胎來源的軟骨細胞作為種子細胞是最佳選擇。對同種異體軟骨細胞生物學(xué)特性和相關(guān)免疫反應(yīng)問題的進一步研究，將為建立軟骨組織工程種子細胞庫奠定基礎(chǔ)。2.3  骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow?derived

6、mesenchymal stem cells，BMSCs)    骨髓中存在具有向多種細胞系分化潛能的BMSCs。Friedenstein發(fā)現(xiàn)骨髓中存在少量可以貼壁繁殖的BMSCs，條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)可分化成為軟骨細胞。Cancedda等8對BMSCs和骨膜細胞修復(fù)兔股骨髁軟骨全層缺損進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者均能形成軟骨和軟骨下骨。    Butnariu?Ephrat等9用BMSCs復(fù)合聚合物支架，自體和異體移植修復(fù)股骨負重區(qū)軟骨缺損，結(jié)果自體BMSCs早期形成類透明軟骨，異體BMSCs的免疫反應(yīng)導(dǎo)致后期纖維化和骨關(guān)節(jié)炎改變。Gao等10分

7、別用成骨和成軟骨條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠BMSCs，復(fù)合不同材料的雙層支架植入裸鼠背部皮下，術(shù)后1周檢測新生組織中含有、型膠原，認為BMSCs在不同生物活性因子的作用下，結(jié)合相應(yīng)的生物材料可以構(gòu)建出工程化的骨軟骨復(fù)合體，因此，目前認為BMSCs是一種比較理想的種子細胞源。盡管BMSCs只有較強的增殖能力和多向分化潛能性，但其數(shù)量在全骨髓中僅占1101/10，并且隨傳代次數(shù)的增加，其軟骨分化潛能逐漸降低，必須通過適當(dāng)?shù)目刂茥l件和誘導(dǎo)因素，使BMSCs保持增殖并分化為軟骨細胞，也有研究表明重癥骨關(guān)節(jié)炎病人BMSCs的成軟骨能力明顯降低11，并且最近研究證實當(dāng)BMSCs培養(yǎng)傳代90次后細胞發(fā)生癌變，聲

8、稱這符合腫瘤細胞源于干細胞的假說，因此對BMSCs應(yīng)用的生物安全性必須引起高度重視和深入研究12。2.4  BMSCs與軟骨細胞共培養(yǎng)    基于BMSCs和軟骨細胞均不能完全滿足組織工程對種子細胞的要求，那么將2種細胞優(yōu)勢互補，進行共培養(yǎng)來優(yōu)化和擴大軟骨組織工程的種子細胞源就成為可供選擇的方式。Tsuchiya等13用不同比例的人BMSCs和牛軟骨細胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，BMSCs數(shù)量比例愈高軟骨細胞表達的型膠原和糖胺多糖愈高，并且能保持共培養(yǎng)前的細胞比例，因此BMSCs能促進軟骨細胞的增殖和基質(zhì)形成，其原因是共培養(yǎng)系統(tǒng)中BMSCs分泌的活性生長因子(TGF)

9、，通過軟骨細胞介導(dǎo)自分泌或旁分泌上調(diào)了軟骨細胞基質(zhì)的合成。Goldberg等14用添加TGF 的培養(yǎng)基培養(yǎng)去分化的軟骨細胞，結(jié)果表明添加TGF能使去分化的軟骨細胞重新分化，從而維持了軟骨細胞的表型。在構(gòu)建工程化軟骨組織中，利用BMSCs增殖能力強的特點，少量軟骨細胞的微環(huán)境能誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細胞，比單純軟骨細胞構(gòu)建的軟骨組織更為成熟，也避免了軟骨細胞長期培養(yǎng)傳代而導(dǎo)致的老化和去分化，并且節(jié)省了軟骨細胞的用量。因此BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)對優(yōu)化和擴大種子細胞源可能是一種實用的策略。2.5  軟骨膜細胞或骨膜細胞     

10、60;  骨膜和軟骨膜生發(fā)層含未分化的間充質(zhì)細胞，在低氧張力、無血供的關(guān)節(jié)腔內(nèi)分化為軟骨細胞、關(guān)節(jié)滑液和使用CPM是促使間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化的有利因素。Wakitani等15培養(yǎng)兔脛骨膜細胞，修復(fù)兔股骨髁全層軟骨缺損，24周時軟骨下骨完全形成，新生軟骨組織無骨化現(xiàn)象。Chu等16用異體肋軟骨膜細胞和PLA支架修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損，96的缺損6周時為軟骨填充，型膠原比例隨時間延長而升高，說明關(guān)節(jié)內(nèi)環(huán)境刺激新生組織向透明軟骨方向發(fā)展，黏多糖含量12個月時降低，軟骨下骨厚度為正常的50，認為異體移植的免疫反應(yīng)和PLA降解產(chǎn)物的酸性環(huán)境影響了軟骨下骨結(jié)構(gòu)的形成，導(dǎo)致新生軟骨生物力學(xué)性能下

11、降和纖維化。2.6  肌肉源性基質(zhì)干細胞(muscle?derived stromal cells)    Pate等17使用凍融方法和地塞米松誘導(dǎo)培養(yǎng)兔肌源性基質(zhì)干細胞，形成了軟骨結(jié)節(jié)和含有硫酸黏多糖的細胞外基質(zhì)。青年和老年人的肌細胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)出現(xiàn)同樣的結(jié)果18。Adachi等19用關(guān)節(jié)軟骨細胞或肌源性干細胞復(fù)合II型膠原凝膠修復(fù)兔股骨髁軟骨缺損區(qū)，24周后可見缺損區(qū)呈軟骨樣修復(fù)，優(yōu)于不含細胞的I型膠原凝膠對照組，認為肌源性干細胞取材方便，細胞倍增時間短，可以作為修復(fù)軟骨損傷的種子細胞源和基因治療的靶細胞。2.7  脂肪源性基質(zhì)干細胞(adi

12、pose tissue?derived stromal cells，ADSC)    為提供更多間充質(zhì)細胞的自體組織，Erickson等20用型膠原酶消化人吸脂術(shù)中的皮下脂肪，經(jīng)梯度密度離心獲取基質(zhì)干細胞，使用普通和軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(含TGF?撥?1和地塞米松)三維培養(yǎng)2周后植入裸鼠背部皮下412周取材，免疫組織化學(xué)和RT?PCR檢測表明：軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液體外培養(yǎng)1周和植入裸鼠體內(nèi)的標(biāo)本均有明確的成軟骨特征，而使用普通培養(yǎng)液的對照組則陰性，類似結(jié)果亦見于大鼠脂肪來源的干細胞21。源于脂肪組織的基質(zhì)干細胞，因脂肪組織在體內(nèi)廣泛存在，取材方便，對人體造成的創(chuàng)傷相對較小，是

13、目前獲取種子細胞的新途徑，也是研究的熱點，其細胞表型與BMSCs非常相似，均表達CD29、CD44、CD90、CD105，且缺少HLA?DR及C?kit表型，同時其增殖能力優(yōu)于BMSCs22。然而Hui等23在修復(fù)軟骨缺損的研究發(fā)現(xiàn)，在相同的實驗條件下其修復(fù)效果不如BMSCs。由于該細胞為誘導(dǎo)性干細胞，體外培養(yǎng)時必須在持續(xù)誘導(dǎo)條件下才能分化為軟骨細胞，培養(yǎng)難度相對較大并且其成軟骨機制尚不完全清楚。如能掌握脂肪組織基質(zhì)干細胞的成軟骨機制和性能，在體外培養(yǎng)持續(xù)向軟骨細胞分化，則不失為一種優(yōu)秀的種子細胞源24。2.8  胚胎干細胞(embryonic stem cell，ESC) 

14、;   胚胎干細胞來自早期胚胎的內(nèi)細胞團或尿生殖嵴，胚胎干細胞是全能干細胞，可分化為3個胚層的細胞，種植于體內(nèi)可形成包含三胚層細胞的畸胎瘤。改變體外培養(yǎng)條件，可使胚胎干細胞向不同的細胞系分化，文獻報道胚胎干細胞在BMP?2和BMP?4的作用下可分化為軟骨細胞25，胚胎干細胞與已分化的成熟軟骨細胞相比，除具有更強的增殖能力外，還具有再生潛能，可維持整個生命過程中細胞的更新和正常的功能，因而胚胎干細胞作為種子細胞可能更為優(yōu)勢。但使用胚胎干細胞作為組織工程的種子細胞，體外培養(yǎng)要求嚴(yán)格，自發(fā)分化難以控制，分化多具致瘤性，安全性難于把握，臨床使用尚存在倫理學(xué)問題。 

15、0;  3  基因修飾的種子細胞    多種細胞因子有促進軟骨修復(fù)的作用。通過基因重組技術(shù)，將細胞因子基因?qū)胲浌羌毎蛳嚓P(guān)細胞，使之在病損部位分泌生長因子并維持所需的濃度和時間，有效促進軟骨的修復(fù)，這就是基因修飾的組織工程技術(shù)(gene modified technology)。如TGF、IGF、EGF、GF等均可刺激軟骨細胞增殖和型膠原與蛋白多糖的合成。綠色熒光蛋白基因轉(zhuǎn)染軟骨細胞可標(biāo)記軟骨細胞的示蹤。研究表明，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2和BMP-4的調(diào)控下，可在體外誘導(dǎo)ES細胞向軟骨細胞分化，同時保留其分泌型膠原等的特性。Sellers等26用

16、含rhBMP?2的I型膠原海綿修復(fù)兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損，24周時新生軟骨厚度達到正常軟骨的70和潮線形成，rhBMP?2組與單純膠原海綿和曠置組間的差異只有統(tǒng)計學(xué)意義，但是外源性生長因子半衰期短，需較大劑量或連續(xù)給藥才能發(fā)揮作用，增加了治療成本。Baragi等以腺病毒攜帶lacZ作為報告基因，人白介素-1受體拮抗物(hIL-1ra)cDNA作為治療基因，用骨關(guān)節(jié)炎軟骨標(biāo)本體外培養(yǎng)軟骨細胞和小軟骨薄片，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染hIL-1ra基因可抑制IL-1引起的軟骨基質(zhì)變性，認為基因修飾后的軟骨細胞表現(xiàn)出更強的生物學(xué)功能，在一定程度上彌補了自體軟骨細胞供量不足的缺陷，縮短體外培養(yǎng)時間，更好地維持其表型。 &#

17、160;   多項研究表明以腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或脂質(zhì)體等作為載體，轉(zhuǎn)染軟骨細胞、骨膜細胞或直接注入病變部位是可行的，基因工程技術(shù)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域可以使轉(zhuǎn)染的細胞持續(xù)、穩(wěn)定表達促進軟骨修復(fù)的生長因子，但病毒類載體潛在的致畸性、免疫源性以及脂質(zhì)體對種子細胞的毒性和轉(zhuǎn)染率低等尚需進一步改進。    4  展望    種子細胞是構(gòu)建組織工程化軟骨和應(yīng)用研究中的首要環(huán)節(jié)和基本要求，也是保證軟骨組織工程學(xué)持續(xù)性深入研究的前提。影響優(yōu)化軟骨種子細胞源的因素眾多，目前研究的種子細胞各具優(yōu)缺點，尚沒有一種細胞能夠完全滿足

18、軟骨組織工程對種子細胞的要求，今后需要開發(fā)和挖掘更多的種子細胞源，并在模擬體內(nèi)的微環(huán)境中進行培養(yǎng)，建立種子細胞的評價系統(tǒng)，優(yōu)化出理想的種子細胞，為軟骨組織工程的研究和臨床應(yīng)用提供可靠保證。BMSCs相關(guān)研究和技術(shù)比較成熟，今后的研究重點是如何保證細胞能在特定的時間內(nèi)定向擴增到臨床治療所需的數(shù)量，并避免致瘤性的產(chǎn)生。BMSCs和軟骨細胞共培養(yǎng)可能為解決上述問題提供了一種實用的策略，但兩種細胞間的相互作用機制尚需進行深入研究。目前脂肪基質(zhì)細胞和胚胎干細胞的臨床應(yīng)用研究相對滯后，但隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對其成軟骨機制和性能也會不斷了解，優(yōu)勢會逐漸顯現(xiàn)。當(dāng)然，種子細胞的優(yōu)化只是軟骨組織工程學(xué)研究的第

19、一步，今后還要解決細胞所需載體及細胞與載體相容性及相互作用等問題，當(dāng)最終運用到臨床尚需考慮免疫排斥性問題?！緟⒖嘉墨I】  1 Landis WJ,Jacquet R,Hillyer J, et al.The potential of tissue engineering in tissue engineering in orthopedicsJ.Othop Clin N(Am)，2005，36(1)：97-104.2 Vats A，Tolley NS，Polak JM.The stem tell in orthopaedics surgeryJ.J Bone Joint Surg(B

20、r),2001，86(2)：159-163.3 Marlovits S，Hombauer M，Truppe M，et al.Changes in the ratio of type?I and type?II collagen expression during monolayer culture of human chondrocytesJ.J Bone Joint Surg(Br)，2004，86(5)：286-295.4 Steimberg N，Viengchareun S，BiChlmann F，et al.Dedifferentiated adult articularchondro

21、cytes：a population of human multipotent primitive cellsJ.Exp CellRes，2001，249(2)：248-259.5 Alford JW，Cole BJ.Principles of cell mechanics for cartilage tissue engineeringJ.J Sports Med(Am)，2005，33(3)：295-306.6 Akmal M，Singh A，Anand A，et al.Cell origin and differentiation in the repair of full?thickn

22、ess defects of articular cartilageJ.J Bone Joint Surg（Br)，2005，87(6)：1143-1149.7 Hegert C, Kramer J, Hargus G, et al. Differentiation plasticity of chondrocytes derived from mouse embryonic stemcellsJ.J Cell Sci, 2002, 115(23):4617-4628.8 Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, et al. Tissue engineering an

23、d cell therapy of cartilage and boneJ. Matrix Biol, 2003, 22(1):81-91.9 Butnariu?Ephrat M, Robinson D, Mendes DO, et al.Tissue engineering:current challenges and expanding opportunitiesJ.Clin Orthop, 2001, 630(2):234-243.10Gao J, Dennis JE, Solchaga LA, et al. Repair of osteochondral defect with tis

24、sue engineered two?phase composite material of injectable calcium phosphate and hyaluronan spongeJ.Tissue Eng, 2002,8(5):827-837.11Murphy JM, Dixon K, Beck S, et al. Reduced chondrogenic and adipogenic activity of mesenchymal stem cells from patients with advanced osteoarthritisJ. Arthritis heum, 20

25、02, 46(4):704-713.12Rubio D, Garcia?Castro J, Martin MC, et al. Spontaneous transdifferentiation of mesenchymal stem cellsJ.Cancer Res, 2005, 65(8): 3035-3039.13Tsuchiya K, Chen G, Ushida T, et al. The effect of cocultureof chondrocyteswith mesenchymal stem cells on their cartilaginous phenotype in

26、vitroJ.Materials Sci Eng, 2004, 24(2):391-396.14Goldberg AJ, Lee DA, Bader DL, et al. Autologous chondrocyte implantation: culture in a TGF?containing medium enhances the reexpression of a chondrocytic phenotypein passaaed human giondrocytes in pellet cultureJ.J Bone Joint Surg(Br), 2005,87(1):128-1

27、34.15Wakitani S, Goto T, Prneda SJ, et al. Multipotent mesenchymal stem cells fromadult rabbits synovial membraneJ.J Bone Joint Surg(Am),2004,76(3):579-592.16Chu CR, Dounchis JS, Yoshioka M, et al. Rib perichondrial autografts infull?thickness articular cartilage defects in rabbitsJ.Clin Orthop, 200

28、1(2):220-229.17Pate DW, Southerland SS, Grande DA,et al. Cartilage tissue differentiation frommesenchymal cells derived form mature muscle in tissue cultureJ.Surg Forum, 2003,44(3):587-589.18Williams JT, Southerland SS, Souza J, et al. Generation of different fates from multipotent muscle stem cells

29、J.Sura(Am),2003,65(1):22-26.18Adachi N, Sato K, Usas A, et al. Muscle derived, cell based ex vivo gene therapy for treatment of full thickness articular cartilage defectsJ.J Heumatol, 2002,29(9):1920-1930.20Erickson GR, Gimble JM, Franldin DM, et al. Chondrogenic potential of adiposetissue?derived stromal cells in vitro and in vivoJ. Biochem Biophys Res Commun, 2002,290(2):763-769.21Huana JI, Beanes SR, Zhou M, et al. Genetic analysis of adipogenesis throughperoxisomc proliferator?activ