老年人食管鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和化生

1、老年人食管鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和化生    【關(guān)鍵詞】  癌,鱗狀細(xì)胞；食管腫瘤,腺癌；微衛(wèi)星重復(fù)；聚合酶鏈反應(yīng)；barrett食管；化生；增生；序列分析摘要:  目的  評(píng)估老年人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)、食管腺癌(EADC)和Barrett化生不典型增生腺癌序列DNA微衛(wèi)星的改變。  方法  應(yīng)用稀釋性PCR技術(shù)檢測(cè)老年人ESCC、EADC和Barrett化生不典型增生腺癌序列中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、 D5S346、D17S787和D18S61 7個(gè)位點(diǎn)DNA微衛(wèi)星

2、的改變。  結(jié)果  在非稀釋DNA中，23例老年人ESCC和18例老年人EADC微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的頻率分別是47.8% (11/23例)和38.9%(7/18例)，雜合性丟失(LOH)的頻率分別是26.1%(6/23例)和16.7%(3/18例)，兩者的MSI或 LOH頻率比較沒有顯著差別（P0.05）。在稀釋DNA中，8例老年人正常食管鱗狀上皮和Barrett化生異型增生腺癌序列的MSI和LOH頻繁出現(xiàn)，尤其在D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位點(diǎn)上，與非稀釋DNA的MSI和LOH頻率相比有顯著差別（P0.05）。  結(jié)論

3、60; 老年人ESCC和EADC微衛(wèi)星改變沒有差別。老年人正常食管鱗狀上皮和Barrett化生異型增生腺癌組織DNA的MSI和LOH普遍存在，它們可能是 EADC發(fā)生發(fā)展的早期分子事件，D3S1616、D2S123、D3S1300和D17S787位點(diǎn)的微衛(wèi)星改變可能在此過程中起著重要作用。關(guān)鍵詞:  癌，鱗狀細(xì)胞；食管腫瘤，腺癌；微衛(wèi)星重復(fù)；聚合酶鏈反應(yīng)；barrett食管；化生；增生；序列分析Barrett食管發(fā)生腺癌危險(xiǎn)性是一般人群的125倍，其中間過程是柱狀化生上皮向不典型增生上皮轉(zhuǎn)化，稱之為Barrett化生不典型增生腺癌序列12。食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)和食管腺癌(EAD

4、C)是老年人的常見病。老年人反流性食管炎合并的Barrett食管比年輕人的更易發(fā)生不典型增生和腺癌3。為了更好地了解老年人ESCC和EADC的發(fā)生發(fā)展過程，筆者檢測(cè)了ESCC、EADC、正常食管鱗狀上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列組織中D2S123、D3S1616、D3S1300、BATRII、D5S346、D17S787和D18S61 7個(gè)位點(diǎn)DNA微衛(wèi)星的改變。1  材料與方法1.1  病例人與標(biāo)本  選自福建醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)B門第一醫(yī)院病理科2002年3月2005年10月存檔手術(shù)切除食管癌石蠟標(biāo)本41例，患者年齡（68.2±9.6）歲（608

5、0.5歲）；術(shù)前未經(jīng)過化療和放療，標(biāo)本經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)附屬?gòu)B門第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)收集。進(jìn)行常規(guī)組織切片,HE染色和病理診斷。組織病理學(xué)分析：23例ESCC，18例EADC，其中8例EADC在癌組織旁同時(shí)存在Barrett化生和不典型增生上皮。由2位病理醫(yī)師進(jìn)行組織病理學(xué)分析并核對(duì)。1.2  組織病理學(xué)分析、顯微切割、DNA提取和DNA稀釋  先行常規(guī)組織切片、HE染色和組織病理學(xué)分析，在顯微鏡下標(biāo)記所要切割的組織區(qū)域。再切厚度為10 m的組織3片，在顯微鏡下按照HE染色切片上的標(biāo)記進(jìn)行顯微切割，取出組織，裝入0.5 mL離心管。余下蠟塊組織再行常規(guī)切片、HE染色并與切割前

6、的切片比較（圖1）。切割不同蠟塊時(shí)均清潔石蠟切片機(jī)刀頭和刀片，顯微切割不同組織均用不同的潔凈器械。采用蛋白酶K（10 mmol/L TrisHCl,pH 8.0,100 mmol/L KCl,2.5 mmol/L MgCl2,0.45% Tween 20，2.5 mg/mL蛋白酶K）消化方法提取基因組DNA：組織在50 L蛋白酶K消化液中95 變性10 min，常溫冷卻1 h，然后在65 孵育1 h，最后在95 變性10 min去除多余的蛋白酶K，混合物離心（5 000 r/min，5 min），吸出上清液，移至潔凈的離心管。DNA質(zhì)量測(cè)定值在1.072 31.240 1D(260 nm)/D

7、(280 nm),DNA含量為255.36406.98 ng/L。8例正常鱗狀上皮、Barrett化生上皮、不典型增生上皮和EADC組織的DNA分別按1100，11 000，15 000，110 000和150 000稀釋度用三蒸水進(jìn)行稀釋。1.3  稀釋性PCR和微衛(wèi)星改變  7個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)是D2S123，D3S1616，D3S1300，BATR，D5S346，D17S787和D18S61（PCR引物購(gòu)自美國(guó) Research Genetics公司），分別位于hMSH2，hMLH1，F(xiàn)HIT和TGFR基因內(nèi)，MCCAPC基因之間以及p53和DCC基因鄰近。每個(gè)不同稀釋度（

8、1100，11 000,15 000,110 000，150 000）的PCR擴(kuò)增反應(yīng)均包含1 L DNA模板，0.4 Ci:r32PATP放射性標(biāo)志的微衛(wèi)星引物，0.2 mmol/L dNTP,10 mmol/L TrisHCl,pH 8.3,1.5 mmol/L MgCl2,50 mmol/L KCl和0.4 U的Taq多聚酶，反應(yīng)總體積為10 L。PCR反應(yīng)條件為：95 5 min95 30 s58 40 s72 1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 延伸2 min。A:切割前;B:顯微切割后.圖1  Barrett食管不典型增生上皮(HE染色  ×200)（

9、略）Fig 1  Epithelial dysplasia in Barrett esophagus (HE staining  ×200)圖1  Barrett食管不典型增生上皮(HE染色  ×200)（略）1  Epithelial dysplasia in Barrett esophagus (HE staining  ×200)圖2  Barrett食管不典型增生上皮被顯微切割后( HE染色  ×200)（略）Fig 2  Epithelial dyspla

10、sia after microdissection(HE staining  ×200)PCR引物序列如下：   D2S123上游引物：5ACA TTG CTG GAA GTT CTG GC3   D2S123下游引物：5CCT TTC TGA CTT GGA TAC CA3   D3S1616上游引物：5CTC CCT ACC TGA AAA GAT GC3   D3S1616下游引物：5TCG GCT TAA AGA CTC AGT TTA TT3   D3S1300上游

11、引物：5AGC TCA CAT TCT AGT CAG CCT3   D3S1300下游引物：5GCC AAT TCC CCA GAT G3   BATRII上游引物：5CTT TAT TCT GGA AGA TGC TGC3   BATRII下游引物：5GAA GAA AGT CTC ACC AGG C3   D5S346上游引物：5ACT CAC TCT AGT GAT AAA TCG G3   D5S346下游引物：5GTT TCC ATT GTA GCA TCT TGA C3 

12、  D17S787上游引物：5NED TGG GCT CAA CTA TAT GAA CC3   D17S787下游引物：5TTG ATA CCT TTT TGA AGG GG3   D18S61上游引物：5ATT TCT AAG AGG ACT CCC AAA CT3   D18S61下游引物：5ATA TTT TGA AAC TCA GGA GCA T3   對(duì)同一個(gè)稀釋度DNA標(biāo)本均進(jìn)行多次PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用亞甲藍(lán)加樣緩沖液按11稀釋，該緩沖液包含95%亞甲藍(lán)，0.05%溴芬藍(lán)，0.05% 埃

13、先藍(lán)和20 mmol/L EDTA。5 L的PCR產(chǎn)物與2 L變性染料混勻后在7%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳24 h，凝膠在真空干燥機(jī)80 干燥后，用Kodak膠片（美國(guó)Kodak公司）曝光624 h。    微衛(wèi)星改變分析：以同一例正常鱗狀上皮非稀釋DNA為對(duì)照，與其對(duì)比。若電泳圖上出現(xiàn)額外新的等位基因條帶，被確定為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）。在雜合子中，等位基因上出現(xiàn)2倍放射性密度減弱，被確定為雜合性丟失（LOH）。為了保證等位基因在放射性自顯影膠片上容易辨別出來，可進(jìn)行多次曝光比較，放射性自顯影結(jié)果分別由2位醫(yī)師獨(dú)立分析并核對(duì)。1.4  統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)處理  統(tǒng)計(jì)處理應(yīng)用SPSS 12.0分析，F(xiàn)isher精確檢驗(yàn)。P0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2  結(jié)果2.1  ESCC和EADC中非稀釋性DNA微衛(wèi)星的改變  MSI在ESCC和EADC中分別為47.8%（11/23例）和38.9%（7/18例），LOH分別為26.1%（6/23例）和16.7%（3 /18例）。ESCC和EADC比較，MSI或LOH頻率沒有顯著差別（P0.05，表1）。2.2  正常食管鱗狀上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列稀釋性DNA微衛(wèi)星的改變  8例老年人正常食管鱗狀上皮和Barrett化生不典

15、型增生腺癌序列稀釋性DNA的MSI和LOH頻繁出現(xiàn)，與各種組織非稀釋性DNA的結(jié)果相比，絕大多數(shù)有顯著差別（P0.05，表1）。DNA稀釋度從1100倍到15 000倍時(shí)，MSI和LOH頻率在上述7個(gè)位點(diǎn)上的出現(xiàn)逐漸增多，尤其是在D3S1616，D2S123，D3S1300和D17S787位點(diǎn)上。但當(dāng) DNA稀釋到15 000倍以上時(shí)，MSI和LOH頻率則減少或無(wú)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。MSI和LOH的表現(xiàn)形式大多數(shù)相同，少數(shù)MSI不同，少數(shù)LOH出現(xiàn)在不同等位基因上，個(gè)別位點(diǎn)有MSI和LOH并存現(xiàn)象（圖2，表2）。表1  不同食管組織非稀釋和稀釋DNA微衛(wèi)星改變（略）Tab 1  Mi

16、crosatellite alterations of undilution and dilution DNA in different esophageal tissues表中數(shù)據(jù)為例數(shù).  MSI:微衛(wèi)星不穩(wěn)定性； LOH：雜合性丟失.  與非稀釋DNA組比較, :P0.05, :P0.01.表2  不同食管組織非稀釋和稀釋DNA在7個(gè)位點(diǎn)上的微衛(wèi)星改變（略）Tab 2  Microsatellite alterations of undilution and dilution DNA at 7 loci in different esophagea

17、l tissues表中數(shù)據(jù)為例數(shù).  MSI:微衛(wèi)星不穩(wěn)定性； LOH：雜合性丟失.3  討論   食管腺癌的發(fā)生是通過Barrett化生不典型增生腺癌序列的過程，很多分子異常，如原癌基因改變、抑癌基因突變、LOH和一些蛋白的異常表達(dá)與腺癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)47。近年來發(fā)現(xiàn)，微衛(wèi)星的改變?cè)谑彻芟侔┲蓄l繁或不頻繁地出現(xiàn) 810。本研究的目的是探討老年人Barrett化生不典型增生腺癌序列和正常鱗狀上皮的微衛(wèi)星改變。采用顯微切割技術(shù)，確保較豐富和較純凈的組織供研究。   研究發(fā)現(xiàn)，在老年人ESCC和EADC中，MSI分別為47.8%（11/2

18、3例）和38.9%（7/18例），LOH分別為26.1%（6/23例）和16.7%（3/18例），MSI或LOH頻率均無(wú)顯著差別，說明MSI和LOH在老年人ESCC和EADC中較普遍，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相似8，11；但Yanagi等認(rèn)為MSI在ESCC 和EADC中的頻率很低，但其研究例數(shù)很少9。  1:BE非稀釋性; 2:N非稀釋性; 3:N 1100; 4:N 11 000; 5:N 15 000; 6:N 110 000; 7:N 150 000; 8:BE 1100; 9:BE 11 000; 10:BE 15 000; 11:BE 110 000; 12:BE 150 000.

19、  和分別為微衛(wèi)星不穩(wěn)定性或雜合性丟失.  BE:Barrett食管化生上皮DNA,N:同一病人正常鱗狀上皮DNA.圖2  稀釋DNA微衛(wèi)星的改變（略）Fig 2  Microsatellite alterations in dilution DNA   箭（）和箭頭（）分別指的是微衛(wèi)星不穩(wěn)定性和雜合性丟失.BE示Barrett食管化生上皮DNA，N示同一病人正常鱗狀上皮DNA，1100150 000示稀釋倍數(shù).圖3  稀釋DNA微衛(wèi)星的改變（略）Fig 2  Microsatellite alterations

20、in dilution DNA有學(xué)者認(rèn)為，肉眼可見的腫瘤是一個(gè)亞群或幾個(gè)亞群細(xì)胞克隆增長(zhǎng)的結(jié)果12，這暗示一群腫瘤細(xì)胞可能共同擁有某些遺傳改變。所以，本研究選擇 Barrett化生不典型增生腺癌序列及其旁正常鱗狀上皮進(jìn)行研究，以探討微衛(wèi)星變化是否是它們共同的分子事件，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在非癌組織非稀釋DNA 中很少發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星改變。另?yè)?jù)報(bào)道，混雜在一群基因正常細(xì)胞中的幾個(gè)基因異常細(xì)胞是很難被發(fā)現(xiàn)的，只有當(dāng)DNA稀釋到0.1%濃度或0.53個(gè)細(xì)胞量的 DNA時(shí),這些基因異常的細(xì)胞才容易被發(fā)現(xiàn)13。所以，本研究將DNA模板稀釋后行PCR擴(kuò)增（稱為稀釋性PCR）再進(jìn)行微衛(wèi)星改變分析。結(jié)果顯示，在Barr

21、ett化生不典型增生腺癌序列稀釋DNA結(jié)果中，MSI和LOH頻繁出現(xiàn)，并隨DNA稀釋度的增加而增多，與非稀釋DNA的結(jié)果相比較均有顯著差別；正常鱗狀上皮MSI頻率也有顯著差別。說明MSI和LOH在上述組織中普遍存在。當(dāng)稀釋度>15 000倍時(shí)，MSI和LOH出現(xiàn)的頻率就減少或?qū)嶒?yàn)結(jié)果無(wú)法獲得，這可能是因?yàn)镈NA模板太少，PCR產(chǎn)物無(wú)法獲得的緣故。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 Barrett化生不典型增生腺癌序列及其旁正常鱗狀上皮稀釋DNA中，微衛(wèi)星改變主要集中在D3S1616,D2S123,D3S1300和 D17S787位點(diǎn)上。這些共同分子改變提示，在相同環(huán)境生長(zhǎng)的正常細(xì)胞群中，可能有部分的細(xì)胞

22、獲得微衛(wèi)星改變并不斷克隆擴(kuò)增，與導(dǎo)致腫瘤有關(guān)。   本研究表明，微衛(wèi)星改變普遍存在于老年人正常鱗狀上皮和Barrett化生不典型增生腺癌序列中，這些改變從分子水平上支持了Barrett化生不典型增生腺癌序列發(fā)展的觀點(diǎn)。結(jié)果提示，在EADC發(fā)生發(fā)展過程中，與微衛(wèi)星改變相關(guān)；MSI和LOH可能是早期分子事件，D3S1616,D2S123,D3S1300和D17S787位點(diǎn)微衛(wèi)星改變?cè)诖诉^程中起著重要作用，它們可能作為EADC早期診斷的分子標(biāo)志。參考文獻(xiàn)：1  Romagnoli S,Roncalli M,Graziani D,et al. Molecular alterations of barrett's esophagus on microdissected endoscopic biopsiesJ. Lab Invest, 2001,81:241247.2  Rossi M,Barreca M,de Bortoli N,et al. Efficacy of Nissen fundoplication versus medical therapy in the regressio