基因工程工具酶

1、 基基 因因 工工 程程工工 具具 酶酶基因工程工具酶基因工程工具酶 自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些自然界的許多微生物體內(nèi)存在著一些具有特異功能的酶類。這些酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，酶類參與微生物的核酸代謝，在核酸復(fù)制和修復(fù)等反應(yīng)中具有重要作用，有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的有的酶還作為微生物區(qū)別自己和非己的DNADNA進而降解非己進而降解非己DNADNA的防御工具。的防御工具。在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了在研究掌握了利用這些酶類對基因切割、拼接操作方法后，人類獲得了最好的基因工程工具。最好的

2、基因工程工具。 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依賴一些酶( (如限制如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶，性核酸內(nèi)切酶，連接酶，DNADNA聚合酶等聚合酶等) )作為工具對基因進行人工切割，拼作為工具對基因進行人工切割，拼接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為接和擴增等操作。所以把這些酶稱之為“工具酶工具酶”。工具酶是對野生菌株。工具酶是對野生菌株（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。（或真核生物如酵母）進行改造、優(yōu)化、而產(chǎn)生的生物工程產(chǎn)品。 隨著越來越多的酶分子被發(fā)現(xiàn)，許多廠商已將其克隆并開發(fā)成隨著越來越多的酶分子被發(fā)現(xiàn)，許多

3、廠商已將其克隆并開發(fā)成產(chǎn)品，工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，不僅簡化了分子克隆的操作，產(chǎn)品，工具酶的數(shù)量和用途不斷增加，不僅簡化了分子克隆的操作，而且拓寬了研究領(lǐng)域。而且拓寬了研究領(lǐng)域。 本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。本章主要介紹用于基因工程的各種工具酶。基因工程工具酶基因工程工具酶 限制性內(nèi)切酶 甲基化酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶 DNA連接酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restriction enzyme)(restriction enzyme)細(xì)菌的限制細(xì)菌的限制修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶的分類限制性內(nèi)切酶的

4、分類限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及切割特點限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及切割特點限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用細(xì)菌的限制細(xì)菌的限制修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)修飾作用和限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1 1、細(xì)胞的限制、細(xì)胞的限制修飾作用修飾作用 5050年代后年代后LuriaLuria和和Human(1952) BertaniHuman(1952) Bertani和和Weigle(1953)Weigle(1953)發(fā)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的現(xiàn)細(xì)菌的“限制限制”現(xiàn)象：現(xiàn)象：Phage（k）感染感染E.coli

5、k不感染不感染E .coli B【E .coli B 限制限制 （k）】）】 仍有少量仍有少量(K)(K)可在可在 E.coliE.coli B B中生存，是因中生存，是因 E.coliE.coli B B對對(K)(K)進行進行了修飾。了修飾。E.coliE.coli B B修飾修飾(k)(k)* *(k)(k)感染感染E.coli(BE.coli(B) )細(xì)菌如何對細(xì)菌如何對噬菌體進行限制和修飾。噬菌體進行限制和修飾。2 2、細(xì)菌的限制、細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)修飾系統(tǒng) 19621962年年W.ArberW.Arber( (瑞士瑞士) )發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在發(fā)現(xiàn)，寄主對噬菌體的修飾是在P

6、hagePhage入的入的DNADNA上。上。 19651965年，年，ArberArber發(fā)現(xiàn)修飾與發(fā)現(xiàn)修飾與的降解有關(guān)，提出：細(xì)胞中存在位點特的降解有關(guān)，提出：細(xì)胞中存在位點特異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制異性限制酶和特異性甲基化酶，即細(xì)胞中有限制修飾系統(tǒng)。修飾系統(tǒng)。R-MR-M系統(tǒng)是細(xì)系統(tǒng)是細(xì)菌安內(nèi)御外的積極措施。菌安內(nèi)御外的積極措施。 3 3、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 19681968年年LinnLinn和和ArberArber從從E.coliE.coli B B中發(fā)現(xiàn)限制酶中發(fā)現(xiàn)限制酶,M.Meselson,M.Meselson和和R.yuanR.yuan從

7、從E.coliE.coli K K中分離到另一限制性的內(nèi)切酶。中分離到另一限制性的內(nèi)切酶。 1970 1970年年Smith (Smith (美美) )在流感嗜血桿菌又發(fā)現(xiàn)另一限制酶即限制酶在流感嗜血桿菌又發(fā)現(xiàn)另一限制酶即限制酶。 限制酶的功能：降解不同源限制酶的功能：降解不同源DNADNA，而不降解同源，而不降解同源DNADNA。 19781978年年W.ArberW.Arber、H.O.Smith(H.O.Smith(美美) )，NathansNathans( (美美) )因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切因發(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金。酶及對其功能研究的突出貢獻獲得諾貝爾獎金。

8、限制性內(nèi)切酶的分類：限制性內(nèi)切酶的分類： 目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有三大類：目前已發(fā)現(xiàn)的限制酶有三大類：類型 識別與切割位點分別，隨意切割，相距較遠(yuǎn)，單鏈切割 相同 相距5-10bp功能(限制， 修飾)對基因工程意義防御，單功能不大 單功能 大 雙功能(限制-修飾)不大限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶的命名EcoR IEscherichia屬名屬名Coli種類種類Ry13株系株系編號編號 若種名頭若種名頭2 2個字母相同則其中一個可用種名的第一和第個字母相同則其中一個可用種名的第一和第三個字母。三個字母。限制性內(nèi)切酶的活性單位限制性內(nèi)切酶的活性單位 50l Buffer50l Buffer中，含中，含

9、1g1g底物底物DNADNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫溫1 1小時，能使小時，能使1g DNA1g DNA完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用完全降解所需的酶蛋白量即為一個酶單位，用U U表示。（表示。（bufferbuffer：pH=8.0pH=8.0，50mmol/L Tris-HCl50mmol/L Tris-HCl，10mmol/L MgCl10mmol/L MgCl2 2 ，1mmol/L DTT1mmol/L DTT或巰基乙醇，或巰基乙醇，100g BSA/ml100g BSA/ml）限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及切割特點限制性內(nèi)切酶的性質(zhì)及切割特點 1

10、1、裂解產(chǎn)物均具有、裂解產(chǎn)物均具有33羥基和羥基和55磷酸殘基，磷酸殘基，5P-N N5P-N NNNNNNN-OH 3NN-OH 3。 2 2、識別序列及切點的高度專一。、識別序列及切點的高度專一。E C O R I5 G A A T T C 33 C T T A A G 5BamH IG G A T C CC C T A G G3 3、有三種不同裂解方式：、有三種不同裂解方式： a. 平齊未端平齊未端環(huán)形環(huán)形DNA:如如 Hind 、Hpa、Sma、Alu、Hae。 .5?RCCC GGG 3. .3GGG CCC 5. 5?R CCC GGG 3 3 GGG CCC 5?R b. 5粘性

11、末端粘性末端 5?R G A A T T C 3 3 C T T A A G 5?R 5?RG 5A A T T C 3 3C T T A A 5 G 5?R 如如Ecolc. 3c. 3粘性末端粘性末端如如 PstPst 5?R C T G C A G 3 3 G A C G T C 5?R 5?R C T G C A G 3 3 G A C G T C 5?R 同裂酶同裂酶(isoschizomer)1. 1. 定義：能識別相同序列但來源不同的兩種定義：能識別相同序列但來源不同的兩種 或多種限制或多種限制 酶酶2. 2. 特點：特點：1 1）識別相同順序）識別相同順序 2 2）切割位點的異

12、同）切割位點的異同 KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstII CCGC GG SacII CCGC GG SmaI CCC GGG XmaI C CCGGG同同 尾尾 酶酶如：如：BamHI G GATCC BglII A GATCT MboI, Sau3AI N GATCN 上述幾種限制酶產(chǎn)生的上述幾種限制酶產(chǎn)生的DNA片段仍可相連，由此形片段仍可相連，由此形成的重組分子能被成的重組分子能被MboI和和Sau3AI識別和酶切，但識別和酶切，但BamHI和和BglII的識別機率只有的識別機率只有1/16。 BamHI + MboI A/C/G/T GATCT/C/G/

13、A BamHI和和BglII(AGATCT)兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，兩種酶產(chǎn)生的相容性末端，相連后不能為兩種酶所識別和酶切。相連后不能為兩種酶所識別和酶切。 BamHI + BglII A/G GATCT/C限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件限制性內(nèi)切酶的反應(yīng)條件 1 1、底物、底物 DNADNA a. DNA a. DNA 純度純度: RNA : RNA 與與 E E 結(jié)合影響有效酶濃度；結(jié)合影響有效酶濃度；RNARNA影響影響( (干擾干擾) )電泳區(qū)帶。電泳區(qū)帶。 b. DNAb. DNA濃度濃度: : DNADNA過大，會抑制酶活過大，會抑制酶活( (影響酶分子擴散影響酶分子擴散) )。 如：如：

14、4g DNA /1U HPa4g DNA /1U HPa 50l 50l 在在3737下下 15h15h 而而 1g DNA /1U HPa1g DNA /1U HPa 50l 50l 在在3737下下 1h1h c. c. 識別位點及鄰近位點特異性序列識別位點及鄰近位點特異性序列 由于切點鄰近序列不同，水解速度不同。由于切點鄰近序列不同，水解速度不同。如：如： DNADNA有有5 5個個ECORIECORI切點，其中兩個相差切點，其中兩個相差1010倍。倍。 pBR322 DNA pBR322 DNA 有有4 4個個NarNar切點切點(GGCGCC)(GGCGCC)其中其中2 2個切點用個

15、切點用1U1U酶水解酶水解1h1h完全完全切開切開,2,2個切點用個切點用50U50U酶水解酶水解16h16h水解不完全。水解不完全。 XmaXma切點是切點是CGGCCGCGGCCG，但在，但在GGGGCGGCCGCGGCCGCCCC時不切割時不切割 d. DNAd. DNA二級二級/ /三級結(jié)構(gòu)三級結(jié)構(gòu) 超螺旋超螺旋DNA(DNA(病毒或質(zhì)粒病毒或質(zhì)粒) )比線狀比線狀DNADNA需更多酶。需更多酶。 e. e. 提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性提取時混入雜質(zhì)可改變識別特異性 如：如： 高濃度高濃度HgHg2+2+、酚，氯仿、乙醇、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDSEDTA SDS、NaClN

16、aCl等。等。 2 2、反應(yīng)系統(tǒng)因素、反應(yīng)系統(tǒng)因素 a. a. 緩沖液（無菌、無污染、配成核心緩沖液，即幾種酶的相近緩沖液（無菌、無污染、配成核心緩沖液，即幾種酶的相近bufferbuffer） b. b. 金屬離子金屬離子 如如型酶需型酶需MgMg2+2+，若以，若以MnMn2+2+代替代替MgMg2+2+（如（如HindHind，ECORIECORI）則特異性改變。）則特異性改變。 離子濃度，合適離子濃度，合適激發(fā)酶活；不合適激發(fā)酶活；不合適抑制酶活。抑制酶活。 c. c. 牛血清蛋白牛血清蛋白(BSA)(BSA) BSA BSA 是酶穩(wěn)定劑，機制：減少蛋白酶及非特異性吸附作用。避免熱、表

17、面是酶穩(wěn)定劑，機制：減少蛋白酶及非特異性吸附作用。避免熱、表面張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過量張力、化學(xué)品導(dǎo)致的酶變性。過量BSABSA會引起電泳拖尾?？赏ㄟ^加會引起電泳拖尾?？赏ㄟ^加SDS/65/5minSDS/65/5min除去。除去。 e. e. 水質(zhì)：無離子水，水質(zhì)：無離子水，ddHddH2 2O O，雙蒸水。，雙蒸水。 3 3、星活性、星活性 識別特異性放寬，如識別特異性放寬，如GAATTCAATTGAATTCAATT，為，為ECORIECORI。 造成星活性參數(shù)：造成星活性參數(shù)： 甘油濃度甘油濃度12-20%12-20%，酶與，酶與DNADNA比例，離子強度，比例，離子強度，45%4

18、5%聚乙二醇聚乙二醇(PEG)(PEG)，有機溶，有機溶劑，劑，8%8%二甲基亞楓，二介陽離子，二甲基亞楓，二介陽離子，12%12%乙醇。乙醇。 星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。星活性可造成位點切割機率不等，降解不完全。Lane 1:PUC 19質(zhì)粒DNA Lane 2:經(jīng)EcoR I 酶切的酶切產(chǎn)物 Lane 3:質(zhì)粒經(jīng)Pvu II 酶切產(chǎn)物L(fēng)ane 4:質(zhì)粒經(jīng)Taq酶切產(chǎn)物質(zhì)物M: Axygen 1Kb DNA LadderLane 1:質(zhì)粒DNA Lane 2:經(jīng)EcoR I 酶切的 酶切產(chǎn)物M: Axygen 1Kb DNA Ladder限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用1

19、 1、重組、重組DNADNA前的切割前的切割 2 2、構(gòu)建新質(zhì)粒、構(gòu)建新質(zhì)粒3 3、構(gòu)建物理圖譜、構(gòu)建物理圖譜4 4、DNADNA分子雜交分子雜交 用限制性內(nèi)切酶消化受體用限制性內(nèi)切酶消化受體DNADNA 5 5、制備、制備DNADNA探針探針 6 6、亞克隆以用作序列分析、亞克隆以用作序列分析7 7、基因定位，、基因定位，DNADNA同源性研究。同源性研究。 1、大多數(shù)大多數(shù) E.coliE.coli 中含有中含有兩種兩種可甲基化可甲基化DNADNA的酶的酶 dam dam 甲基化酶甲基化酶 Dcm Dcm 甲基化酶甲基化酶 dam dam 可將甲基引入可將甲基引入 GATC GATC 序列

20、中的腺嘌呤序列中的腺嘌呤N N6 6位。位。 dcmdcm 甲基化酶可將甲基引入甲基化酶可將甲基引入 CCA/TGG CCA/TGG 序列中的胞嘧啶殘基甲基化。序列中的胞嘧啶殘基甲基化。 甲基化酶甲基化酶 在在DNA重組實驗中，常用的甲基化酶屬于重組實驗中，常用的甲基化酶屬于II型，它與相應(yīng)的限制酶型，它與相應(yīng)的限制酶的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。的識別順序相同，其甲基化位點與限制酶作用位點可同可不同。如：如：M. EcoRI GA mATTCC EcoRI G AATTC 不同不同 MHpaI C mCGG HpaI C CGG 相同相同2、制備細(xì)菌、制備細(xì)菌DNA

21、時，應(yīng)注意時，應(yīng)注意DNA在原細(xì)胞中的被修在原細(xì)胞中的被修飾，選用無限制系統(tǒng)細(xì)菌飾，選用無限制系統(tǒng)細(xì)菌(E.coli)或選用甲基化不敏感或選用甲基化不敏感的同裂酶。的同裂酶。3 3、用甲基化酶進行甲基化、用甲基化酶進行甲基化 a. a.對大多數(shù)對大多數(shù)型限制酶來說，都已分離出相應(yīng)的甲基化酶型限制酶來說，都已分離出相應(yīng)的甲基化酶(methylase(methylase) )。 b. b.甲基化酶也稱修飾酶甲基化酶也稱修飾酶(modification enzyme)(modification enzyme)已做為一種商品廣泛應(yīng)用。已做為一種商品廣泛應(yīng)用。 c. c.甲基化酶的用途甲基化酶的用途 1

22、) 1) 保護某些切點不被切割；保護某些切點不被切割；對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶對甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶限制酶限制酶 識別序列識別序列* * 甲基化酶甲基化酶AvaAva GG(A/T)GG(A/T)CCCC(A/T)GG (A/T)GG dcmdcmBclBcl T TGATCGATCA A dam dam ClaCla G GATCATCGATGAT dam dam EcoEcoR R CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmHphHph GGTGGTGAGATCTC dam damMboMbo GATCGATC dam damNruNru GAGATCTCGCGAGCGA d

23、am damSauSau96 96 GGNGGNCCCC(A/T)GG(A/T)GG dcmdcmSauSauF F CC(A/T)GGCC(A/T)GG dcmdcmStuStu AGGAGGCCTCCTGGGG dcmdcmTagTag GATCGATCGA damGA damXbaXba TCTATCTAGAGATCTC dam dam * *下橫線字母表示限制酶識別序列下橫線字母表示限制酶識別序列, , 綠色字母表示綠色字母表示damdam甲基化酶識別序列甲基化酶識別序列, ,紅色紅色字母表示字母表示dcmdcm甲基化酶識別序列甲基化酶識別序列 2) 2) 配合連接子的使用，建立配合連

24、接子的使用，建立DNADNA片段粘性末端；片段粘性末端； 在建立基因文庫時，可先使在建立基因文庫時，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3與載體相連與載體相連甲基甲基化酶化酶人工人工接頭接頭RE用于基因組文庫的建立用于基因組文庫的建立用于用于cDNA的連接的連接RERERE DPNI DPNI是唯一識別是唯一識別GAGAm6m6TCTC的限制酶，而不降解的限制酶，而不降解GATCGATC。 M.Taq1 M.Taq1可使可使TCGATCGA甲基化甲基化TCGATCGAm

25、6m6 TCGA + TCGA TCGA + TCGA 或或DNADNA中的中的 TCGATCGATCGATCGA序列。序列。連接酶連接酶TCGATCGATCGATCGA M.TaqlM.Taql TCTCGAGAm6m6TCTCGAGAm6m6DPNIDPNI切點切點 3) 3) 構(gòu)建新的酶切位點構(gòu)建新的酶切位點 如：如： 4)4)封閉封閉DNADNA鏈中某些識別位點，交叉保護通過修飾封閉多余的限制性切點。鏈中某些識別位點，交叉保護通過修飾封閉多余的限制性切點。 如：一段如：一段DNADNA有二個有二個BamHIBamHI識別位點，其中一個識別位點，其中一個BamHIBamHI與修飾位點重疊

26、與修飾位點重疊 可通過修飾將此位點封閉?？赏ㄟ^修飾將此位點封閉。 DNA DNA聚合酶：指在聚合酶：指在DNA(DNA(或或RNA)RNA)模板指導(dǎo)下，以模板指導(dǎo)下，以4 4種種dNTPdNTP為底物，在引物為底物，在引物3 3 OH OH末端聚合末端聚合DNADNA鏈的一類酶。鏈的一類酶。 特點：特點： 需模板需模板(DNA(DNA或或RNA)RNA)； 需引物；需引物； 聚合方向聚合方向5353； 同時具有同時具有3535和外切和外切5353外切作用。外切作用。DNA聚合酶聚合酶種類：種類： 目前已發(fā)現(xiàn)的和已開發(fā)的此類酶有以下幾種：目前已發(fā)現(xiàn)的和已開發(fā)的此類酶有以下幾種： DNADNA聚合

27、酶聚合酶(全酶全酶)(E.coli)(E.coli) ) KlenowKlenow片段片段(E.coli(E.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) T TDNADNA聚合酶聚合酶(T(TPhagePhage感染的感染的E.coliE.coli) ) 修飾的修飾的T TDNADNA聚合酶聚合酶( (測序酶測序酶) ) TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶( (耐熱耐熱)(Thermusaqraticus)(Thermusaqraticus) ) DNADNA末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶( (小牛胸腺小牛胸腺) ) 反轉(zhuǎn)錄酶反

28、轉(zhuǎn)錄酶( (依賴依賴RNA)RNA)聚合酶聚合酶 - -為依賴為依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶聚合酶 為不依賴為不依賴DNADNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶。 為依賴為依賴RNARNA的的DNADNA聚合酶。聚合酶?；钚耘c用途活性與用途 1 1、 E.coli DNA聚合酶聚合酶I（polI） 來源：來源：E.coliE.coli，由染色體，由染色體DNADNA基因編碼。商品上用的此酶來源于基因編碼。商品上用的此酶來源于Phage NM964Phage NM964整合的溶源性整合的溶源性E.coliE.coli。結(jié)構(gòu)：一條多肽鏈，結(jié)構(gòu)：一條多肽鏈，MW = 109MW = 109，

29、000 D000 D。具兩種外切酶活性和具兩種外切酶活性和DNA聚合酶聚合酶活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具活性，在蛋白酶作用下，該酶分裂成兩個大小不同的片段，其中小片段具53外切酶活性，大片段具外切酶活性，大片段具35外切酶活性外切酶活性(大片段亦稱為大片段亦稱為Klenow片段片段, polIK)聚合酶活性，聚合酶活性，53, 要求要求3-OH引物和模板引物和模板DNA，其延續(xù)性受反應(yīng)條，其延續(xù)性受反應(yīng)條件的影響件的影響E.coli DNA PolI 的延續(xù)性的延續(xù)性 DNA模板模板-引物類型引物類型 反應(yīng)條件反應(yīng)條件 延續(xù)性延續(xù)性(堿基數(shù)堿基數(shù)) 切口切口

30、 ColE1 37C, 低鹽低鹽 8 缺口缺口 ColE1 37C, 低鹽低鹽 47 切口切口/缺口胸腺缺口胸腺DNA 37C, 低鹽低鹽 24 poly) 5C, 低鹽低鹽 14 poly d(AT d(AT) 37C, 低鹽低鹽 188 poly d(AT) 5C, 高鹽高鹽 3用用 途途1） 除去除去3-端突起的單鏈端突起的單鏈DNA（在無（在無dNTP時）時）2） 補齊補齊5-突起端突起端3） 合成第二條合成第二條cDNA4） 切口移位制備探針切口移位制備探針 其中用途其中用途2) 和和3)常用大片段常用大片段 來源：來源：E.coliE.coli DNA Polymerase DNA

31、 Polymerase經(jīng)蛋白酶水解的大片段經(jīng)蛋白酶水解的大片段(Klenow(Klenow和和Henningseon.1970)Henningseon.1970)DNApolymerasel枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶或胰蛋白酶或胰蛋白酶C 端端76，000 dKlenow活性活性 聚聚合合 5外切外切N 端端36，000 5外切外切 Jacobsen(1974),Joyce Jacobsen(1974),Joyce 和和 Grindley,(1983)Grindley,(1983)克隆此大片段?？寺〈舜笃巍?2. klenow(E.coli)用途：用途： 填補限制酶的填補限制酶的5-5-粘

32、性末端為平齊末端：粘性末端為平齊末端： C C C C G G A A T TKlenow C C T T A A G G A A T T 末端標(biāo)記末端標(biāo)記 a. 平齊末端中用（平齊末端中用（-32p) dNTP , 底物可標(biāo)記底物可標(biāo)記 末端末端 b. 對于對于粘性末端粘性末端 A A G G C C T T A A T T C C G G 外切外切 外切外切無底物時無底物時Klenow A A TT C C G G 4 種種Dnap+ - 32p dNTPKlenow A A G G C C T T C C G G Klenow 在無底物時只進行在無底物時只進行 外切；有底物存在時則聚合。

33、外切；有底物存在時則聚合。 以上也稱作交換標(biāo)記，但此作用不如以上也稱作交換標(biāo)記，但此作用不如T4DNA聚合酶。聚合酶。在在cDNA克隆中合成克隆中合成cDNA第二鏈。第二鏈。RNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄RNAcDNARnase HSS cDNAKlenowds cDNA DNADNA測序測序末端終止法末端終止法(Sanger 1977)(Sanger 1977) 通過通過3535外切，平齊限制酶切產(chǎn)生的外切，平齊限制酶切產(chǎn)生的33粘性末端粘性末端( (現(xiàn)在多用現(xiàn)在多用T TDNA DNA polymersasepolymersase) ) 最早用于最早用于PCRPCR聚合反應(yīng)，現(xiàn)已用聚合反應(yīng)，現(xiàn)已用Ta

34、qTaq酶取代。酶取代。3 3、T T4 4DNADNA聚合酶聚合酶 來源：來源： T T4 4PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：MW=114000dMW=114000d活性：活性： 53 53聚合反應(yīng)；聚合反應(yīng)； 35 35外切活性對單鏈活性大于雙鏈外切活性對單鏈活性大于雙鏈DNADNA，外切酶活性比，外切酶活性比KlenowKlenow大大200200倍。倍。用途：用途：5533補齊或末端標(biāo)記，補齊或末端標(biāo)記，同于同于Klenow 3- 3-粘性末端的標(biāo)記制備粘性末端的標(biāo)記制備DNADNA探針探針, ,同同 KlenowKlenow 末端標(biāo)記末端標(biāo)記b b

35、。延伸結(jié)合于單鏈延伸結(jié)合于單鏈DNADNA模板上的誘變寡核苷酸引物。模板上的誘變寡核苷酸引物。D誘變引物誘變引物T T4 4 DNA聚合酶聚合酶誘變誘變DNA5533 填補或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的填補或標(biāo)記限制酶切后產(chǎn)生的5-粘性末端的粘性末端的3-凹缺末端。凹缺末端。 外切酶活性外切酶活性 聚合酶活性聚合酶活性 無無dNTP dNTP4 4、T T7 7DNADNA聚合酶（測序酶）聚合酶（測序酶） 來源：來源：T T7 7PhagePhage感染的感染的E.coliE.coli 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：由由2 2個蛋白亞基組成：個蛋白亞基組成：a.Ta.T7 7phage gene5phage gene5

36、蛋白、外切蛋白、外切 3535末端末端 b. b. 宿主硫氧蛋白宿主硫氧蛋白活性：活性：5353聚合，在所有聚合，在所有DNADNA聚合酶中持續(xù)反應(yīng)時間最長，所以合成聚合酶中持續(xù)反應(yīng)時間最長，所以合成 的的DNADNA鏈長。故在鏈長。故在DNADNA測序中有很大優(yōu)越性測序中有很大優(yōu)越性 35 35外切活力外切活力(T(TPhage gene5Phage gene5編碼編碼) )是是DNA DNA 聚合酶聚合酶I I的的 10001000倍。倍。用途：用途： 復(fù)制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列復(fù)制較長的模板，在測序中可讀出較長的序列 用填補或交換反應(yīng)快速進行末端標(biāo)記。用填補或交換反應(yīng)快速進

37、行末端標(biāo)記。55333355與與T TDNApolDNApol一樣，平齊粘性末端。一樣，平齊粘性末端。定點突變中互補鏈的合成。定點突變中互補鏈的合成。5 5、修飾的、修飾的 T T7 7DNA DNA 聚合酶聚合酶( (測序酶測序酶) )來源：來源：天然天然 T TDNAPolymeraseDNAPolymerase 經(jīng)修飾處理。經(jīng)修飾處理。結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：同同T T聚合酶，用還原劑、分子氧、低濃度聚合酶，用還原劑、分子氧、低濃度 FeFe與酶保溫幾天，與酶保溫幾天，可使可使PhageTPhageT7 7 gene5gene5蛋白蛋白N-N-端端3535外切酶活性中心失活外切酶活性中心失活(O(O

38、- - 修修飾飾) )。即：即：5353聚合酶作用提高，持續(xù)性長。聚合酶作用提高，持續(xù)性長。3 53 5外切作用下外切作用下降降99%99%以上。以上。已用基因工程方法生產(chǎn)出改進的測序酶已用基因工程方法生產(chǎn)出改進的測序酶2.02.0其已完全無外切酶活性。其已完全無外切酶活性。用途：用途：DNADNA序列分析，可讀出較長的序列。序列分析，可讀出較長的序列。聚合能力高，可有效地將低水平聚合能力高，可有效地將低水平dNTPdNTP( (0.1mol/L)0.1mol/L)摻入到被摻入到被標(biāo)記底物中。標(biāo)記底物中。 填補末端標(biāo)記填補末端標(biāo)記5-5-粘性末端的粘性末端的33端。端。6 6、TaqTaq D

39、NA DNA 聚合酶聚合酶(Thermusaqraticus(Thermusaqraticus) ) 來源：來源：從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種。從耐熱細(xì)胞中純化，已有基因工程酶多種。結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：單亞基單亞基MW=94000dMW=94000d?；钚裕夯钚裕壕酆献钸m溫度為聚合最適溫度為75-8075-80，不具，不具3535外切酶活性，具外切酶活性，具5353外切。外切。用途：用途： PCR PCR反應(yīng)；反應(yīng)； 測序，高溫下進行測序，高溫下進行DNADNA合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。合成可減少模板二級結(jié)構(gòu)。 5 3 變性變性 3 5 5 3 引物引物 3 5 復(fù)性復(fù)性 5 3 5 3 3 5

40、 引物引物 3 5 5 3 延伸延伸 5 3 3 5 3 5 7 7、末端轉(zhuǎn)移酶、末端轉(zhuǎn)移酶( (不依賴模板的不依賴模板的DNADNA聚合酶聚合酶) )來源：來源：是一種只在前淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化早期階段中存在的罕見的是一種只在前淋巴細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分化早期階段中存在的罕見的DNADNA聚合酶聚合酶(Chang(Chang和和Bollum,1986)Bollum,1986)。 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)：MW=60MW=60，000d.000d.活性：活性： 催化催化dNTPdNTP摻入摻入DNA 3-DNA 3-羥末端，形成同聚物末端羥末端，形成同聚物末端 反應(yīng)不需模板反應(yīng)不需模板DNADNA，需，需CoC

41、o2+2+。用途：用途： 克隆克隆DNADNA片段時加上互補同聚物末端，便于與載體連接。片段時加上互補同聚物末端，便于與載體連接。 末端標(biāo)記末端標(biāo)記切平反應(yīng)和補平反應(yīng)切平反應(yīng)和補平反應(yīng) 5AAGCTT3 HindIII 5A AGCTT3 3TTCGAA5 3TTCGA A5 S1 dNTP+ klenow frag 5A T3 5AAGCT AGCTT3 3T A5 3TTCGA TCGAA5 T4 DNA連接酶連接酶 T4 DNA連接酶連接酶 5AT3 5AAGCTAGCTT3 3TA5 3TTCGATCGAA5四種不同補平反應(yīng)四種不同補平反應(yīng)5-GGATCC-3 BamHI 5-G GA

42、TCC-33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 8 8、反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄酶 來源：商品反轉(zhuǎn)錄酶有兩種來源：商品反

43、轉(zhuǎn)錄酶有兩種來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒來自禽類成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)(AMV)。來自能表達來自能表達MoloneyMoloney鼠白血病毒鼠白血病毒(M-MLV)(M-MLV)反轉(zhuǎn)錄酶基因的反轉(zhuǎn)錄酶基因的E.coliE.coli。結(jié)構(gòu)和活性：結(jié)構(gòu)和活性：結(jié)構(gòu)和活性：酶類別肽鏈53聚合活性RNaseHAMV2 條 :62000 :94000+M-MLV1 條 84000+合成長合成長cDNAcDNA M-MLV M-MLV優(yōu)于優(yōu)于AMV.AMV.均無均無3535核酸外切酶活性。核酸外切酶活性。用途：用途： 合成合成cDNAcDNA克隆至載體中；克隆至載體中；粘性末端補平、標(biāo)記；粘性末端補平、標(biāo)記；

44、雙脫氧測序時，如用其它酶效果不好，可使用反轉(zhuǎn)錄酶。雙脫氧測序時，如用其它酶效果不好，可使用反轉(zhuǎn)錄酶。RNA RNA 聚合酶聚合酶1 1、RNARNA聚合酶聚合酶 來源：商品酶為來源：商品酶為T T7 7、T T3 3RNA RNA 聚合酶在聚合酶在E.coliE.coli中的克隆表達。中的克隆表達。T T7 7、T T3 3、RNA RNA 聚合酶在酵母中的克隆表達。聚合酶在酵母中的克隆表達。E.coliE.coli RNA RNA聚合酶。聚合酶。酶活：酶活：DNADNA指導(dǎo)下的指導(dǎo)下的RNARNA合成，結(jié)合于啟動子部位。轉(zhuǎn)錄無意義鏈合成，結(jié)合于啟動子部位。轉(zhuǎn)錄無意義鏈( (一一) )產(chǎn)生與有

45、意產(chǎn)生與有意義鏈相似義鏈相似( (以以U U代替模板中代替模板中T)T)的鏈。的鏈。轉(zhuǎn)錄鏈為無意義鏈，負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄鏈為無意義鏈，負(fù)鏈(-)(-)。不轉(zhuǎn)錄鏈為有意義鏈，正鏈不轉(zhuǎn)錄鏈為有意義鏈，正鏈(+)(+)2 2、多聚、多聚(A)(A)聚合酶聚合酶(E.coli(E.coli) ) 結(jié)構(gòu)：結(jié)構(gòu)： MW=58000MW=58000，一條多肽鏈。，一條多肽鏈?；钚裕夯钚裕捍呋呋疪NA 3RNA 3末端加末端加AMPAMP。用途：用途：在在RNA 3RNA 3末端加末端加Poly(A)Poly(A)，以合成，以合成cDNA(GethincDNA(Gethin等等.1980).1980)。用用3232P

46、ATPPATP標(biāo)記標(biāo)記RNA 3RNA 3末端。末端。3 3、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶、鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶(Guanylytransferase(Guanylytransferase) )來源：來源：牛痘病毒。牛痘病毒?；钚裕夯钚裕捍呋呋疓TPGTP轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移GMPGMP至至55PPPPPPRNARNA的的 55末端。末端。55PPP-RNA + PPP-RNA + GTP GTP 或或55PPRNAPPRNA。ppippiG G55PPPPPP55NRNANRNA用途：用途： 體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄RNARNA產(chǎn)物加帽。產(chǎn)物加帽。磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶和磷酸酶 磷酸激酶和磷酸酶分別催化核酸磷酸激酶和磷酸酶分別催化

47、核酸 5-OH 5-OH 加加 P P 和去除和去除 5- P 5- P ： 5p A T T A G C 5p A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C p 5 G G C p 5PNKasePMase 5HO A T T A G C 5HO A T T A G C C C G C C G T A A T C G T A A T C G G G C OH 5 G G C OH 5多核苷酸激酶多核苷酸激酶磷酸甲酯酶磷酸甲酯酶Phosphomonoesterase 應(yīng)用：應(yīng)用： 標(biāo)記標(biāo)記 5-5-末端。末端。 基因重組中，酶切后先

48、去掉基因重組中，酶切后先去掉5P5P，以防止自身重組，以防止自身重組( (連接連接) )，以提，以提 高重組效率。高重組效率。 重組前磷酸化。重組前磷酸化。商品酶：商品酶： T T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶T T4 4Polynucleotide kinasePolynucleotide kinase堿性磷酸酶堿性磷酸酶(alkaline phosphatase(alkaline phosphatase) )牛腸堿性磷酸酶牛腸堿性磷酸酶(BAP)(BAP)大腸桿菌磷酸酶大腸桿菌磷酸酶(ClP(ClP) ) -32PATP ATP 5 P OH 3 5 32P OH 33HO P 5 3 H

49、O 32P 5 I II 5 P OH3 5HO OH3 5 P OH 3 3HO P 5 3HO OH5 3HO P 5 磷酸酶磷酸酶(I)與磷酸激酶與磷酸激酶(II)活性活性 磷酸激酶的交換反應(yīng)磷酸激酶的交換反應(yīng)核酸酶核酸酶外切核酸酶外切核酸酶內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶核糖核酸酶核糖核酸酶ds-DNA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): 切口切口, 缺口缺口, 斷口斷口缺口缺口(gap) 切口切口(nick) 斷口斷口(cut)3HO P53HO P5 外切核酸酶外切核酸酶單鏈單鏈 5 35 3和和 3 53 5外切核酸酶。外切核酸酶。外切核酸酶外切核酸酶(exov(exov) ) 。exovexov NMP5 35 3

50、DNA應(yīng)用：應(yīng)用： 基因組基因組DNADNA中內(nèi)含子的位置作圖。中內(nèi)含子的位置作圖。切除通過切除通過Poly(dA-dTPoly(dA-dT) )加尾插入到質(zhì)粒載體中的加尾插入到質(zhì)粒載體中的DNADNA片段。片段。雙鏈雙鏈5 35 3末端外切酶末端外切酶 1. 1. 入入PhagePhage外切核酸酶外切核酸酶( (入入exoexo) ) 降解降解 5-P5-P的核苷酸，不降解的核苷酸，不降解 5-OH5-OH核苷酸。如降解核苷酸。如降解 PNNNNPNNNN, ,不降不降解解 HONNNHONNN55dsDNAP 555533ssDNA應(yīng)用：應(yīng)用： 在雙脫氧測序時，將在雙脫氧測序時，將dsD

51、NAssDNAdsDNAssDNA。 平齊平齊5-5-粘性末端，便于末端轉(zhuǎn)移酶加尾。粘性末端，便于末端轉(zhuǎn)移酶加尾。2. T2. T7 7 基因基因6 6外切核酸酶外切核酸酶應(yīng)用：應(yīng)用： 降解降解5-P DNA5-P DNA末端，也可降解末端，也可降解5-OH5-OH末端末端, ,與其它酶一起使與其它酶一起使DNADNA鏈鏈變短。變短。雙鏈雙鏈3535外切酶外切酶外切核酸酶外切核酸酶(exo(exo)55333355exoexo5555 NMP32pNTPKlenow放射性探針放射性探針應(yīng)用：應(yīng)用： 制備鏈特異性探針。制備鏈特異性探針。制備制備SSDNASSDNA用于雙脫氧測序做為模板。用于雙脫

52、氧測序做為模板。內(nèi)切核酸酶內(nèi)切核酸酶Bal 核酸酶核酸酶 同時具有內(nèi)切酶活性的外切酶，也可降解同時具有內(nèi)切酶活性的外切酶，也可降解RNA。既具有單鏈特異性，同時具有。既具有單鏈特異性，同時具有 雙鏈特異性。雙鏈特異性。Bal31 活性需活性需Ca2+，也需，也需Mg2+，反應(yīng)液中加入，反應(yīng)液中加入EDTA，便可終止，便可終止Ca2+ 活活性，而不改變性，而不改變Mg2+ 濃度，所以在終止?jié)舛龋栽诮K止Bal31下不影響限制性酶活性。下不影響限制性酶活性。EDTA55 dNMP 或或 rNMPa.ssDNA 或或 RNA55EDTA5533335555333355b.已知已知 DNA 或或 R

53、NAc.水解水解 dsDNA 末端末端EDTAS1 核酸酶核酸酶對對 SSDNA SSDNA 有高度特異性。有高度特異性。S1綠豆核酸酶與綠豆核酸酶與S1S1類似類似ExoIIIS1S1S1S1S1S1Poly(A)Poly(A)555555核酸酶核酸酶S1活性活性 5PP53HOOH3核酸酶核酸酶Bal31的活性的活性DNaseDNase 1 1、來源：、來源： 牛胰牛胰2 2、結(jié)構(gòu)：、結(jié)構(gòu)： MW=37KD MW=37KD 為為- -糖蛋白糖蛋白3 3、活性：、活性：水解位點：優(yōu)先水解嘧啶水解位點：優(yōu)先水解嘧啶5P5P與一個核苷核與一個核苷核的磷酸二酯鍵位點。的磷酸二酯鍵位點。A A P

54、P G G P P C C P P T T P P C C P P G G P P T T P P A A OHOH MgMg2+2+存在下，隨機切割存在下，隨機切割DNADNA雙鏈中的任一條。雙鏈中的任一條。MnMn2+2+存在時，切割雙鏈。存在時，切割雙鏈。無無RNaseRNase活性的活性的DNaseDNase處理：處理：DNase/0.1molDNase/0.1mol碘乙酸，碘乙酸，0.15mol0.15mol乙酸鈉乙酸鈉(pH5.3)55(pH5.3)55加熱加熱40min40min，+1molCaCl+1molCaCl2 2至至5mmol5mmol。4 4、用途：、用途： 切口平移

55、時切口產(chǎn)生。切口平移時切口產(chǎn)生。裂解雙鏈裂解雙鏈DNA(MnDNA(Mn2+2+）。）。 Mn+存在時存在時 Mg+存在時存在時 DNaseI作用特點作用特點DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI與與Pol I 的的切口移位切口移位Pol I核糖核酸酶核糖核酸酶RNaseARNaseA 1 1、來源：、來源： 牛胰牛胰2 2、活性：、活性： RNARNA內(nèi)切酶內(nèi)切酶 無無DNaseDNase的的RnaseRnase處理：處理：用用TE(Tris-HClTE(Tris-HCl) )溶解后溶解后(1mg/ml)(1mg/ml)煮沸煮沸10-30min10-30min，分小份存，分小份

56、存2020。3 3、應(yīng)用：、應(yīng)用：A p U p G p C p G p A p U p C抑制：抑制：人類胚胎特異性抑制劑人類胚胎特異性抑制劑 Rnasin，釩氧核苷酸復(fù)合物。用蛋白，釩氧核苷酸復(fù)合物。用蛋白酶處理可除去酶處理可除去RNaseA。 在制備在制備DNADNA中除去中除去RNARNA。 RNA RNA測序。測序。 除去除去DNA-RNADNA-RNA雜交鏈中的雜交鏈中的RNARNA。RNaseRNase H H來源：來源：E.coliE.coli活性：活性： RNA RNA 內(nèi)切酶降解內(nèi)切酶降解 RNA-DNA RNA-DNA 雜交鏈中的雜交鏈中的 RNA RNA 鏈。鏈。應(yīng)用：

57、應(yīng)用：降解降解RNA-DNARNA-DNA中的中的mRNAmRNA，利于，利于cDNAcDNA第二鏈合成。第二鏈合成。RAaseRAase T T1 1來源：來源： 米曲霉米曲霉活性：活性： 內(nèi)切酶，特異降解內(nèi)切酶，特異降解G G殘基后的殘基后的- -磷酸二酯鍵。磷酸二酯鍵。應(yīng)用：應(yīng)用： RNA RNA 測序測序A p U p G p C p C p U p A 中間產(chǎn)物無環(huán)化的單核苷酸。中間產(chǎn)物無環(huán)化的單核苷酸。連接酶連接酶T T4 4DNADNA連接酶連接酶 連接連接DNADNA末端，可連接平齊末端，所需酶是粘性末端連接的末端，可連接平齊末端，所需酶是粘性末端連接的10-10010-100

58、倍。倍。酶活單位用酶活單位用WeissWeiss1Weiss1Weiss單位單位=60=60個粘性末端單位個粘性末端單位E.coliE.coli連接酶連接酶活性：活性： 與與 T T4 4DNA DNA 連接酶同，但不連接平齊末端。在非平端連接時，連接酶同，但不連接平齊末端。在非平端連接時，可代替可代替 T T4 4DNALigase DNALigase 。酶活單位用酶活單位用Modrich-lehmanModrich-lehman1Modrich-lehman=61Modrich-lehman=6個個WeissWeissRNA RNA 連接酶連接酶T T4 4RNA RNA 連接酶連接酶活性

59、：活性： 在在ATPATP存在下，可催化單鏈存在下，可催化單鏈DNADNA或或RNARNA連接。連接。應(yīng)用：應(yīng)用： RNA3 RNA3末端放射性標(biāo)記。末端放射性標(biāo)記。 增加增加 T T4 4DNA ligaseDNA ligase 的平端連接活性。的平端連接活性。練練 習(xí)習(xí) 題題1. 一種一種DNA分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果：分子經(jīng)三種限制酶完全酶切后得如下結(jié)果： EcoRI 5kb EcoRI/HindIII 1、2、3、4kb HindIII 3kb 、7kb EcoRI/PstI 2、3、5kb PstI 10kb HindIII/PstI 1、3、6kb 將各限制酶位點繪制在

60、將各限制酶位點繪制在DNA分子上。分子上。 2. 另一另一DNA分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點標(biāo)在分子經(jīng)相同處理后得如下結(jié)果，將各限制酶位點標(biāo)在DNA分子上。分子上。 EcoRI 1、3、6kb EcoRI/HindIII 1、3kb HindIII 4、6kb EcoRI/PstI 1、3、5kb PstI 2、8kb HindIII/PstI 2、6kb 3.下圖中的一段下圖中的一段DNA分子上有兩個限制酶分子上有兩個限制酶PstI和和EcoRI識別位點，兩位點相距識別位點，兩位點相距10bp，現(xiàn)有一研究生要分析，現(xiàn)有一研究生要分析EcoRI右側(cè)右側(cè)500bp區(qū)域內(nèi)的功能，他需