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文檔簡介

1、 蘆筍類黃酮對巨噬細胞的影響朱立華,肖新燕, 許玉剛, 孫秀芬(聊城市第二人民醫(yī)院,山東臨清 252600)摘要 目的:探討蘆筍類黃酮對LPS激活巨噬細胞的影響,探討其作用機制。方法:蘆筍類黃酮以400µg/mL、200µg/mL、100µg/mL濃度處理脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬細胞,用Griess法、Elisa法測定培養(yǎng)液上清中NO的含量及IL-6的含量。結(jié)果:蘆筍類黃酮400µg/mL可顯著降低NO的生成量,100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL均可顯著降低IL-6的含量,并呈現(xiàn)劑量含量相

2、關(guān)性。結(jié)論:蘆筍類黃酮可能通過抑制NF-B信號通路,從而降低LPS激活巨噬細胞NO及IL-6的生成量。關(guān)鍵詞:蘆筍; 巨噬細胞; NF-B信號通路中圖分類號:R284.1文獻標識碼:A文章編號蘆筍(Asparagus Officnalis Linne)學(xué)名石刁柏,又名龍須菜,屬百合科(Liliaceae)植物,含有豐富的黃酮類化合物蘆丁(Rutin)。類黃酮是藥用植物中的主要活性物質(zhì)之一。植物類黃酮類物質(zhì)抗炎癥機制的研究主要集中在抑制花生代謝途徑中炎性介質(zhì)的釋放以及抑制MAPK信號通路產(chǎn)生炎性細胞因子兩個方面1。LPS可以激活巨噬細胞NF-B,增加炎性細胞因子的釋放2-3,本實驗通過蘆筍類黃酮

3、提取物作用于被LPS激活的巨噬細胞,通過檢測對NO和IL-6的影響,初步探討蘆筍類黃酮的抗炎癥機理。1材料與方法1.1實驗材料1.2儀器和試劑Griess試劑(A+B) ;DMSO (二甲基亞砜) ,Sigma 美國;蘆筍類黃酮,索氏提取法提取;IL-6 試劑盒,晶美生物工程(北京)有限公司;細菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS) ,北京夏斯生物公司;生物凈化工作臺 (AIR TECH) ,蘇凈集團安泰公司;倒置生物顯微鏡,OLYMPUS,Japan ;CO2培養(yǎng)箱,SANYO Electric Co.Ltd ;96 孔板,Orange Scientific ;微型旋渦混

4、合儀xw-80A,上海滬西分析儀器廠; HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋,江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠;BX-51 顯微鏡, OLYMPUS,Japan ; 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;血球計數(shù)板XB-K-25, 國營上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠; 立式冷藏柜Electrolux,韓國LG公司; 電子天平FA1604S,上海天平儀器廠; 酶標儀BIO-RAD Model550,BIO-RAD,Japan。1.3實驗方法 標準曲線的繪制 將亞硝酸鈉(NaNO2)分別配成0、5、10、20、40、80(µmol/l)的濃度梯度,取100µL加入50µL的Griess試劑,反

5、應(yīng)10min,490nm測光吸收值,求標準曲線及公式。 硝酸鹽(NO)的測定4NO為一種自由基性質(zhì)的不穩(wěn)定氣體,在體內(nèi)、外均能很快生成亞硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-),故采用Griess法測定培養(yǎng)上清中的硝酸根和亞硝酸根作為衡量NO的指標。1.3.3 細胞培養(yǎng)及分組:將對數(shù)期巨噬細胞用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整至 1×106 /L濃度接種于96孔培養(yǎng)板,每孔100 L, 37, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時后,扣掉培養(yǎng)液,向各孔加入新鮮培養(yǎng)液120µL,然后加入120µL含索氏提取物的培養(yǎng)液使終濃度分別分別為400、200、100µg

6、/mL,LPS終濃度5µg/mL,并設(shè)終濃度為5µg/mL LPS組,以及5µg/mL LPSDMSO、空白組作為對照,除空白組外各組DMSO濃度保持一致為0.4%。37,50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時,取上清備用,20保存。1.3.4 細胞因子測定ELISA檢測IL-6:每孔加IL-6標準品/樣品100L,密封,37孵育1h,加100L生物素化的抗體,密封,37孵育1h,洗板5次,加100L鏈酶親和素化的HRP溶液,密封,37孵育0.5h,洗板5次,加100L TMB底物溶液,37孵育20min,加100L終止液,終止反應(yīng),450nm測定光吸收。 數(shù)

7、據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS12.0、Microsoft Office Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1制標準工作曲線以亞硝酸鈉(NaNO2)mol/mL為橫坐標,以吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線,對所做的數(shù)據(jù)進行回歸分析,得回歸方程為y0.0064x0.0041,相關(guān)系數(shù)R20.999,如圖 1。圖1 光吸收值標準工作曲線 2.3蘆筍類黃酮巨噬細胞NO的影響統(tǒng)計表明:空白組與LPS組相比差異顯著(P<0.05),LPS組和 LPS+DMSO與 400 µg/mL相比差異都顯著(P<0.05)。見圖2圖2 蘆筍類黃酮對巨噬細胞NO的影響2.4

8、蘆筍乙醇提取物對巨噬細胞IL-6含量的影響LpsDMSO與各濃度處理組相比均可顯著降低IL-6含量(P<0.05)。見圖3圖3 蘆筍提取物對巨噬細胞IL-6含量的影響3討論已有研究成果表明LPS可以激活巨噬細胞NF-B,增加炎性細胞因子的釋放,類黃酮可以抑制此通路,降低炎性細胞因子iNOS、NO、IL-6、TNF-的釋放5-8,iNOS是比較重要的炎性細胞因子,而一氧化氮(NO)含量可以間接的表明iNOS的含量。有研究發(fā)現(xiàn),蘆筍對細胞免疫系統(tǒng)功能有較強影響。本實驗選取RAW264.7作為研究對象,巨噬細胞在吞噬和刺激時活化,釋放NO自由基,作為外來入侵微生物和腫瘤細胞的毒性因子。但NO作

9、為自由基還會損傷正常細胞,在炎癥生成方面起到重要作用。iNOS和IL-6以及TNF-具有相同的啟動子,所以NO的含量的變化趨勢可能間接的反映出IL-6、TNF-的變化趨勢。實驗結(jié)果顯示:蘆筍類黃酮400µg/mL可以顯著降低由LPS誘導(dǎo)的NO含量的增加,蘆筍類黃酮對巨噬細胞的實驗中400µg/mL及以上濃度可顯著降低NO含量的增加,而對于IL-6各實驗濃度都可顯著降低其濃度。這說明蘆筍類黃酮可顯著降低由LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞NO含量、IL-6含量的增加,即可以抑制巨噬細胞釋放炎性細胞因子iNOS、IL-6。炎性細胞因子中IL-6、IL-1beta、IL-8、TNF-等均在轉(zhuǎn)錄

10、水平上為NF-B/Rel所控制,核因子-B(NF-B)是調(diào)控炎癥細胞因子基因表達的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一,在創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。本實驗中蘆筍類黃酮可同時降低LPS激活巨噬細胞NO及IL-6的生成量與實驗報道一致,其可能的作用機制是抑制NF-B信號通路。參考文獻:1 Hyun Pyo Kim, Kun Ho Son,Hyeun Wook Chang, etal. Anti-inflammatory Plant Flavonoids and Cellular Action MechanismsJ. J Pharmacol, 2004, Sci96: 229-245.2 Wadswor

11、th TL, Koop DR. Effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) and quercetin on lipopolysaccharide-induced release of nitric oxide. Chem Biol Interact. 2001, 137: 43-58.3 Chung CP, Park JB, Bae KW. Pharmacological effects omethanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis an its flavonoids on

12、human gingival fibroblast. Planta Med 1995, 61: 150-153.4 張均田主編. 現(xiàn)代藥理實驗方法M,下冊. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社. 1998, 2121-38.5 Shen SC, Lee WR, Lin HY, Huang HC, Ko CH, Yang LL, et al.In vitro and in vivo inhibitory activities of rutin, wogonin, and quercetin on lipopolysaccharide- induced nitric oxide and

13、 prostaglandin E2 production. Eur J Pharmacol. 2002, 446: 187-194.6 Higa S, Hirano T, Kotani M, Matsumoto M, Fujita A, Suemura M, et al. Fisetin, a flavonol, inhibits TH2-type cytokine production by activated human basophils. J Allergy Clin Immunol.2003, 111: 12991306.7 Chang CJ, Geahlen RL. Protein

14、-tyrosine kinase inhibition: mechanism-based discovery of antitumor agents. J Nat Prod.1992, 55: 15291590.The research of influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophageZhu Li-hua, Xiao Xin-yan ,Xu Yu-gang ,Sun Xiu-fen(The Second Peoples Hospital of LiaoCheng LinQing LiaoC

15、heng 252600)Abstract Objective:To study the influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophage and approach its mechanism of action.Methods: 400µg/mL, 200µg/mL, and 100µg/mL extractions effects on LPS stimulated macrophage RAW264.7 with Asparagus Officinalis ex

16、traction, Griess method and Elisa method are used in the determination of NO release and content of IL-6 in LPS stimulated macrophage RAW264.7.Results: the extraction process in 400µg/mL can reduce NO release notability, and 100µg/mL、200µg/mL、400 µg/mL can reduce content of IL-6 notability in

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