蘆筍類黃酮對巨噬細(xì)胞的影響

1、 蘆筍類黃酮對巨噬細(xì)胞的影響朱立華，肖新燕, 許玉剛, 孫秀芬(聊城市第二人民醫(yī)院，山東臨清 252600)摘要 目的:探討蘆筍類黃酮對LPS激活巨噬細(xì)胞的影響,探討其作用機(jī)制。方法：蘆筍類黃酮以400µg/mL、200µg/mL、100µg/mL濃度處理脂多糖(LPS)激活的RAW264.7巨噬細(xì)胞,用Griess法、Elisa法測定培養(yǎng)液上清中NO的含量及IL-6的含量。結(jié)果：蘆筍類黃酮400µg/mL可顯著降低NO的生成量，100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL均可顯著降低IL-6的含量，并呈現(xiàn)劑量含量相

2、關(guān)性。結(jié)論:蘆筍類黃酮可能通過抑制NF-B信號通路,從而降低LPS激活巨噬細(xì)胞NO及IL-6的生成量。關(guān)鍵詞:蘆筍； 巨噬細(xì)胞； NF-B信號通路中圖分類號：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號蘆筍(Asparagus Officnalis Linne)學(xué)名石刁柏，又名龍須菜，屬百合科(Liliaceae)植物，含有豐富的黃酮類化合物蘆丁(Rutin)。類黃酮是藥用植物中的主要活性物質(zhì)之一。植物類黃酮類物質(zhì)抗炎癥機(jī)制的研究主要集中在抑制花生代謝途徑中炎性介質(zhì)的釋放以及抑制MAPK信號通路產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子兩個(gè)方面1。LPS可以激活巨噬細(xì)胞NF-B，增加炎性細(xì)胞因子的釋放2-3，本實(shí)驗(yàn)通過蘆筍類黃酮

3、提取物作用于被LPS激活的巨噬細(xì)胞,通過檢測對NO和IL-6的影響,初步探討蘆筍類黃酮的抗炎癥機(jī)理。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.2儀器和試劑Griess試劑(A+B) ；DMSO (二甲基亞砜) ，Sigma 美國；蘆筍類黃酮，索氏提取法提?。籌L-6 試劑盒，晶美生物工程(北京)有限公司；細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharides LPS) ，北京夏斯生物公司；生物凈化工作臺 (AIR TECH) ，蘇凈集團(tuán)安泰公司；倒置生物顯微鏡，OLYMPUS，Japan ；CO2培養(yǎng)箱，SANYO Electric Co.Ltd ；96 孔板，Orange Scientific ；微型旋渦混

4、合儀xw-80A，上海滬西分析儀器廠； HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；BX-51 顯微鏡， OLYMPUS，Japan ； 立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；血球計(jì)數(shù)板XB-K-25， 國營上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠； 立式冷藏柜Electrolux，韓國LG公司； 電子天平FA1604S，上海天平儀器廠； 酶標(biāo)儀BIO-RAD Model550，BIO-RAD，Japan。1.3實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將亞硝酸鈉(NaNO2)分別配成0、5、10、20、40、80(µmol/l)的濃度梯度,取100µL加入50µL的Griess試劑，反

5、應(yīng)10min，490nm測光吸收值，求標(biāo)準(zhǔn)曲線及公式。 硝酸鹽(NO)的測定4NO為一種自由基性質(zhì)的不穩(wěn)定氣體，在體內(nèi)、外均能很快生成亞硝酸基(NO2-)和硝酸基(NO3-)，故采用Griess法測定培養(yǎng)上清中的硝酸根和亞硝酸根作為衡量NO的指標(biāo)。1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：將對數(shù)期巨噬細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整至 1×106 /L濃度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 L, 37, 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，扣掉培養(yǎng)液，向各孔加入新鮮培養(yǎng)液120µL，然后加入120µL含索氏提取物的培養(yǎng)液使終濃度分別分別為400、200、100µg

6、/mL，LPS終濃度5µg/mL，并設(shè)終濃度為5µg/mL LPS組，以及5µg/mL LPSDMSO、空白組作為對照，除空白組外各組DMSO濃度保持一致為0.4%。37，50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，取上清備用，20保存。1.3.4 細(xì)胞因子測定ELISA檢測IL-6：每孔加IL-6標(biāo)準(zhǔn)品/樣品100L，密封，37孵育1h，加100L生物素化的抗體，密封，37孵育1h，洗板5次，加100L鏈酶親和素化的HRP溶液，密封，37孵育0.5h，洗板5次，加100L TMB底物溶液，37孵育20min，加100L終止液，終止反應(yīng)，450nm測定光吸收。 數(shù)

7、據(jù)處理數(shù)據(jù)采用SPSS12.0、Microsoft Office Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線以亞硝酸鈉(NaNO2)mol/mL為橫坐標(biāo)，以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對所做的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程為y0.0064x0.0041，相關(guān)系數(shù)R20.999，如圖 1。圖1 光吸收值標(biāo)準(zhǔn)工作曲線 2.3蘆筍類黃酮巨噬細(xì)胞NO的影響統(tǒng)計(jì)表明：空白組與LPS組相比差異顯著(P<0.05)，LPS組和 LPS+DMSO與 400 µg/mL相比差異都顯著(P<0.05)。見圖2圖2 蘆筍類黃酮對巨噬細(xì)胞NO的影響2.4

8、蘆筍乙醇提取物對巨噬細(xì)胞IL-6含量的影響LpsDMSO與各濃度處理組相比均可顯著降低IL-6含量(P<0.05)。見圖3圖3 蘆筍提取物對巨噬細(xì)胞IL-6含量的影響3討論已有研究成果表明LPS可以激活巨噬細(xì)胞NF-B，增加炎性細(xì)胞因子的釋放，類黃酮可以抑制此通路，降低炎性細(xì)胞因子iNOS、NO、IL-6、TNF-的釋放5-8，iNOS是比較重要的炎性細(xì)胞因子，而一氧化氮(NO)含量可以間接的表明iNOS的含量。有研究發(fā)現(xiàn)，蘆筍對細(xì)胞免疫系統(tǒng)功能有較強(qiáng)影響。本實(shí)驗(yàn)選取RAW264.7作為研究對象，巨噬細(xì)胞在吞噬和刺激時(shí)活化，釋放NO自由基，作為外來入侵微生物和腫瘤細(xì)胞的毒性因子。但NO作

9、為自由基還會損傷正常細(xì)胞，在炎癥生成方面起到重要作用。iNOS和IL-6以及TNF-具有相同的啟動子，所以NO的含量的變化趨勢可能間接的反映出IL-6、TNF-的變化趨勢。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：蘆筍類黃酮400µg/mL可以顯著降低由LPS誘導(dǎo)的NO含量的增加，蘆筍類黃酮對巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中400µg/mL及以上濃度可顯著降低NO含量的增加，而對于IL-6各實(shí)驗(yàn)濃度都可顯著降低其濃度。這說明蘆筍類黃酮可顯著降低由LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO含量、IL-6含量的增加，即可以抑制巨噬細(xì)胞釋放炎性細(xì)胞因子iNOS、IL-6。炎性細(xì)胞因子中IL-6、IL-1beta、IL-8、TNF-等均在轉(zhuǎn)錄

10、水平上為NF-B/Rel所控制，核因子-B(NF-B)是調(diào)控炎癥細(xì)胞因子基因表達(dá)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子之一，在創(chuàng)傷后的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。本實(shí)驗(yàn)中蘆筍類黃酮可同時(shí)降低LPS激活巨噬細(xì)胞NO及IL-6的生成量與實(shí)驗(yàn)報(bào)道一致，其可能的作用機(jī)制是抑制NF-B信號通路。參考文獻(xiàn)：1 Hyun Pyo Kim, Kun Ho Son，Hyeun Wook Chang, etal. Anti-inflammatory Plant Flavonoids and Cellular Action MechanismsJ. J Pharmacol, 2004, Sci96: 229-245.2 Wadswor

11、th TL, Koop DR. Effects of Ginkgo biloba extract (EGb 761) and quercetin on lipopolysaccharide-induced release of nitric oxide. Chem Biol Interact. 2001, 137: 43-58.3 Chung CP, Park JB, Bae KW. Pharmacological effects omethanolic extract from the root of Scutellaria baicalensis an its flavonoids on

12、human gingival fibroblast. Planta Med 1995, 61: 150-153.4 張均田主編. 現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法M,下冊. 北京: 北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社. 1998, 2121-38.5 Shen SC, Lee WR, Lin HY, Huang HC, Ko CH, Yang LL, et al.In vitro and in vivo inhibitory activities of rutin, wogonin, and quercetin on lipopolysaccharide- induced nitric oxide and

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14、-tyrosine kinase inhibition: mechanism-based discovery of antitumor agents. J Nat Prod.1992, 55: 15291590.The research of influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophageZhu Li-hua, Xiao Xin-yan ,Xu Yu-gang ,Sun Xiu-fen(The Second Peoples Hospital of LiaoCheng LinQing LiaoC

15、heng 252600)Abstract Objective:To study the influence of Asparagus Officinalis extraction to LPS stimulated macrophage and approach its mechanism of action.Methods: 400µg/mL, 200µg/mL, and 100µg/mL extractions effects on LPS stimulated macrophage RAW264.7 with Asparagus Officinalis ex

16、traction, Griess method and Elisa method are used in the determination of NO release and content of IL-6 in LPS stimulated macrophage RAW264.7.Results: the extraction process in 400µg/mL can reduce NO release notability, and 100µg/mL、200µg/mL、400 µg/mL can reduce content of IL-6 notability in