錳對人臍靜脈內(nèi)皮細胞及半胱天冬酶表達影響

1、錳對人臍靜脈內(nèi)皮細胞及半胱天冬酶表達影響    【關鍵詞】  錳;人臍靜脈內(nèi)皮細胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)摘要： 目的   探討錳對人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC-304細胞生長周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表達的影響。方法   以100800moml/L)的氯化錳分別處理HUVEC-304細胞2472h后，四甲基偶氮噻唑藍(MTT)法檢測EVC-304細胞的生長活性；流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡情況；蛋白印跡法（

2、Western blot）檢測HUVEC-304細胞在，氯化錳半數(shù)抑制濃度(IC50)400mol/L作用24h時caspase8、caspase3的表達。結(jié)果   氯化錳可呈時間及劑量依賴性抑制HUVEC-304細胞的增殖和誘導細胞凋亡,抑制率為2234%9094%，凋亡率為1020%9873%。氯化錳24hIC50約為400mol/L，在此濃度下，HUVEC-304細胞caspase8、caspase3表達顯著增高,(P<005)。結(jié)論   氯化錳能夠抑制HUVEC-304細胞的增殖，呈明顯的時效和量效關系。caspase8、caspase3表

3、達增高在細胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用機制之一。關鍵詞： 錳;人臍靜脈內(nèi)皮細胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)Effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and expression of caspase   Abstract： Objective   To investigate the effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and the expression of caspase8、

4、caspase3.Methods   HUVEC304 cells were given with various concentrations of MnCl2.The inhibitory ratio was measured by MTT assay.Apoptosis was observed by flow cytometry(FCM).The expression of caspase3 and caspase8 was measured by Western blot.Results   MTT results revealed that

5、manganese chloride (from 100 to 800mol/L) might suppress the proliferation of HUVEC-304 cells(inhibitory ratio were 22.34%90.94%) and induce apoptosis (apoptosis ratio were 10.20%98.73%) in dose and time-dependent manner.The result of Western Blot showed that manganese inhibited caspase3 and caspase

6、8 expression (P<0.05).Conclusion   Manganese can inhibit proliferation of HUVEC-304 cells with time-and dose-dependent manner.These may be one of important mechanisms that manganese suppressed the proliferation of HUVEC-304 cells and induced apoptosis.Key words： manganese;HUVEC-304 cell

7、s;apoptosis ;caspase3;caspase8      錳可以通過誘導細胞產(chǎn)生不配對的電子自由基形成大量的過氧化物及影響細胞能量代謝等途徑誘導細胞凋亡而發(fā)揮毒性作用1,2,但對細胞凋亡相關基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白產(chǎn)物的影響研究較少。本研究通過體外試驗，觀察錳對人臍靜脈內(nèi)皮細胞系HUVEC-304細胞生長及caspase8、caspase3表達的影響，探討錳誘導細胞凋亡分子機制。1   材料與方法11   主要試劑及抗體 

8、0; 氯化錳(天津博迪化工有限公司)，分子量1977,純度>99%,溶解于二甲基亞砜（DMSO），分裝備用。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；胎牛血清025%的胰酶(中山凌飛公司)；四甲基偶氮噻唑藍(MTT,美國Sigma公司)。caspase3、caspase8一抗為鼠抗人，二抗為羊抗鼠(美國晶美生物工程有限公司)。12   方法   121   細胞和細胞培養(yǎng)   HUVEC-304細胞株(武漢大學細胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及鏈霉素100mg/ml的RPMI

9、-1640培養(yǎng)基中37、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期、生長良好、細胞活性大于98%的細胞進行實驗。122   細胞生長活性檢測   采用MTT比色法，取對數(shù)生長期的HUVEC304細胞進行實驗，將不同濃度的氯化錳100800mol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，調(diào)細胞濃度為5×105/ml，接種于96孔，每種劑量濃度為一組，每個濃度3個平行孔，置37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時間（24，48，72h）后，每孔加20lMTT，培養(yǎng)4h，棄MTT，每孔加DMSO 150l，充分溶解。選擇490nm波長，酶聯(lián)

10、免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304細胞的生長抑制率=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。123   流式細胞儀檢測細胞凋亡   用熒光素標記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）雙標流式細胞儀檢測細胞凋亡，分為不同濃度實驗組及對照組。分別加入終濃度為100800mol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4固定2h，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗3次，離心去上清。用結(jié)合緩沖液37孵育60min，195l細胞懸液加5l Annexin-V-FITC，混勻，室溫10min。用緩沖液洗滌細胞1次

11、，在190l結(jié)合緩沖液中重懸，然后再加10l20g/mlPI，流式細胞儀檢測。124   細胞蛋白質(zhì)樣品制備及蛋白定量   經(jīng)處理后的細胞立即棄去培養(yǎng)液,洗滌,離心,加預冷的細胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,0001mol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,100g/ml蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF),2g/mL，亮肽素(Leupeptin) 01ml,裂解30min,然后于10000g離心10min,取上清備用。以上所有操作均在4下進行。測定蛋白,并調(diào)各組蛋白濃度一致。125   蛋白印跡

12、法(WesternBlot)   Western Blot方法檢測caspase3、caspase8,X線曝光顯影,軟件進行掃描定量,每個濃度組重復3次,取均值代表測定結(jié)果。13   統(tǒng)計分析   應用SPSS110統(tǒng)計軟件進行t檢驗、單因素方差分析(ANOVA)。百事通 2   結(jié)果21   錳對HUVEC-304細胞增殖的影響   錳對HUVEC-304細胞生長呈時間劑量依賴性,錳染毒培養(yǎng)24，48，78h后，HUVEC-304細胞生長抑制率分別為100mol/L(223

13、4±822)%，(2747±851)%，(3807±986)%；200mol/L(3362±969)%，(4256±095)%，(5935±236)%；400mol/L(5503±620)%，(6212±195)%，(6960±377)%；800mol/L(7606±151)%，(8129±154)%，(9094±128)%，各組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<001),24hIC50為400mol/L。22   錳誘導HUVEC-304細胞凋亡情況(表1

14、)   錳對HUVEC-304細胞凋亡具有誘導作用,濃度為100mol/L MnCl2培養(yǎng)HUVEC-304細胞24h,即可引起細胞明顯凋亡,并隨氯化錳劑量的增加呈劑量-反應關系。表1   不同濃度氯化錳誘導HUVEC-304細胞的凋亡率（略）注：與對照比較，* P001；n=323   錳對HUVEC-304細胞caspase3、caspase8表達的影響   Western blot蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示,濃度為400mol/L氯化錳染毒培養(yǎng)HUVEC-30細胞24h后，caspase8和caspase3表達均

15、明顯升高,A值分別為(48803±216)，(47631±205),與對照組比較(9013±161)，差異有統(tǒng)計學意義(P<001)。3   討論caspase活性的變化是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)機制。研究表明caspase是一切凋亡信號傳導的共同通路3，4。其中caspase8是死亡受體途徑中最重要的啟始因子之一,該酶啟動后可以直接激活效應caspase的級聯(lián)反應,誘導caspase3、caspase6的活化,還可以作用于Bid(Bcl-2家族促凋亡成員),被剪切后的Bid轉(zhuǎn)位至線粒體內(nèi),誘導線粒體膜電位的喪失和細胞色素C的釋放,后者與凋亡蛋

16、白酶激活因子-1Apaf-1(apoptosis associated factor-1)和caspase9形成凋亡小體,啟動下游caspase效應酶的激活,最終誘導細胞凋亡5。有研究表明，錳可通過改變相關基因的調(diào)控及表達誘導細胞凋亡6。本實驗結(jié)果顯示，氯化錳對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖具有明顯的抑制作用,并能誘導調(diào)亡呈明顯的量效和時效的關系。當氯化錳染毒濃度為400mol/L時，HUVEC-304細胞培養(yǎng)24h,其caspase8、caspase3的蛋白水平明顯升高,說明氯化錳可通過上調(diào)細胞caspase8、caspase3基因的表達來誘導其凋亡誘導。由于細胞凋亡受多基因網(wǎng)絡的調(diào)節(jié),因此氯化錳誘導

17、人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的機制尚需深入的研究。參考文獻1   Malecki EA.Manganese toxicity is association in ras primary striatal neuronsJ.Brain Res Bull,2001,55(2):225-228.2   王悅,段春禮,張海燕,等.錳對多巴胺能神經(jīng)元毒性的研究J.神經(jīng)解剖學雜志,2001,17(1):57-61.3   Fujiura S,Suzumiya J,Yamada Y.Downregulation of Bcl-xl and activati

18、on of caspase during retinoic acid-induced apoptosis in an adult T-cell lineJ.Hematol,2003,4(5):328-335.4   Maclachlan TK,Ei-deiry WS.Apoptotic threshold is lowered by p53 transactivation of caspase-6J.PANS,2002,99(14):9492-9497.5   Cowling V,Downward J.Caspase-6 is the direct activator of caspase8 in the cytochrome c-induced apoptosis pathway:abs