蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)

1、蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位及主要連接 形式。2、了解蛋白質(zhì)和某些氨基酸的呈色反應(yīng)原理。3、學(xué)習(xí)幾種常用的鑒定蛋白質(zhì)和氨基酸的方法。 二、呈色反應(yīng)1、雙縮月尿反應(yīng)(1)原理：尿素加熱至180oC左右，生成雙縮月尿并放出一分 子氨。雙縮月尿在堿性條件下能與 Cif結(jié)合生成紫紅 色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮月尿反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中 有肽鍵，其結(jié)構(gòu)與雙縮月尿相似，也能發(fā)生此反應(yīng)(二 肽和氨基酸都不能發(fā)生雙縮股反應(yīng))。可用于蛋白質(zhì) 的定性或定量測(cè)定。反應(yīng)式如下：NH2180 0c+ NH3NH2NH雙縮版紫紅色化合物雙縮版反應(yīng)不僅為含有兩個(gè)以上肽鍵的物

2、質(zhì)所有，含有一個(gè)肽鍵和一個(gè)-CS-NH" -CH2-NH2,-chr-nh2, -ch2-nh2-ch-nh2-ch2-oh 或-chohch2nh2 等基團(tuán)的物質(zhì)以及乙二酰二胺等物質(zhì)也有此反應(yīng)。加3也干擾此反應(yīng)，因?yàn)榧?與CU"可生成暗藍(lán)色的 絡(luò)離子Cu (NH3) 42+o因此，一切蛋白質(zhì)或二肽以上的多肽都有雙縮胭反應(yīng)，但有雙縮胭反應(yīng)的物質(zhì)不 一定都是蛋白質(zhì)或多肽。(2)試劑尿素，10%氫氧化鈉溶液，1%硫酸銅溶液,2%卵清蛋白溶液(改為蛋清溶液：水二1： 9)(3)操作4取少量尿素結(jié)晶，放在干燥試管中。用微火加熱 使尿素熔化。熔化的尿素開始硬化時(shí)，停止加熱， 尿素放出

3、氨，形成雙縮股。冷后，加 10%氧化鈉 溶液約1mL振蕩混勻，再加1喻酸銅溶液1滴， 再振蕩。觀察出現(xiàn)的粉紅顏色。要避免添加過量硫 酸銅.否則，生成的藍(lán)色氫氧化銅能掩蓋粉紅色。（由于雜質(zhì)以及氨氣的干擾，導(dǎo)致顏色不都是紫紅 色）向另一試管加2噴口清蛋白溶液（改為蛋清溶液： 水=1 : 9）約1mL和10%（氧化鈉溶液約2mL搖 勻，再加1%硫酸銅溶液2滴，隨加隨搖。觀察紫玫 瑰色的出現(xiàn)。2、苛三酮反應(yīng)（1）原理蛋白質(zhì)、多肽和各種氨基酸以及所有-氨基酸均 能發(fā)生該反應(yīng)，除無a-氨基的脯氨酸和羥脯氨酸 呈黃色反應(yīng)外，其它均生成藍(lán)紫色化合物，最終生 成藍(lán)色化合物。氨、6-丙氨酸和許多一級(jí)氨化合 物都有

4、此反應(yīng)。尿素、馬尿酸、二酮叱嗪和肽鍵上O的亞氨基不呈現(xiàn)此度應(yīng)。因此，雖不蛋白質(zhì)或氨基 酸均有苗三酉底應(yīng)y向好苗三酮母應(yīng)塞陽性反應(yīng) 的不一定都是蛋白層或城b酸。該皮應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化脫氨形成酮酸，酮酸脫竣成 醛，放出CO、NH,水合苗三酮被還原成還原型苗 三酮；第二步是所形成的還原型苗三酮同另一個(gè)水 合苗三酮分子和氨縮合生成有藍(lán)色物質(zhì)。反應(yīng)機(jī)理如下：還原型荀三酮藍(lán)紫+3H2O該反應(yīng)非常靈敏，1: 150萬濃度的氨基酸水溶液 即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。 但在定性、定量測(cè)定中，一方面要嚴(yán)防干擾物存在， 另一方面要在適宜的 PH條件下進(jìn)行測(cè)定。該反應(yīng) 的適宜的PH為5

5、7,同一濃度的蛋白質(zhì)或氨基酸 在不同pH條件下的顏色深淺不同，酸度過大時(shí)甚 至不顯色。(2)試劑蛋白質(zhì)溶液:29郵清蛋白或新鮮雞蛋清溶液(蛋清：水=1： 9),0.5%甘氨酸，0.1%苗三酮 水溶液，0.1%苗三酮-乙醇溶液。(3)操作取兩支試管分別加入蛋白質(zhì)溶液和甘氨酸溶 液1mL再各加0.5mL0.1%苛三酮水溶液，混勻，在 沸水浴中加熱12分鐘，觀察顏色由粉色變紫色 再變藍(lán)色(pH不同顏色深淺不同)。在一小塊濾紙上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，風(fēng)干 后，再在原處滴一滴 0.1%第三酮-乙醇溶液，在微 火旁烘干顯色，觀察紫紅色斑點(diǎn)的出現(xiàn)。3、黃色反應(yīng) (1)原理含有苯環(huán)的氨基酸，如酪氨酸、色氨

6、酸，遇硝酸 后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中 進(jìn)一步形成深橙色的硝釀酸鈉。反應(yīng)式如下NaOHHO+ HNO3 ho.O-no2nO- Na +硝基酚（黃色）O鄰硝釀酸鈉（橙黃色）多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以呈黃 色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，須加入少量濃硫酸才 有黃色反應(yīng)。試劑雞蛋清溶液（將新鮮雞蛋清用 6層紗布過濾， 然后按雞蛋清：水=1: 20配制而成。大豆提取液：將大豆浸泡充分吸脹后研磨成 漿狀再用紗布過濾。 頭發(fā)。指甲。 0.5%苯 酚溶液。濃硝酸。0.3%色氨酸溶液。0.3%酪 氨酸溶液。10病氧化鈉溶液。（3）操作向7個(gè)試管中分別按下表加入試劑，觀察各管 出現(xiàn)的現(xiàn)

7、象，有的試管反應(yīng)慢可略放置或用微火加 熱。待各管出現(xiàn)黃色后，于室溫下逐滴加入10海 氧化鈉溶液至堿性，觀察顏色變化（14管可能需要加熱)管 號(hào)1234567材 料雞蛋 清溶 液大豆 提取 液指 甲頭 發(fā)0.5%苯酚0.3%色 氨酸0.3%M氨酸濃 硝 酸4滴4滴少 許少 許4滴4滴4滴現(xiàn)象1現(xiàn)象24、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)(1)原理考馬斯亮藍(lán)G250 (R250)具有紅色和藍(lán)色兩種 色調(diào)。在酸性溶液中，其以游離態(tài)存在呈棕紅色； 當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色。它染色靈敏度高，比氨基黑高 3倍。反應(yīng)速度 快，約在2分鐘左右時(shí)間達(dá)到平衡，在室溫一小時(shí) 內(nèi)穩(wěn)定。在0.011.0mg蛋白質(zhì)范圍內(nèi)，蛋白質(zhì) 濃度與A595nm值成正比。所以常用來測(cè)定蛋白質(zhì) 含量。試劑蛋白質(zhì)溶液(雞蛋清：水=1: 20配制而成)c 考馬斯亮藍(lán)溶液：考馬斯亮藍(lán) G50l00mg溶于 50mL95%J享中，加100mL85%!酸混勻，配成原液。 臨用前取原液15mL加蒸個(gè)留水至100mL用粗濾紙