蛋白表達純化實驗步驟#(優(yōu)選.)

1、蛋白表達純化實驗步驟 (待改進 )1 、取適當相應(yīng)蛋白高表達的動物組織提 total-RNA 。2 、設(shè)計蛋白表達引物。引物要去除信號肽,要加上適當?shù)拿盖形稽c和保護堿基。3、RT-PCR,KODI擴增獲取目的基因 c DNA.4、雙酶切,將cDNA.克隆入PET2832等表達載體。5、轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細菌中擴增，提質(zhì)粒。6、將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達菌株,挑菌檢測并保種。表達菌株如Bl21(DE3)、 Rosetta gami(DE3)、Bl21 codon(DE3)等。7、蛋白的誘導表達。1)將表達菌株在3ml LB 培養(yǎng)基中搖至 中搖至 OD=0.6左右加入IPTG濃度梯度從25 dM到 1m

2、M 。 37度誘導過夜(一般3h 以上即有大量表達)。2)SDS-PAG由泳檢測目的蛋白的表達。注：目的蛋白包涵體表達量一般會達到菌體蛋白的 50%以上 ,在膠上可以看到明顯的粗大的條帶。3)將有表達的菌株10%甘油彳種，保存1ml左右就足夠了，并記錄IPTG濃度范圍。甘油是用0.22 m過濾除菌的，儲存濃度一般是 30%-60%,使用時自己計算用量。4)用上述IPTG濃度范圍的最低值誘導10ml表達菌,18度，低轉(zhuǎn)速(140-180rpm),誘導過夜作為包涵體檢測樣品。注意:1.如果表達的蛋白對菌體有毒性，可以在加IPTG之前的培養(yǎng)基中加入1%的葡萄糖用來抑制本底表達。葡萄糖會隨著細菌的繁殖

3、消耗殆盡,不會影響后面的表達。 2.保種可以取一部分分成50一管，每次用一管，避免反復凍融。8 、包涵體檢測。方案見附件29 、如有上清表達,則擴大搖菌。1)取保種的表達菌株先搖10ml,37度,300rpm搖至OD>=1.5約5h左右，視菌種,也可過夜搖菌。2）將上一步中的 8ml 加入 300ml 培養(yǎng)基中 37 度 ,250rpm 搖至 OD= 1.0 左右 （約2.5h3h）,然后力口 IPTG減度同包涵體檢測中使用的濃度。）注:菌液濃度要適當?shù)臐庖恍?否則第二天收集不到足夠的菌體, 因為低溫低轉(zhuǎn)速細菌生長非常緩慢。拿起錐形瓶對光搖動,看到有大量云霧狀菌體即可。另一方法是,將手指

4、放在瓶底晃動,看不清手指為宜,不過此法宜受氣泡影響。3）過夜搖菌 ,使用包涵體檢測的溫度（18°左右 ）,轉(zhuǎn)速 140rpm 左右。4）將菌液6000rpm,4min,4度離心收集菌體。加入 20mM PBS,洗一遍后用平衡緩沖液重懸。每250ml 菌液用 30 ml 到 50ml 平衡緩沖液,視菌液的濃度而定?？捎?4 支 50ml的離心管同時離心,但是 ,離心管要重復使用,用完后洗凈保存。10 、超聲波裂解。1）用6mm變幅桿，35%率35s工作,7s休息,50min即可。注意 :1.要冰浴。2.要隨時觀察裂解情況以防意外。3.要將探頭探入到溶液中下部,盡量不要打出大量氣泡。一般

5、溶液量比較大的時候不會出現(xiàn)大量氣泡。4.正常聲音為:孜孜聲 ,尖銳刺耳的聲音表明探頭位置不對或者功率太大或者探頭松動等原因,要及時調(diào)整。溶液由渾濁變清透, 由粘稠變不粘稠表明裂解完成（后面3000 轉(zhuǎn)離心時 ,如果沉淀少說明裂解的好）。 5.超聲波破碎儀工作30 分 min 要休息 5min（ 即關(guān)閉總電源開關(guān) ）。注意 :1.如果純化的蛋白較易被蛋白酶降解,在超聲裂解之前要加蛋白酶抑制劑（PMSF）,PMSF工作濃度為 1%。 2.如不能判斷是否裂解完全,就按上述條件裂解60 分鐘 ,60 分鐘足夠裂解。11、取得上清1）將破碎好的溶液收集到 50ml 離心管中。 10000rpm,15mi

6、n,4 °離心。沉淀為包涵體、細胞碎片和未破碎的細胞。輕輕的將上清倒出 ,盡量不要倒出沉淀。 （此時可以測量一下pH 值 ,pH 值最好在 7.5 左右。平衡buffer 的 pH 是 7.8 左右 ,裂解后上清就會在7.5 左右。 ）12 、純化上清-摸洗脫條件。1）鎳柱處理。將1ml 鎳柱吸入空層析管中,待其中的液體流完后加入平衡緩沖液3ml 。2）將 10ml 上清加到已經(jīng)平衡過的 NI 柱上 ,并將過柱的樣品重復上樣3 次。（若是流速慢可以在柱子下面加一個針頭，或者用1ml的槍將膠體吹散。）取201過柱后的樣品，以備跑膠。3）分別加20mM 、 40mM 、 60mM 、 8

7、0 mM 的咪唑梯度來洗脫雜蛋白。每個梯度分別的上樣量為 4ml 、 2ml 、 2ml 、 2ml 。每個次上樣的液體分前面1ml 和后面 1ml 分別收集入 EP管中 ,以備跑膠。注意 :理論上是要將收集的溶液測量280nm 處的吸光度,直到吸光度為零時再進行下一個梯度的洗脫。實際上測不到零,怎么都會有一點的,上面說的量已經(jīng)做夠洗脫了。4）加Elution Buffer將目的蛋白洗脫。上樣量為4.5ml（將前面的0.5ml單獨接入EP管,再將后面的4ml接入另外兩個EP管）,留跑膠樣品。5）加MES將NI柱重生。MES力口 10ml,流完后再力口 10ml Miliq H2O。流完后保存于

8、 2倍體積的20%乙醇中,鎳柱至少能重復利用 6次。（尿素可能對NI 柱有損傷。 ）注意 :所有溶液使用前都要確定其pH 是否正確 ,pH 對掛柱及洗脫影響較大。鎳柱所用溶液MES 的 ph=5.0,其余 Equilibration Buffer pH=7.8 , 上清 pH=7.5 ,Wash Buffer pH=7.0 ,Elution Buffer pH=7.2 。13 、跑膠驗證。1）跑2塊0.75mm的PAGE!交,把所有的樣品都加上去，注意兩塊膠的濃分離比要相同兩塊膠才會比較一致。2）跑膠順序:負對照、正對照、上清、過柱樣品、W1 、 W2、 W3、 W4、 W5、 W6、W7 、

9、 W8、 W9、 E1、 E2、 MES3）300V快速壓膠5min左右，160V分離樣品50min左右。（也可以300V,30min,只是圖沒有 160V 好看。 ）4）考馬斯亮藍染色。一般染色2h 即可。5）脫色。先用脫色劑1 脫 15min, 再用脫色劑2 脫過夜。14 、純化上清-收集目的蛋白1）將重生的鎳柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml） 。2）重復步驟12 中的操作,只是wash 時只用步驟 12 中摸好的咪唑濃度洗。15、跑膠驗證。同步驟 13這次膠圖要跑的漂亮一點（用160V）,保存好。16 、透析。1）配制 2L 透析液（配方見附件1）,并放于

10、-20 度冰箱預冷但不要結(jié)冰。2）透析袋 團10cm即可）用透析袋處理液煮沸 10min,用MILIQ H2O充分洗凈。3）用透析夾將透析袋夾?。▽⑼肝龃郫B一下會夾的更牢）,將洗脫的蛋白樣品加入其中，置入提前預冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下輕微磁力攪拌 20min后 置入4°冰箱1.5h 后換液。透析 3 次即可。注意:用廣口瓶裝透析液，將廣口瓶置于裝有冰的2L大燒杯中。冰浴以防活性降低。17、濃縮。1）將透析好的樣品連同透析袋一起放在白色盒子中 , 用預冷的聚乙二醇2000 固體包埋。2）30min 后將吸水后呈漿糊狀的聚乙二醇去除,加入

11、新的固體聚乙二醇。3）每隔 10min 觀察一次,一旦出現(xiàn)渾濁立即停止?jié)饪s。4）透析袋用完后,洗凈 ,保存于20%乙醇中4°存放。注意:濃縮過度后會有白色小顆?；蛐鯛罹w出現(xiàn),由于透析袋使溶液成薄層狀,透明度較高,不易發(fā)現(xiàn)小顆粒或絮狀沉淀,要看仔細。如果看不到 ,可根據(jù)自己估計的蛋白量留 1-2ml 體積。用透析液將透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分裝后-20 度保存。18 、超濾法濃縮、透析蛋白。使用超濾法就可省去16 、 17 兩步。1）將 4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超濾管中。2）配平。3）7400g,30min,4 °離心,結(jié)束時4ml 變?yōu)?

12、1ml 左右。濃縮4 倍?？筛鶕?jù)需要選擇不同的離心時間, 以達到不同的濃縮倍數(shù)。可以幾次的Elution 液一起濃縮。4）加入需要的蛋白儲存液至4ml,離心。重復操作可以使Hution液逐漸換為所需的蛋白儲存液。蛋白儲存液一般用 20mM PBS+*mM NaCl 或適當濃度和 pH 的 tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀達不到預定濃度可以添加適當?shù)母视停?%-5%即可 ）助溶。5）收集。將溶液從超濾管中收集到EP管中,標記好儲存液的成分，蛋白名稱，蛋白濃度 （測量后）,制備日期。注:超濾管的使用方法見附件419 、蛋白濃度測定。見附件320、蛋白活性測試。轉(zhuǎn)染細胞測量熒光。21 、抗原處理

13、。蛋白與弗氏佐劑混合成油包水狀。22、注射兔子。選擇合適的注射方式和合適的免疫程序。23、收集免疫血清。提取抗體。24、抗體效價評定。附件 1所需溶液配方 :1）20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4試劑名稱 NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量 （g）1L 0.5928 5.802192 17.5322）Equilibration Buffer（ 平衡緩沖液）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.43）Wash Bufer（清洗緩沖液）:PBS with 25 mM/50 mM/75

14、 mM 咪口坐 pH 7.44）Elution Buffer（ 洗脫緩沖液）: PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.45）MES（再生緩沖液）:20 mM 2-（N-morpholine）-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodiumchloride; pH 5.0。即 0.3904g MES+0.5844g NaCl.6)透析袋處理液：2%(w/v)碳酸氫鈉和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA7)透析液：20mM PBS+50 mM NaCl(2.92g)試齊1J名稱 NaH2PO4-2H2O Na2HPO4-12H2O NaCl用量(g)1L 0

15、.5928 5.802192 2.92gTIPS:1 4的溶液可以一起配制。先配 10ml 8M的咪陛。再配1L的PBS用500ml水將濃也。2mgm11<1.4 ing/rnl0.8 mg/mlRSA( hug)邳172p 110即1144 尸 IH2OI44p 11。即I72p 136H 1試劑溶解，取兩個50ml和一個150ml分別加到兩個100ml瓶子和一個500ml瓶子中，作為Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer,再向其分別加入適當體積的 8M咪口坐。最后,定容。Wash Buffer、Elution Buffer 各配

16、了 100ml,Equilibration Buffer 配了 300ml。PBS配了 500ml。附件2包涵體檢測1 .搖10ml菌，加0.5%葡萄糖和相應(yīng)抗性。培養(yǎng)至 OD600=0.5后離心加入新的培養(yǎng)基和相應(yīng)濃度的IPTG低溫（16-25度）誘導過夜（也可不離心，在原來LB中直接加IPTGb在離心前取 500“菌液作為負對照，誘導完成后取500微升作為正對照。正負對照不用超聲波裂解，直接煮沸10min跑膠。2 .誘導完成后，用 2ml EP 管 6000rpm,2min,4 度，收集 10ml 菌液。1.5ml PBS （50m MPBS,300m M NaCl 厘懸細菌。3 .裂解細

17、胞。用超聲波破碎細胞直到懸液變清亮，一般15到30min。裂解3s,停止6s,裂解時冰上放置。4 .分離上清。5000rpm,4min,4 °除去未裂解的細菌和大的細菌碎片。然后 ,10000rpm,10min,4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，力口 5微5*SDS loading buffer 混勻，煮沸 10min。5 .重懸包涵體。用1000微PBS震蕩重懸包涵體，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer,煮?1o 10min。6 .正負對照的收集。離心收集正負對照菌體，0.5ml上清留下40 “，加入1

18、0 “5*SDSloadingbuffer, 煮沸 10min 裂解。7 .跑聚丙烯酰胺凝膠。將正負對照及實驗樣品一起跑膠。一般順序是: -,+,上清 ,包涵體 .附件 3蛋白濃度定量測試方案1. 將染色劑稀釋。稀釋5倍，取4ml染色劑于50ml離心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44科m的濾膜過濾于另 50ml 離心管中。（此劑量可測4 個樣品。 ）2. 牛血清白蛋白（BSA標準品的制備1）將凍干的BSA溶于去離子水中，溶解成濃度為1mg/ml,分裝為400-500科l/支（可以室溫放置 60 天 ,-20 度長期保存）。2）將1mg/ml的BSA分別稀釋成 0.2、0

19、.4、0.6、0.8mg/ml,各180科l,另外加一管水為3. 染色。1）取1.5ml已過濾的染色劑分別加入13支（其中4支為待測樣品）1.5mlEP管中。4個梯度各做一個重復，共8支,另外加1個樣品（或1+n個樣品）和1個blank,共10支EP管（或10+n 支）,分別對應(yīng)標記。2）將30科l樣品和30科l標準BSA及30科l H2O分別加入上述 EP管中。渦旋混勻。3）室溫孵育5min到60min 05min后即開始測量，在60min內(nèi)測完，越快越好，因為Absorbance wil increase over time 。4. 吸光度的測量。 600nm 處測量,并記錄吸光度。注意:

20、1. blank 是染色液加30微升的水。2.從低濃度測量到高濃度。根據(jù)混合液的顏色大致判斷sample 的濃度范圍 ,據(jù)此決定 sample的測量順序。5. 比色皿的洗滌。用100% 乙醇浸泡洗滌。6. 標準曲線的制作。利用 excel 工具取標準品的平均值制作線性回歸標準曲線。附件 4.4ml millipore 超濾離心管使用注意事項1. 用前用miliq 水潤濕。2.4 度預冷。3 .離心力不能超過 7500g。加速度設(shè)定為 8.4 .離心時將離心管的兩膜片豎直到與地面垂直的角度后開始離心,以使兩膜所受的壓力一致。5 .使用完畢后，用miliq水洗凈，加入1ml 0.1N NaOH泡2

21、4h,后加入1ml20%乙醇保存。如果要短期保存幾天,也可加水浸泡。附件 5 聚丙烯酰胺凝膠的制備及使用方法附件 6.包涵體蛋白的提純與提上清中所用試劑不同之處: 在 Equilibration Buffer 、 Wash Buffer 、 Elution Buffer 中各加了6M 尿素或鹽酸胍。 尿素或鹽酸胍用來溶解包涵體蛋白。 在裂解完后,離心時先 3000rpm3min去除未裂解的細胞和大的碎片,再10000rpm15min 離心 ,沉淀就是包涵體。用加了 6M 尿素或鹽酸瓜的 Equilibration Buffer 溶解包涵體。后面的步驟跟提上清蛋白一致, 只是所用Equilibration Buffer 、 Wash Buffer 、 Elution Buffer 中都含有