遺傳性多發(fā)性外生骨疣基因突變研究

1、    遺傳性多發(fā)性外生骨疣基因突變研究        【摘要】目的進(jìn)一步闡明遺傳性多發(fā)性外生骨疣(hereditary multiple exostoses,EXT)的發(fā)病機(jī)理，并為最終防治本病提供依據(jù)。方法采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析，在30個(gè)EXT家系中進(jìn)行EXT1基因和EXT2基因全部外顯子突變檢測(cè)，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病突變進(jìn)行DNA測(cè)序分析。結(jié)果在2個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)了致病突變，并經(jīng)DNA序列分析證實(shí)，一個(gè)系EXT1基因exon 6區(qū)域單個(gè)堿基(T)丟失；另一個(gè)系EXT

2、2基因exon 2區(qū)域4個(gè)堿基(tgtt)丟失，前者系國(guó)內(nèi)首次報(bào)道，后者系尚未見(jiàn)報(bào)道的新突變，這兩種突變均系移碼突變。結(jié)論EXT1基因或EXT2基因突變，可導(dǎo)致EXT，本研究結(jié)果可直接應(yīng)用于EXT的遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷?！娟P(guān)鍵詞】遺傳性多發(fā)性外生骨疣聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析基因突變 Identification of mutations in the human EXT1 and EXT2 genesSONG Guoqing*, ZHOU Jiangnan, XIA Jiahui, DENG Hanxiang, XU Lei, HUANG Lei, RUAN Qingguo.* Th

3、e Affiliated Xiangya Hospital, Hunan Medical University, Changsha, 410078 P.R.China. E-mail:wyxsgq.【Abstract】ObjectiveTo investigate further the genetic basis of hereditary multiple exostoses (EXT) and provide useful information for gene diagnosis of the disease. MethodsPolymerase chain reaction-sin

4、gle strand conformation polymorphism(PCR-SSCP) was used to examine the entire coding regions of EXT1 gene on chromosome 8 and EXT2 gene on chromosome 11 for mutation in thirty EXT families. Mutations were further identified by sequencing. ResultsTwo frameshift mutations were identified in two unrela

5、ted EXT families. One was the deletion of one base(T) in exon 6 of the EXT1 gene, and the other was the deletion of four bases (tgtt) in exon 2 of the EXT2 gene. Both of the mutations resulted in a frameshift and premature termination of translation.ConclusionEXT is a genetically heterogeneous bone

6、disorder caused by the mutation of EXT tumor suppressor gene. These results could be directly applied in the genetic counselling and prenatal genetic diagnosis of EXT.【Key words】Hereditary multiple exostosesPolymerase chain reaction-single strand conformation polymorphismGene mutation遺傳性多發(fā)性外生骨疣(here

7、ditary multiple exostoses,EXT)是一種具有遺傳異質(zhì)性的骨骼系統(tǒng)疾病，在基因組中至少存在3個(gè)位點(diǎn)，即8q24.1(EXT1)、11P11(EXT2)和19P(EXT3)1-3。由于在EXT并發(fā)軟骨肉瘤的患者中觀察到相關(guān)染色體的雜合性丟失，人們推測(cè)EXT基因是腫瘤抑制基因4。最近，EXT1基因和EXT2基因被克隆和鑒定5-7，為了進(jìn)一步弄清EXT的發(fā)病機(jī)理，并為最終防治本病奠定基礎(chǔ)，我們采用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(poly-merase chain reaction-single strand conformation polymorphsim,PCR-SSCP)

8、分析銀染技術(shù)，在30個(gè)EXT家系中開(kāi)展EXT1基因和EXT2基因全部外顯子的突變篩查，并對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病突變行DNA測(cè)序分析。1材料和方法1.1EXT家系收集和DNA樣品的制備30個(gè)EXT家系由湖南醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和附屬第一、二、三醫(yī)院共同收集，DNA提取按常規(guī)方法進(jìn)行，并用紫外分光光度計(jì)定量。1.2PCR-SSCPPCR所用引物共24對(duì)(上海Sangon生物工程公司)，發(fā)現(xiàn)突變所用兩對(duì)引物序列如下：引物P1 5-AGGTAAGGAGGGCGGAG-3，5-CCTCCAAATTCACTGCAG-3，擴(kuò)增片段覆蓋了EXT1基因exon 6。引物P2 5-CTATCGCTGTGG-CT

9、TCAACC-3，5-GGCTGTATGAGTGTGAGAT-3，擴(kuò)增EXT2基因exon 2的一部分。PCR反應(yīng)在PE480型PCR儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)總體積為20 l，含各引物0.5 mol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、Tris.Cl(pH8.3)10 mmol/L、KCl 50 mmol/L、MgCl2 1.5 mmol/L、明膠100 g/ml、Taq DNA聚合酶(Sangon公司)1U、基因組DNA 120ng。擴(kuò)增條件為95預(yù)變性3分鐘，隨后941分鐘、561分鐘、721分鐘，循環(huán)34周期。PCR結(jié)束后加入等體積加樣緩沖液(含95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0

10、.05%溴酚藍(lán)、0.05%二甲苯青)終止反應(yīng)。6%中性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物后，100變性10分鐘，立即置入冰浴中，約10分鐘后取12l混合液上樣，行8%聚丙烯酰胺(291)凝膠(含5%甘油)電泳，電泳液為 1×TBE，電泳儀系A(chǔ)ppligene公司生產(chǎn)V6-298型電泳系統(tǒng)，16恒溫4W功率電泳20小時(shí)，卸膠銀染方法參照文獻(xiàn)報(bào)道8。1.3測(cè)序分析當(dāng)SSCP分析出現(xiàn)異常單鏈構(gòu)象帶時(shí)則進(jìn)一步做測(cè)序分析。用“壓碎與浸泡”法，從6%聚丙烯酰胺凝膠中回收PCR產(chǎn)物，使用pGEM-T Vector System Kit(Promega公司)，將PCR產(chǎn)物連接于pGEM-T質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化JM

11、109菌株，挑取白色克隆初級(jí)培養(yǎng)擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板行PCR-SSCP檢測(cè)，選擇需要測(cè)序的克隆。將要測(cè)序的克隆次級(jí)培養(yǎng)擴(kuò)增后，用Qiagen Plasimid Mini Kit(Qiagen公司)抽取質(zhì)粒DNA制備測(cè)序模板，用Taq Dye Deoxy Termintor Cycle Sequencing Kit (ABI公司)進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，ABI377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀完成測(cè)序電泳和DNA序列分析。2結(jié)果用P1引物行PCR-SSCP，家系1的患者出現(xiàn)了一致的異常泳動(dòng)移位的DNA單鏈構(gòu)象帶(1)。用P2引物行PCR-SSCP，則在家系2的患者中檢出了一致的異常泳動(dòng)移位的DN

12、A單鏈構(gòu)象帶(1)。進(jìn)一步行DNA序列分析發(fā)現(xiàn)，家系1的患者發(fā)生了EXT1基因cDNA第2120位T的丟失(2，3)，位于exon 6，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化FS L490，且在突變位點(diǎn)后第9個(gè)密碼子處出現(xiàn)終止密碼。cDNA序列分析為：正常序列2113ACCCCCCTGGTCTCTCAGTCCCAGCCAGTGTTGAAG488 TPLVSQSQPVLK突變序列2113ACCCCCCGGTCTCTCAGTCCCAGCCAGTGTTGA488 TPRSLSPSQC家系2的患者則在EXT2基因cDNA第789796位之間丟失4個(gè)堿基(tgtt)。第789796位之間原有2個(gè)tgtt，突變后丟失1個(gè)tgtt

13、，該突變位于exon 2。導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化FS V154。cDNA序列分析為：785 TGT CTG TTT GTT CCC TCC ATC GAT151 CLFVPSID785 TGT CTG TTC CCT CCA TCG ATG151 CLPPSM1EXT家系和SSCP電泳分析箭頭指示的泳道出現(xiàn)異常泳動(dòng)移位的ssDNA帶，提示突變Fig 1EXT families and SSCP analysis The abnormal shifted ssDNA bands appear in the marked() lane indicating mutation2EXT1基因exon 6的一段

14、正常序列Fig 2A fragment of normal sequence in exon 6 of EXT1 gene3突變后的EXT1基因exon 6的一段序列(示T丟失部位)Fig 3A fragment of sequence after mutation in exon 6 of EXT1 geneThe arrow indicates the position of 1-bp deletion(T)3討論1989年，Qrita等首先報(bào)道了PCR-SSCP分析技術(shù)，該方法為基因變異、尤其是為點(diǎn)突變的檢測(cè)和篩查提供了可靠而簡(jiǎn)捷的手段。進(jìn)一步的DNA序列分析則可明確突變的位置和類型。P

15、CR-SSCP分析的成功與否受到單鏈DNA長(zhǎng)度、DNA變性條件、凝膠的濃度、交聯(lián)度、溫度、甘油含量以及電泳緩沖液濃度等因素的影響，據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，理想的SSCP條件有時(shí)需反復(fù)摸索，有的PCR產(chǎn)物即使采用多重SSCP，條件可能仍不理想，此時(shí)只能選用其它突變檢測(cè)方法。最近，EXT1、EXT2基因相繼被克隆。1995年，Ahn等5克隆了EXT1基因，此基因cDNA克隆編碼區(qū)域長(zhǎng)2238bp，與已知基因無(wú)明顯同源性，同時(shí)，他們?cè)?個(gè)EXT家系中檢出移碼突變，該突變存在于exon6，系cDNA第2120位T丟失。此突變改變閱讀框，導(dǎo)致翻譯在突變位點(diǎn)后第9個(gè)密碼子處提前終止。以后，Wells等9又在另一家系

16、中檢出此種突變，我們?cè)谥袊?guó)人中也檢出此突變，提示該部位突變發(fā)生率較高。1996年，Stickens和Deng等6，7克隆了EXT2基因。該基因cDNA克隆編碼區(qū)域長(zhǎng)2154bp，其核苷酸序列和所編碼的氨基酸序列與EXT1基因有顯著相似性。同時(shí)，他們?cè)?個(gè)EXT家系中檢出移碼突變，該突變發(fā)生于exon2，系cDNA第784787位的4個(gè)堿基(ctgt)丟失。我們未發(fā)現(xiàn)此種突變，但卻在exon2發(fā)現(xiàn)一種新的突變，該發(fā)現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。我們報(bào)告的兩種移碼突變均導(dǎo)致翻譯提前終止，所形成的蛋白質(zhì)極有可能因快速降解失去活性，其腫瘤抑制功能喪失。隨著EXT基因克隆，在EXT家系中開(kāi)展基因突變檢測(cè)，不僅有利于徹底

17、闡明EXT的發(fā)病機(jī)理，而且，其結(jié)果可直接應(yīng)用于EXT的遺傳咨詢和產(chǎn)前基因診斷，并為最終治療本病提供了依據(jù)。作者單位：宋國(guó)清周江南（410008 長(zhǎng)沙，湖南醫(yī)科大學(xué)附屬湘雅醫(yī)院）夏家輝鄧漢湘徐磊黃蕾阮慶國(guó)（醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）宋國(guó)清（現(xiàn)在湖南醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科）參考文獻(xiàn)1Cook A, Raskind W, Blanton SH,et al. Genetic heterogenety in families with hereditary multiple exostoses. Am J Hum Genet, 1993, 5371-79.2Wu YQ, Heutink P, De V

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