預(yù)防PRRSV的載體疫苗的研究進(jìn)展.docx

1、預(yù)防PRRSV的載體疫苗的研究進(jìn)展李國(guó)峰，韓鶴，翟宇(吉林省梅河口市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，梅河口135000)DOI:10.3969/J.ISSN.1671-6027.2014.03.005豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)是影響世界養(yǎng)豬業(yè)的一種傳染病的病原體，該病毒對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而商品化疫苗在預(yù)防該病毒感染方面效果卻不顯茗，PRRSV弱毒苗還存在散毒和返強(qiáng)的危險(xiǎn)性，因此尋找-種新的有效的疫苗勢(shì)在必行。目前,一種基于病毒載體的疫苗可以作為PRRSV活疫苗的一個(gè)替代品，本文對(duì)目前用來防

2、御PRRSV的載體疫苗包括偽狂犬病病宙,痕病毒，腺病毒作簡(jiǎn)介，并特別對(duì)作為PRRSV抗原表達(dá)載體的傳染性胃腸炎病毒(TGEV)進(jìn)行介紹，這種載體可表達(dá)較大的異源基因，同時(shí)也是潛在的IFN-a誘導(dǎo)劑.TGEV載體通過與誘導(dǎo)PRRSV中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要蛋白-GP5和M蛋白進(jìn)行重蛆，并對(duì)重組蛋白進(jìn)行保護(hù)性試驗(yàn)。結(jié)果表明該疫苗產(chǎn)生抗體水平更高，時(shí)間更快。并且對(duì)攻毒動(dòng)物也有部分保護(hù)性，但其中和抗體表達(dá)水平較低。同時(shí)本文對(duì)改善PRRSV抗原rTGEV載體疫苗表達(dá)系統(tǒng)提出了幾點(diǎn)建議。1影響PRRSV疫苗發(fā)展的因素影響疫苗發(fā)展的主要問題有3個(gè)：(1)保護(hù)機(jī)制不清楚，PKRSV的結(jié)構(gòu)蛋白具有較大的抗原

3、變異性，因此可能會(huì)誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)的負(fù)調(diào)節(jié)。雖難次級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白在PRRSV感染中也是必須的并且也可以產(chǎn)生保護(hù)性免疫，但是，通過對(duì)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白的分析發(fā)現(xiàn).CP5-M異源二聚體可能是誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫和細(xì)胞免疫的主要蛋白。另外，人們對(duì)誘導(dǎo)保護(hù)性T細(xì)胞反應(yīng)的T細(xì)胞表位的認(rèn)識(shí)也非常有限;(2)病毒抑制或逃避宿主免疫反應(yīng)的-個(gè)機(jī)制是通過調(diào)節(jié)性T細(xì)胞來進(jìn)行的，但是抑制性T細(xì)胞在PRKSV感染后延遲免疫反應(yīng)的機(jī)制還不太清楚，且在這個(gè)過程中病毒蛋白也可能有所參與；(3)PRRSV病毒毒株的多樣性,即使是同-個(gè)基因型，也有許多亞性，在所有結(jié)構(gòu)蛋白中，M蛋白是最為保守的一個(gè),GP5蛋白是變異性最大的一個(gè)蛋白，而這

4、種抗原的高變異性正是阻礙通用疫苗發(fā)展的一個(gè)大問題。因此.解決這個(gè)問題的關(guān)鍵是確定關(guān)鍵的B和T細(xì)胞表位，另外，不同遺傳背景的豬產(chǎn)生的免疫反應(yīng)不同也是一個(gè)重要的問題，因此，對(duì)PRRSV感染豬后宿主反應(yīng)的了解也是發(fā)展有效疫苗要面臨的問題。2載體疫苗如上所述，無論是PRRSV弱毒苗還是滅活苗都已被生產(chǎn)應(yīng)用，弱毒苗在預(yù)防上優(yōu)亍滅活苗。但也存在嚴(yán)重的問題，如不完全保護(hù)、持續(xù)性感染、和力返強(qiáng)等，并且這些問題也日漸嚴(yán)重。目前，基于載體的疫苗在剌激體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)上存在一個(gè)優(yōu)勢(shì)，目前病毒載體的效果至今并不令人滿意，因此需要進(jìn)-步對(duì)新的或抗原組合性載體進(jìn)行探索。2.1偽狂犬病痛毒|7|汪玲.KAP7.1、KAP

5、8.2基因在遼寧新品系絨山羊興盛期毛囊中表達(dá)及分析D|.大連:遼寧師范大學(xué),2010.8張俊戲，等.KAP6基因家族成員在肝胎期山羊皮膚中的表達(dá)J.畜牧與飼料科學(xué),2009,30(3):20-21.13|9姚玉園，等.IGF-1和EGF對(duì)遼寧絨山羊初級(jí)毛囊體外培芥的影響(J.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,41(2):165-169.10 BninoJBetal.Exprzdonofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)receptpringoatovariesandimprovementofinvitrocaprinepreanlndfolliclesurvi

6、valandgrowthwithVEGF|J.Reproduction.FertilityandDevelopment.2009.21(5):679-687.11 YanoK.BrownIF.DetmarM.ControlofhairgrowthandfolliclesizebyVEGF-mediatedangiogenesis.JClinInvrsl2001;107:409-417.12|胡秀芝，等.絨山羊毛囊的周期性發(fā)育及其分子調(diào)控研究進(jìn)展J.家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2012,33(5):1413 FischerTW,etal.MelatoninandthehairfoUiclcJ)JPinealR

7、es.2008,44:1-15.14 CeliP,c(al.Relationshipsbetweenbloodhormonalconccntmtionsandsecondaryfibersheddinginyoungcashmere-lxtaringgoatattheirfibremoult(J,BritishSocietyofAnima)Science,2003.77:371-381.15 李箭，等二醇對(duì)體外培養(yǎng)城山羊初級(jí)毛囊的影響幾安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2009.37(1):151-152.偽狂犬病病毒(PRV)為a-皰疹病毒，屬于皰疹病毒家族，豬是PRV的自然宿主，病毒也可以感染許多其它脊椎動(dòng)物

8、，為了根除該病毒，人們研制r改性活疫苗。所有的疫苗都是GE基因苗，即有一個(gè)GE基因缺失,GE基因的缺失可以減少病毒的傳播,但那并不影響其在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)最同時(shí)也可以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)，這些PRV弱毒苗現(xiàn)在d經(jīng)用于-些疫苗的載體,如豬瘟，豬圓環(huán)病。另外,研究者們也構(gòu)建了一種可以表達(dá)PRRSVGP5蛋白的PRV重組病毒，并通過接種4周齡仔豬進(jìn)行保護(hù)性評(píng)價(jià)，通過使用PRRSVCH-1毒株進(jìn)行攻毒試羚，在攻毒前包括商品化活疫苗對(duì)照組的所有豬都沒有檢測(cè)到GP5抗體，攻毒后在所有豬中都檢測(cè)到了抗CP5蛋白抗體,沒有一頭豬產(chǎn)生抵抗PRRSV的中和性抗體。但與商品疫苗相比,PRV載體苗組的肺臟病變，病毒血癥要

9、輕，并且組織清除病毒的速度較快。2.2財(cái)毒腺病毒是目前最廣泛的基因傳遞系統(tǒng)，作為受體，它可以導(dǎo)入高通量的外源基因（從2KB到36KB）并能夠在多種細(xì)胞中進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，多種復(fù)制缺陷性重組腺病毒現(xiàn)在已經(jīng)用作PRRSV載體,用來研究疫苗或分析PRRSV免疫原性等。目前已經(jīng)構(gòu)建出一系列可以表達(dá)CP5.M和M-Gly-Thr-Thr-CP5融合蛋白的重組腺病毒,并通過小鼠模型對(duì)這些重組病毒中進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明M-GP5魅合蛋白重組腺病毒與GP5和M蛋白重蛆腺病毒及空白腺病毒載體相比可以產(chǎn)生更為明顯的體液免疫中和抗體。同時(shí)M-GB5融合蛋白重組腺病毒也能夠誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖和毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。這些保護(hù)性評(píng)并未

10、在豬體內(nèi)進(jìn)行評(píng)價(jià)。23痘病毒是已知的最大的動(dòng)物DNA病毒。它也被廣泛的用于疫苗的表達(dá)載體。它可以表達(dá)較大的外源基因，并可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。雞痘病毒（FPV）是第一個(gè)用作PRRSV疫苗載體的痘病毒，它屬于禽痘病毒屬，并僅可在禽類體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。然而FPV弱毒株已經(jīng)用于禽類和哺乳類動(dòng)物載體，并可產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)性免疫反應(yīng)。通過FPV載體構(gòu)建了一個(gè)GP5-Pro-Pro-Ser-GP3融合蛋白重組病毒和一個(gè)GP5-Pm-Pro-Ser-GP3融合蛋白與豬118相結(jié)合的重組病毒，仔豬接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FPV重組蚩白在接種后42d可以表達(dá)PRRSV抗原誘導(dǎo)的中和抗體。免疫動(dòng)物也可誘導(dǎo)1FN-7的增

11、加。仔豬接種共表達(dá)PRRSV抗原和IL-18的重組FPV可產(chǎn)生的IFN量比單獨(dú)表達(dá)GP5-GP3融合蛋白的重組病毒要高。并且對(duì)同源毒悚感染也有部分保護(hù)。3豬傳染性胃腸炎病毒作為載體與其它表達(dá)系統(tǒng)相比,冠狀病毒作為載體有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（I）他們是單鏈RNA病毒,無DNA形式,因此病毒基因不會(huì)整合到宿主基因組中；（2）這些病毒的基因組較大，原則上為大的外源基因的插入提供空間；（3）是腸相關(guān)淋巴組織分泌性免疫反應(yīng)最佳的剌激誘導(dǎo)物。由于冠狀病毒一般可以感染呼吸道和腸道粘膜的表面，因此，這些病毒可用于針對(duì)腸道和呼吸道的抗原產(chǎn)生較強(qiáng)的分泌性免疫反應(yīng);（4）冠狀病毒的趨向性可以通過對(duì)S基因的修改進(jìn)行設(shè)計(jì);（

12、5）非致病性冠狀病毒可以感染大多數(shù)物種（人，豬，牛，犬，貓，和禽）因此比較適合開發(fā)安全的病毒載體;（6）傳染性冠狀病毒的cDNA克隆也可用來對(duì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行設(shè)計(jì)。豬呼吸冠狀病卷（PRCV）是豬傳染性胃腸炎病毒的突變體，它可以在呼吸道中復(fù)制，并無或僅導(dǎo)致輕微的臨床癥狀。因PRCV已在全球范圍內(nèi)堂延，并旦誘導(dǎo)的抗體也可以中和豬傳染性胃腸炎病毒，因此，體內(nèi)預(yù)存的免疫性抗體對(duì)TGEV載體的抵抗可能是影響其發(fā)展的一個(gè)問題，然而，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明：共至在rTGEV載體二次感染豬后，其抗TGEV抗體已經(jīng)開始升高。重組TGEV（rTGEV）作為PRRSV載體的一個(gè)主要的優(yōu)點(diǎn)是TGEV是IFN-a的一種強(qiáng)誘導(dǎo)劑。另外

13、，如上所述,TGEV可能會(huì)出現(xiàn)在粘膜部位，從而誘導(dǎo)粘膜免疫和全身免疫反應(yīng)。因此rTGEV載體將會(huì)成為研究誘導(dǎo)抗PRRSV保護(hù)提供一個(gè)新的策略。3.1表達(dá)PRRSV擾原的TGEV成體3.1.GP5-M抗原平臺(tái)PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白GP5和M在感染細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生聚集.在那里它們通過二硫鍵形成異源二聚體，促進(jìn)病毒粒子的進(jìn)入。在感染細(xì)胞中也可以檢測(cè)到M蛋白同源二聚體,但與病毒粒子的侵入無關(guān)。雖然病毒粒子的感染需要些次級(jí)膜蛋白的協(xié)助.但GP5和M蛋白在病毒增殖中是必不可少的。根據(jù)目前所認(rèn)可的GP5-MS白二聚體的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)GP5和M蛋白在病毒粒子表面有一個(gè)很短的胞外域用來參與受體識(shí)別。GP5胞

14、外域含有幾個(gè)糖基化位點(diǎn)，現(xiàn)已表明.GP5-M蛋白二聚體的形成發(fā)生在GP5精基化之前。GP5摭基化位點(diǎn)與ECN表位比較接近，目前有研究提出糖基化引起的空間位阻可能是PRRSV感染后NAbs延遲產(chǎn)生的原因之一。最近研究表明GP5-M異源二聚體可與PRRSV受體豬唾液酸粘附素發(fā)生相互作用，并且這種作用與GP5的糖基化有關(guān)，此糖基化位點(diǎn)很有可能與中和抗體識(shí)別表位重疊。如上所述,GP5和M賀白與PRRSV中和抗體的產(chǎn)生及細(xì)胞免疫的形成有關(guān)，這也表明,GP5-M異源二聚體是一種可用于建造有效疫苗最有前途的抗原結(jié)構(gòu)。3.1.2表達(dá)GP5和M蛋白的rTGEV研究者設(shè)計(jì)了一個(gè)編碼PRRSVGP5和M蛋白的雙順反

15、子TGEV,這兩種蛋白在重組TGEV感染細(xì)胞中的表達(dá)率分別為85%和95%,并且，即使在rTGEV感染后的恢復(fù)期組織中也能維持相同的表達(dá)水平，這個(gè)結(jié)果基本上優(yōu)于以前的單獨(dú)表達(dá)PRRSV某一蛋白的rTGEVs（如GP5蛋白rTGEV可以高水平表達(dá),但不穩(wěn)定）。GP5蛋白與M蛋白共表達(dá)可降低GP5蛋白毒性同時(shí)也可能引起更好的T細(xì)胞免疫反應(yīng)。通過體內(nèi)試驗(yàn)對(duì)其保護(hù)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，無論是口腔，鼻腔還是胃內(nèi)接種，在攻毒后都可產(chǎn)生較高的抗TGEV抗體反應(yīng)，免疫動(dòng)物也表現(xiàn)出抗PRRSVGP5和M蛋白體液免疫反應(yīng),在攻毒后發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)快速升高，因?yàn)橐呙缃M較對(duì)照組可更早的產(chǎn)生更高的抗體滴度,然而由rTGEV產(chǎn)生的

16、免疫反應(yīng)的保護(hù)性卻有限，這可能是因?yàn)樵诠ザ厩爸泻涂贵w的產(chǎn)生水平較低的緣故。然而，使用rTGEV作為剌激PRRSV抗原體液免疫反應(yīng)的載體仍是非常有前途的。3.2rTGEV系晚表達(dá)PRRSV蛋白的穩(wěn)定性從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的數(shù)據(jù)表明rTGEV載體表達(dá)PRRSV抗原并非完全穩(wěn)定，主要是因?yàn)镚P5蛋白的毒性導(dǎo)致CP5蛋白表達(dá)的顯著丟失，相反的,M蛋白的表達(dá)非常穩(wěn)定，在組織培養(yǎng)中至少有95%的感染細(xì)胞可以在大于10代次中穩(wěn)定表達(dá)，在與連接非感染性抗原的rTGEV載體的比較中發(fā)現(xiàn)，GP5rTGEV載體中GP5蛋白表達(dá)的減少可能是rTGEV載體自我保護(hù)的一種結(jié)果。33rTGEV源性疫笛的保護(hù)性表達(dá)糖基化突變GP

17、5蛋白的滅活苗的制定，作為一種補(bǔ)充的方法，開發(fā)了一個(gè)基于rTGEV-GP5-N46S-M病毒(缺乏第一個(gè)糖基化位點(diǎn)的GP5蛋白與M蛋白共表達(dá)病毒)的滅活苗,通過對(duì)一周齡組免疫后攻毒發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比，疫苗組的動(dòng)物可誘導(dǎo)更快，更高的RRRSV抗原的抗體，且中和抗體滴度也較對(duì)照組高。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病毒血癥，大體變化，及肺臟的病理變化觀察發(fā)現(xiàn)，疫苗組明顯減輕。這表明中和表位附近糖基化位點(diǎn)的消除可提高抗PRRSV保護(hù)性免疫反應(yīng)。表達(dá)糖基化突變GP5蚩療和M蛋白rTGEV的體內(nèi)試驗(yàn)rTGEV-GP5-N46S-M活苗的體內(nèi)保護(hù)性試驗(yàn)表明，接種1周齡豬6周后攻毒發(fā)現(xiàn)，所有豬在接種后都可產(chǎn)生較高的TGEV抗體

18、，攻毒后免疫組可產(chǎn)生明顯的抗PRRSV抗體.對(duì)疫苗的保護(hù)性分析表明,疫苗株肺臟損傷程度明顯低于對(duì)照組，但免疫反應(yīng)并沒能提供足夠的保護(hù)作用，可能因?yàn)槊庖呓M中和抗體表達(dá)水平與對(duì)照組并無差別。3.4TGEV浪性炭體發(fā)展集尊到目前為止，表達(dá)PRRSV抗原的rTGEV僅可產(chǎn)生部分保護(hù),這可能與rTGEV載體不能穩(wěn)定持續(xù)的表達(dá)PRRSV抗原有關(guān)，而其穩(wěn)定性又主要與GP5蛋白的毒性有關(guān),于此相反的是M蛋白的表達(dá)卻很穩(wěn)定。表達(dá)PRRSV抗原的rTGEV保護(hù)性不足還可能與表達(dá)的蛋白存在可以誘導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(Treg)的表位有關(guān)，由于免疫rTECV中的受體可誘導(dǎo)IF、的產(chǎn)生，這可能因?yàn)槭荝RRSVGP5或M蛋白的

19、可能存在誘導(dǎo)Trcg的負(fù)調(diào)劑信號(hào)。這種免疫反應(yīng)負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)的產(chǎn)生可能也是延遲抗PRRSV保護(hù)性免疫反應(yīng)的一個(gè)主要原因。為了提高rTGEV載體的穩(wěn)定性，人們提出了不同的策略如，表達(dá)含有GP5保護(hù)性抗原表位但缺少不穩(wěn)定性表達(dá)域的小片段等。4小結(jié)由于目前疫苗療效的局限性，發(fā)展種新的PRRSV疫苗策略勢(shì)在必行?，F(xiàn)在改性活疫苗和病毒載體苗在刺激PRRSV免疫反應(yīng)中已獲得了很好的效果，但是，到目前為止，病毒載體的應(yīng)用還不太令人滿意，因此要解決這個(gè)問題必須開發(fā)一種新的載體?？梢员磉_(dá)不同PRRSV抗原的TGEV源性載體作為一個(gè)新的候選者，它可以對(duì)PRRSV和TGEV兩種病毒提供保護(hù)。與其它載體疫苗相比rTGEV

20、載體的使用具有很大的發(fā)展前景然而，與其它RNA病毒的報(bào)道一樣,異源蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性是有限的。因此，增加PRKSV抗原表達(dá)的穩(wěn)定性和清除可引發(fā)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的結(jié)構(gòu)域是開發(fā)高效PRRSV疫苗的新途徑。參考文獻(xiàn)11Wissink.E.etal.Envelopeproteinrequirementsfortheassemblyofinfectiousvirionsofporcinereproductiveandrespiralorysyndromevinis|J.JVirol,2005.79(19):12495-12506.2Mateu.E.andI.Diaz,ThechallengeofPRRSimm

21、unologyfj.TheVeterinaryJournal.2008.177(3):345-351.3JLewis,CR，etal.Geneticperspectivesonhostresponsestoporcinereproductiveandnpiratorysyndrome(PRRS)|J|.Viralimmunolo©,2007.20(3):343-358.j4|Kimman,T.G.，etal.，Challengesforporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)vaccinolog)JJ.Vaccine,

22、2009.27(28):3704-3718.|5Pomeranz,LE.,etal.andCJ.Hengartner,Molecularbiologyofpseudorabiesvirus:impactonneumvirologj1andveterinaryMicrobiologyandmolecularbiologyrevieHs.2005.69(3):462-500.6Nauwynck,H.，etal.,CellbiolofpcalandmolecularcharaclenKliesofpseudorabiesvirusinfectionsincellculturesandinpigswi

23、themphasisontherespiratorytract(J.Veterinaryresearch.2007.38(2):229-241.|7jJu,C.,etal，ImmunogenicityofarecombinantpscudorabicsvirusexpressingORF1/ORF2fusionproteinofporcinecircovirustype2(J).VetMicrobiol,2005.109(3):179-190.8 Qiu,H-J，etal.Protectiveimmunityinducedbyarecombinantpseu(loral>iesvirusexpn?ssingtheGP5ofporcinerrpruductiveandrespiratorysyndromevirusinpigjetsjJj.Veterinaryimmunologyandimmunopathology,2005.i06(3):309-319.9 Jiang.W，etal.，RecombinantadenovirusexpressingGP5andMfusionproteinso