諾如病毒表達(dá)衣殼蛋白單克隆抗體的制備、 鑒定和初步應(yīng)用

1、諾如病毒表達(dá)衣殼蛋白單克隆抗體的制備、 鑒定和初步應(yīng)用【摘要】 目的: 建立能穩(wěn)定分泌抗諾如病毒（Norovirus）N蛋白的單克隆抗體（mAb）細(xì)胞株, 制備抗諾如病毒核衣殼蛋白的mAb, 為諾如病毒的早期快速檢測及致病機制的研究提供實驗材料。方法: 用E.coli表達(dá)的G組廣州株NVgz01（DQ369797）NorovirusN蛋白免疫BALB/c小鼠, 通過PEG使小鼠脾細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞融合, 使用HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)融合細(xì)胞, 用間接ELISA和Western blot測定mAb的效價、 免疫球蛋白亞型和mAb的特異性, 并將各mAb之間進(jìn)行配對。結(jié)果: 通過細(xì)胞融合和克隆化,

2、 共篩選出4株分泌抗NorovirusN蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。間接ELISA和Western blot檢測結(jié)果表明, 這4株mAb都可以與E.coli表達(dá)的G組廣州株NorovirusN蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng), 并且能與天然糞便標(biāo)本中的G組Norovirus產(chǎn)生特異性反應(yīng)。配對結(jié)果顯示N2C3和N7C2之間配對, 對表達(dá)蛋白和天然病毒都具有較強的檢測靈敏度。結(jié)論: 獲得了諾如病毒G組特異性mAb, 為制備免疫診斷試劑盒及致病機制的研究奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】 Norovirus NVgz01 核衣殼蛋白 單克隆抗體諾如病毒作為流行性腸胃炎的主要病因之一

3、, 無論在家還是發(fā)達(dá)國家, 從兒童到成年人都可以受到諾如病毒感染, 并可造成爆發(fā)流行, 成為影響人類健康的不可忽視的問題, 近年來逐漸引起了研究者的重視。美國CDC經(jīng)過評估認(rèn)為, 每年在美國發(fā)生的食源性疾病有2 300萬宗是由諾瓦克及諾瓦克樣病毒引起的1; 在歐洲, 數(shù)據(jù)顯示19952000年間, 有超過85的食源性病毒腸胃炎爆發(fā)案例由諾瓦克及諾瓦克樣病毒引起2。由于人類諾如病毒分為G和G兩組3, 4, 根據(jù)北京5、 太原6和武漢7三地的血清學(xué)調(diào)查結(jié)果, 初步認(rèn)為G組病毒為我國主要流行組。由于諾如病毒無法在體外感染細(xì)胞及動物模型來進(jìn)行培養(yǎng)分離鑒定, 目前對諾如病毒的診斷方法主要是免疫電鏡法（I

4、EM）、 放射免疫法（RIA）、 ELISA法、 RealTimePCR法等8, 其中, 夾心ELISA方法, 即使用單克隆抗體(mAb)捕獲患者糞便標(biāo)本中的病毒抗原來進(jìn)行檢測的方法, 由于交叉反應(yīng)性小, 特異性較強且敏感度較高, 成為目前研制諾如病毒檢測試劑所主要采用的方法。本研究中我們以E.coli表達(dá)的G組廣州株NorovirusN蛋白作為免疫原, 免疫BALB/c小鼠并制備mAb, 為研制諾如病毒檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 諾如病毒糞便標(biāo)本為使用DakoCytomation公司的IDEIA Norovirus 抗原檢測試劑盒檢測為陽性的標(biāo)本。6周齡的雌性BALB/c

5、小鼠, 購自中山大學(xué)實驗動物中心。Sp2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞系為本實驗室保存。諾如病毒核衣殼蛋白表達(dá)重組質(zhì)粒 pET28a（）NoroNP由本實驗室制備及保存, 諾如病毒N蛋白基因的克隆、 表達(dá)和鑒定方法見報道9。PEGMW3350購自Sigma公司, HAT、 HT 和RPMI1640購自Gibco公司, 新生牛血清購自杭州四季青公司, 羊抗鼠IgG購自BOSTER公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 方法2 結(jié)果2.1 分泌抗諾如病毒衣殼蛋白mAb的雜交瘤細(xì)胞株的建立 用pET28a（）NoroNP重組表達(dá)載體表達(dá)諾如病毒G組廣州株的全長衣殼蛋白免疫小鼠, 取小鼠血清測效價, 在滿意滴度下將

6、小鼠進(jìn)行脾內(nèi)加強免疫, 3 d后取脾細(xì)胞與Sp2/0細(xì)胞進(jìn)行融合。10 d后用純化的NVNP 5 mg/L包被酶標(biāo)板, 雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗, 羊抗鼠IgG作為二抗檢測抗體, 并同時用pET28a（）載體表達(dá)的輪狀病毒蛋白作為陰性對照, 以排除與大腸桿菌BL21細(xì)胞成分和pET28a（）載體成份反應(yīng)的假陽性抗體。對抗體分泌能力強的培養(yǎng)孔用有限稀釋法進(jìn)行2次克隆化, 共篩選出4株能穩(wěn)定分泌抗諾如病毒核衣殼蛋白抗體的細(xì)胞株, 分別為N2C3、 N7C2、 N4B1、 N8A9。2.2 腹水效價的測定 收集腹水, 用間接ELISA方法測定, 結(jié)果N2C3和N7C2 2株抗體最強, 腹水稀釋至10-

7、6P/N值為0.4; N4B1株抗體較弱, 腹水稀釋至10-4P/N值為0.5; N8A9株抗體最弱, 腹水稀釋至10-3P/N值為0.3（陰性對照P/N值為0.08）。2.3 mAb免疫球蛋白亞類鑒定 用PIERCE公司試劑盒對mAbIg的類型和亞類進(jìn)行特異性鑒定, 結(jié)果2株mAb鑒定為IgG2a（N2C3和 N4B1）, 2株mAb鑒定為IgM（N7C2和 N8A9）, 4株mAb輕鏈均為鏈。2.4 mAb特異性檢測 4株mAb分別與表達(dá)重組蛋白和諾如糞便標(biāo)本進(jìn)行Western blot檢測, 表達(dá)重組蛋白上由于帶有表達(dá)載體上的T7和（His6）標(biāo)簽, 因而Mr比天然諾如病毒核衣殼蛋白（M

8、r為5610358103）多了3103左右。Western blot結(jié)果見圖1, mAb不僅可以同表達(dá)重組蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng), 并且可以同天然諾如病毒核衣殼蛋白進(jìn)行特異性反應(yīng)。其中N2C3和N7C2的反應(yīng)性較強, N8A9和N4BI對糞便標(biāo)本的反應(yīng)性較弱。圖1 mAb的Western blot分析（略）Fig 1 Western blot analysis of expression products in E.coli and native NV stool sample with four mAbsA: N2C3; B: N8A9; C: N7C2; D: N4B1. 1: Native

9、norovirus stool sample; 2: Expressed recombinant protein of Norovirus NVgz01.1 2.5 mAb配對試驗和初步應(yīng)用表1 N2C3、 N7C2和N4B1 mAb在夾心ELISA中的結(jié)果（略）Tab 1 Sandwich ELISA results for N2C3, N7C2 and N4B13 討論 諾如病毒最早發(fā)現(xiàn)于1972年, 由Kapikian等11借助免疫電鏡技術(shù)（IEM）觀察到一種病毒顆粒, 并根據(jù)發(fā)病地區(qū)將此病毒命名為 Norwalk virus(NV)。此后, 越來越多的諾瓦克樣病毒在世界各地被發(fā)現(xiàn), 這

10、些分離得到的病原都以其流行地區(qū)或發(fā)病特征等命名。1993年Jiang等12通過分析諾瓦克病毒的cDNA克隆的核酸序列發(fā)現(xiàn)其屬于杯狀病毒屬（calicivirus）, 后根據(jù)病毒RNA聚合酶區(qū)或衣殼蛋白區(qū)核苷酸和氨基酸序列的同源性比較, 將人類杯狀病毒（HuCV）分為3個基因組（genogroup）:組（代表株NV）、 組（代表株SMA）和組（代表株Sapporo）?，F(xiàn)將這3組病毒統(tǒng)稱為諾如病毒（Norovirus）。諾如病毒在我國最早發(fā)現(xiàn)于1995年13, 后于我國多個城市和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。根據(jù)報道, 當(dāng)前G組病毒為主要流行的諾如病毒14。 諾如病毒是單股正鏈RNA病毒, 其基因組長度為77.5

11、 kb, 包括3個ORF, 其中ORF2編碼一個Mr為5865103的病毒核衣殼蛋白15。由于諾如病毒在感染患者糞便中排毒量少, 排毒時間短, 且無法在體外感染細(xì)胞及動物模型來進(jìn)行培養(yǎng)分離鑒定16, 因此為了對諾如病毒進(jìn)行進(jìn)一步的研究, 制備mAb, 或研制疫苗等, 都只能依靠表達(dá)系統(tǒng)來完成。自20世紀(jì)80年代通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)確定了ORF2為病毒核衣殼蛋白編碼序列后, 對諾如病毒的免疫學(xué)研究工作主要都通過表達(dá)ORF2來進(jìn)行。 諾如病毒廣州株NVgz01（DQ369797）為本實驗室測出的本地流行株, 經(jīng)同源性分析屬于諾如病毒G組17, 符合我國人杯狀病毒的流行趨勢。過往研究者在研究ORF2

12、時多采用桿狀病毒載體系統(tǒng)來表達(dá), 且表達(dá)的核衣殼蛋白可以自行組裝成病毒樣顆粒, 但桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)相較于E.coli表達(dá)系統(tǒng)而言費時費力。E.coli表達(dá)系統(tǒng)操作簡便, 重組蛋白產(chǎn)量高, 并且可以使用配套純化方法對重組蛋白進(jìn)行高度純化。Tomoko等18的研究證實, 用E.coli表達(dá)系統(tǒng)也可以表達(dá)出用于免疫研究的病毒核衣殼蛋白, 并且證實重組蛋白具有良好的抗原性, 因而本實驗也采用E.coli表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)諾如病毒核衣殼蛋白。利用Ni2親和層析柱對重組N蛋白進(jìn)行純化, 純化后表達(dá)蛋白純度占總蛋白的95以上, 用此純化后的重組蛋白作為抗原免疫小鼠, 然后制備mAb。為了保證制備mAb的特異性,

13、我們使用表達(dá)輪狀病毒VP6的pET28a（）VP6BL21的細(xì)胞裂解液作為陰性對照, 確保了所獲得的雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體均是針對諾如病毒重組N蛋白的。經(jīng)過多次克隆化, 共獲得了4株穩(wěn)定分泌抗衣殼蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株, 并對mAb Ig的類型和亞類進(jìn)行特異性鑒定, 結(jié)果2株mAb鑒定為IgG2a（N2C3和N4B1）, 2株mAb鑒定為IgM（N7C2和N8A9）, 4株mAb輕鏈均為鏈。雖然本實驗使用的二抗是羊抗鼠IgG, 但其能篩選出IgM的原因可能是此二抗識別的表位是位于IgG和IgM所共有的恒定區(qū)上, 因而在ELISA過程中此二抗也有可能識別出IgM。根據(jù)ELISA和Western b

14、lot檢測結(jié)果分析, N2C3、 N7C2、 N4B1和N8A9均與表達(dá)衣殼蛋白有良好的反應(yīng)性和特異性, 并且都與患者糞便標(biāo)本中的天然諾如病毒具有反應(yīng)性和特異性, 其中N2C3和N7C2 2株的反應(yīng)性和特異性都較強。根據(jù)N2C3和N7C2的配對結(jié)果, 以重組表達(dá)蛋白作為樣本進(jìn)行檢測時, 樣本濃度稀釋至0.042 mg/L時P/N值仍能達(dá)到1.1391.452, 證明N2C3和N7C2 2株抗體之間的配對檢測具有較強的靈敏性和特異性。在此配對結(jié)果基礎(chǔ)上, 對53份PCR檢測為Norovirus G組陽性的腹瀉患者糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測, 共檢出35份陽性結(jié)果, 陽性率為66。出現(xiàn)PCR結(jié)果和ELISA

15、結(jié)果不完全相符的原因可能是由于PCR方法的假陽性率比較高, 或是配對的兩株單抗在病毒組內(nèi)表現(xiàn)株型特異性, 這兩種可能性都有待進(jìn)一步研究證實?！疚墨I(xiàn)】 1 Mead PS, Slutsker L, Dietz V, et al. Foodrelated illness and death in the United StatesJ. Emerg Infect Dis, 1999, 5(6): 607-625.2 Lopman BA, Reacher MH, van Duijnhoven Y, et al. Viral gastroenteritis outbreaks in Europe, 19

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