通絡益智散對擬血管性癡呆大鼠腦組織中Glu和GABA影響的實驗研究(一)

1、通絡益智散對擬血管性癡呆大鼠腦組織中Glu和GABA影響的實驗研究(一)    摘 要：目的：探討通絡益智散對擬血管性癡呆大鼠海馬區(qū)興奮性和抑制性氨基酸的影響。方法：選用改良的腦缺血再灌注配合腹腔注射硝普鈉降壓法復制血管性癡呆模型。將實驗大鼠隨機分為5組，即假手術組、模型組、尼莫地平組、通絡益智散大劑量組、通絡益智散小劑量組。給藥3周后，取海馬勻漿檢測谷氨酸（Glu）含量，并觀察海馬區(qū)-氨基丁酸（GABA）的表達。結果：通絡益智散可以顯著降低擬血管性癡呆模型大鼠海馬區(qū)Glu的含量、增強GABA的表達（P0.01）。結論:通絡益智散能夠通過調(diào)節(jié)血管性癡呆大

2、鼠海馬區(qū)Glu和GABA的含量保護腦組織，這可能是其治療血管性癡呆的作用機制之一。關鍵詞：血管性癡呆;谷氨酸；-氨基丁酸血管性癡呆(Vascular Dementia,VD)是由各種腦血管病所導致的癡呆綜合征。屬于中醫(yī)“呆病”、“文癡”、“健忘”等范疇。在我國由于腦血管病的多發(fā),使得VD成為高發(fā)疾病之一。目前國內(nèi)外對控制本病病程進展尚無有效方法和藥物，但根據(jù)現(xiàn)在的研究結論認為VD具有潛在的可防治性，其部分是可逆的1。本研究通過觀察通絡益智散對擬血管性癡呆大鼠GABA表達及Glu含量的影響，進一步闡明通絡益智散對血管性癡呆的作用機制，為缺血再灌流后所致血管性癡呆的治療提供實驗依據(jù)。1 實驗材料1

3、.1 實驗動物健康9月齡Wistar雄性大鼠60只，質(zhì)量250±20 g，由蘭州大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。實驗前先適應性喂養(yǎng)3 d，實驗過程中自由喂養(yǎng)。1.2 藥品與試劑硝普鈉粉針劑（北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術有限公司生產(chǎn)，批號041011，50 mg /支）用雙蒸水配成1 mg/L溶液，黑紙包裹備用；尼莫地平(山西亞寶藥業(yè)集團有限公司生產(chǎn)，批號041003，20 mg/片，實驗時用生理鹽水配成1 mg/mL的混懸液)；通絡益智散由紅芪、當歸、地龍、紅花、桃仁、葛根、核桃仁、石菖蒲、遠志組成，將其水煎3次，合并濃縮為含生藥3.14 g/mL的藥液，高壓滅菌，4 貯存?zhèn)溆?。Glu及總蛋白測

4、試盒購自南京建成生物工程研究所，批號為20041207；SABC試劑盒和兔抗大鼠GABA由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。1.3 儀器2 實驗方法2.1 模型制備采用王蕊等2的改進方法，將大鼠用3 %戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，仰臥固定在手術臺上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈（common caroAid arAeris，CCA），在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉（2.5 mg/kg），隨即用無創(chuàng)傷動脈夾夾閉雙側(cè)CCA10 min，共夾閉2次，每次間隔10 min，即采用2次缺血10 min、再灌10 min的方式。再通后傷口滴青霉素適量，縫合傷口，放回籠中，(2

5、7±0.5)溫度下飼養(yǎng)。在全部造模過程中用肛表密切測量大鼠肛溫，保持肛溫在37 左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。2.2 動物分組及處理從60只大鼠中隨機選出10只作為假手術組，假手術組只進行麻醉，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，但不阻斷CCA及腹腔注射硝普鈉。其余50只造模，手術過程由于損傷喉返神經(jīng)、出血過多、麻醉過量，死亡6只大鼠，術后兩天相繼死亡4只，余40只大鼠隨機分為模型組、通絡益智散大劑量組、通絡益智散小劑量組、尼莫地平對照組，每組10只。所有大鼠從造模后第7 d開始給藥，1日1次。假手術組與模型組予生理鹽水；通絡益智散大劑量相當于正常成人用量的20倍（濃度為3.14

6、 g/mL）；通絡益智散小劑量相當于正常成人用量的5倍（濃度為0.785 g/mL）；尼莫地平組給予尼莫地平懸濁液（相當于正常成人用量的20倍），給藥劑量均為0.01 mL/g，連續(xù)給藥21 d。2.3 標本采集和處理治療結束后第28 d，迅速開胸暴露心臟，從左心室插入導管至主動脈，于右心耳部剪一小口，用生理鹽水快速沖洗，直到右心房流出液清亮為止。洗畢將大鼠快速斷頭取腦，在冰盤上去除腦膜和血管，分離海馬稱重，放入玻璃勻漿器加9倍生理鹽水，在冰浴中勻漿，3000 r/min離心機離心10 min，取上清液予20 冰箱內(nèi)凍存待測。右半腦置于4 %多聚甲醛及0.1 mol/L磷酸緩沖液中固定72 h

7、后，取海馬常規(guī)脫水，石蠟包埋，冠狀連續(xù)切片（4 m），40 水溫展片，明膠處理的載玻片撈片后置于60 的烤箱內(nèi)烤23 h。2.4 Glu的檢測依據(jù)試劑盒說明書步驟，用7220分光光度計進行檢測。2.5 GABA的檢測（1）對石蠟切片進行免疫組織化學反應。脫蠟。滴加0.03 %H2O2的甲醇溶液(室溫)30 min以去除內(nèi)源性過氧化物酶，然后蒸餾水洗3次。熱源修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6.0)中，微波爐加熱至沸騰后斷電，間隔510 min，反復12次，冷卻后用PBS(pH 7.27.6)洗滌12次。用抗原修復液進一步暴露抗原：將抗原（稀釋1200）修復液滴加

8、在切片上,室溫10 min后，用PBS (pH 7.27.6)洗滌3次。在切片上滴加封閉液，室溫20 min，甩去多余的液體，不能沖洗。滴加稀釋的一抗兔IgG，放入冷藏室過夜。第二天取出切片，放置至室溫后，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各2 min。再滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 溫度下放置20 min，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各2 min。滴加試劑SABC，在2037 溫度下放置20 min，用PBS(pH 7.27.6)洗滌3次，各5 min。DBA顯色：使用DBA顯色試劑盒（AR1022），取1 mL蒸餾水加試劑盒中A、B、C試劑各一滴，混勻后切片。室溫顯

9、色，鏡下控制反應時間，一般在530 min。蘇木素輕度復染，脫水、透明、封片。取假手術組切片6張，用PBS代替一抗。（2）定量觀察：采用BI-2000圖像分析系統(tǒng)，于400倍放大條件下，在每張切片上隨機攝取5個視野，測陽性細胞的光密度值及灰度值，并做統(tǒng)計分析。2.6 統(tǒng)計學處理 所有實驗數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件處理，均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，各實驗組均數(shù)間的兩兩比較若方差齊則采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhanes T2 檢驗。3 實驗結果3.1 各組大鼠海馬勻漿中Glu含量的比較結果見表1。模型組與假手術組比較，模型組大鼠海馬區(qū)

10、Glu含量明顯升高（P0.01），說明造模成功；通絡益智散大、小劑量組Glu顯著低于模型組（P0.01），但與尼莫地平組比較無顯著性差異（P0.05），結果提示通絡益智散大、小劑量組能降低VD大鼠Glu含量，治療效果與尼莫地平相當。3.2 各組大鼠海馬齒狀回GABA表達的比較結果見表2。模型組與假手術組相比，GABA平均光密度在CA1區(qū)均明顯減少，平均灰度值升高（P0.01）；各治療組與假手術組比較，除小劑量組外，其他兩組GABA平均光密度在CA1區(qū)均顯著升高，平均灰度值顯著降低（P0.01）；各治療組GABA平均光密度較模型組均顯著增多（P0.01），升高幅度以尼莫地平、大劑量、小劑量的順序

11、依次降低。表1 通絡益智散對VD大鼠腦組織Glu含量的影響（略） 注：與假手術組比較P0.01；與模型組比較P0.01表2 大鼠海馬CA1區(qū)平均灰度值及平均光密度值（略） 注：與假手術組比較P0.01；與模型組比較P0.01；與尼莫地平組比較P0.054 討論谷氨酸（Glu）是人和哺乳動物腦內(nèi)含量最高的興奮性氨基酸(EAAs)，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞，在學習記憶、突觸可塑性、神經(jīng)元發(fā)育和退化等方面亦有重要的作用。但過量的Glu對神經(jīng)元有明顯的損傷作用，因此已被認為是內(nèi)源性興奮性毒素3。據(jù)文獻報道，其興奮毒性作用在急性腦缺血細胞凋亡、再灌注損傷和遲發(fā)性神經(jīng)元死亡中起重要作用。GABA被認為是

12、重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降低興奮性與神經(jīng)保護作用。因此，缺血再灌注后，Glu升高的同時如能出現(xiàn)GABA的釋放增高，這一過程則意味著可能建立對抗EAAs過量的保護機制4。本研究結果顯示:采用缺血再灌注制造的VD模型組大鼠海馬區(qū)Glu含量明顯高于假手術組(P0.01)，而GABA的表達則明顯低于假手術組(P0.01)；用藥后各組Glu含量降低，GABA表達增強。提示通絡益智散治療血管性癡呆的作用機制是：一方面通過降低海馬區(qū)興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量以減輕其興奮性神經(jīng)毒性作用；另一方面則通過增加海馬區(qū)抑制性氨基酸（IAAs）含量，以對抗EAAs的神經(jīng)毒性作用。因此，調(diào)節(jié)興奮性及抑制性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的平衡可能是通絡益智散治療血管性癡呆的機制之一。參考文獻：1王永炎.現(xiàn)代中醫(yī)臨床與研究血管性癡呆M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：255-259. 2王蕊,楊秦飛,唐一鵬,等.大鼠擬“血管性癡呆”模型的改進J.中國病理生理雜志,20