含酚焦化廢水降解酚菌的分離、純化與篩選實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、含酚焦化廢水降解酚菌的分離、純化與篩選學(xué) 院 環(huán)境與資源學(xué)院專(zhuān)業(yè) 環(huán)境工程 年級(jí) 2009級(jí) 姓 名 秦江濤 學(xué) 號(hào) 含酚焦化廢水降解酚菌的分離、純化與篩選 摘要 經(jīng)過(guò)適當(dāng)采樣，采用一定的技術(shù)分離、篩選出多種優(yōu)良的脫酚菌，然后觀(guān)察記錄其平板菌落特征，并通過(guò)革蘭氏染色確定菌種為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。關(guān)鍵詞 焦化廢水 降解酚菌 分離純化篩選我國(guó)80%的焦化廢水因含多環(huán)芳烴及雜環(huán)芳烴，經(jīng)生物處理后，二沉池出水難以達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。這類(lèi)物質(zhì)對(duì)常規(guī)生物處理系統(tǒng)中的微生物具有生物陌生性及毒性，很少在短時(shí)間內(nèi)被活性污泥中的微生物利用而進(jìn)入生物循環(huán)，有時(shí)還會(huì)使處理系統(tǒng)出現(xiàn)事故，造成微生物活性降低或大量中毒死

2、亡，導(dǎo)致活性污泥處理系統(tǒng)出水水質(zhì)惡化。我小組從含酚焦化廢水、活性污泥中篩選酚降解菌，并對(duì)酚降解菌進(jìn)行初步觀(guān)察，記錄菌種形態(tài)。以期將篩選菌與活性污泥混合，用于處理含酚焦化廢水。1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.微生物來(lái)源 試驗(yàn)所用菌種來(lái)源于某焦化廠(chǎng)廢水處理系統(tǒng)曝氣池中的活性污泥和含酚廢水，裝于無(wú)菌塑料瓶中，帶回實(shí)驗(yàn)室。置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2 培養(yǎng)基 分離純化用普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。篩選、馴化培養(yǎng)基選用液體培養(yǎng)液，見(jiàn)表1。成分MgSO4·7H2OK2HPO4無(wú)菌水pH(NH4 )2SO4含量0.3g0.3g7.07.20.3g1.3試劑苯酚，草酸銨結(jié)晶紫染液，碘液，95的酒精，番紅復(fù)染液，表1試

3、劑等。1.4 其他物品無(wú)菌水、無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌移液管、顯微鏡等。2 實(shí)驗(yàn)方案2.1倒平板法分離純化一般微生物在含苯酚培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，苯酚耐受菌株的篩選，可采用含不同濃度梯度的苯酚培養(yǎng)基倒平板。使大量菌種中的少數(shù)耐酚菌在平板的一定濃度苯酚的培養(yǎng)基上生成菌落，從而分離出耐酚菌種。（1）采集的泥樣，用無(wú)菌移液管取10ml接入事先已滅菌且內(nèi)裝90ml無(wú)菌水的三角瓶中振蕩20分鐘，目的是打散膠團(tuán)，使細(xì)菌成單細(xì)胞狀態(tài)分散于水中。（2）用無(wú)菌移液管分別移取一定量苯酚，與15ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒平板。制成含酚濃度為200 mg/L ，300 mg/L ，400 mg/L， 500 mg/L ，600 m

4、g/L，700 mg/L的培養(yǎng)基。編號(hào)為1，2，3，4，5，6號(hào)培養(yǎng)皿。（3）在6個(gè)培養(yǎng)基上分別接種等量的微生物， 涂布分離。（4）在30恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2.2 耐酚菌篩選與馴化 將分離純化的菌株接種到以苯酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中，篩選馴化出對(duì)含酚水適應(yīng)性強(qiáng)的菌種。并設(shè)置對(duì)照組。(1) 制作苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液，見(jiàn)表1，苯酚終濃度25mg/L、MgSO4.7H20終濃度0.3%，KH2PO4終濃度0.3%，(NH4 )2SO4終濃度0.3%。調(diào)7.07.2。(2) 根據(jù)6個(gè)培養(yǎng)基中微生物生長(zhǎng)情況，挑選有微生物生存的濃度最高的含酚培養(yǎng)基上的不同典型菌落接種到液體培養(yǎng)基上。(3) 30搖床振

5、蕩培養(yǎng)1d，使苯酚降解菌大量增殖，淘汰對(duì)酚不適應(yīng)的微生物；再添加苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液（苯酚終濃度增加至100mg/L），30振蕩培養(yǎng)1d；再流加苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液（苯酚終濃度增加至200mg/L）30振蕩培養(yǎng)1d，再提高到流加250mg/L苯酚無(wú)機(jī)培養(yǎng)液，30培養(yǎng)1d后從中選出對(duì)苯酚耐受力強(qiáng)的菌種。2.3 革蘭氏染色及菌種觀(guān)察 將分離出的菌種接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，觀(guān)察耐酚菌的平板菌落特征。觀(guān)察菌落形狀，大小，顏色，光澤，透明度邊緣形態(tài)等。做革蘭氏染色，鑒定菌種為革蘭氏陰性菌或革蘭氏陽(yáng)性菌。染色步驟：（1）初染 加草酸銨結(jié)晶紫一滴，約一分鐘，水洗。  （2）媒染 滴加碘液沖去殘水，并覆

6、蓋約一分鐘，水洗。  （3）脫色 將載玻片上面的水甩凈，并襯以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精剛剛不出現(xiàn)紫色時(shí)為止，約2030秒鐘，立即用水沖凈酒精。  （4）復(fù)染 用番紅液染12分鐘，水洗。  （5）鏡檢 干燥后，置油鏡觀(guān)察。革蘭氏陰性菌呈紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色。以分散開(kāi)的細(xì)菌的革蘭氏染色反應(yīng)為準(zhǔn)，過(guò)于密集的細(xì)菌，常常呈假陽(yáng)性。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論31分離純化結(jié)果不同酚濃度培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況有顯著差別。從 mg/L至 mg/L菌落數(shù)量依次減少。低酚濃度的培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況較好。有多種不同的典型菌落。3. 選馴化結(jié)果 取酚濃度為00 mg/L的培養(yǎng)基上不同典型

7、菌落的接種到以苯酚為唯一碳源的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng)結(jié)果，液體培養(yǎng)基與空白相比都渾濁狀，說(shuō)明有菌種生長(zhǎng)。33鏡檢結(jié)果將分離出的菌種接種到固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)，耐酚菌的平板菌落特征及革蘭氏染色結(jié)果如下：屬性菌落特征革蘭氏染色細(xì)胞特征假細(xì)胞菌屬白色透明，偏端單生或偏端生鞭毛陰性桿菌芽孢桿菌屬淡黃色，單生、對(duì)生和特征性的向幾個(gè)平面分裂形成不規(guī)則堆圓、四聯(lián)體或立方錐陰性球形動(dòng)膠菌屬黃色小圓點(diǎn)、半透明陽(yáng)性短桿短桿菌屬單個(gè)、成對(duì)或成短鏈排列，周生鞭毛陰性短桿微球菌屬中間一個(gè)無(wú)色透明小點(diǎn)，外面有透明圓暈，較大陰性球形34實(shí)驗(yàn)討論一般微生物在含苯酚培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)，苯酚耐受菌株的篩選，可采用含不同濃度梯度的苯

8、酚培養(yǎng)基倒平板。使大量菌種中的少數(shù)耐酚菌在平板的一定濃度苯酚的培養(yǎng)基上生成菌落，從而分離出耐酚菌種。在分離純化培養(yǎng)后，培養(yǎng)基中菌落生長(zhǎng)較好。低濃度酚培養(yǎng)基中菌落彼此重疊，連成一片，無(wú)法觀(guān)察菌落特征，因?yàn)?號(hào)培養(yǎng)基中苯酚濃度最低，故對(duì)其他菌抑制作用弱而使得雜菌大量生長(zhǎng)而2號(hào)培養(yǎng)基的苯酚濃度依次增大，故對(duì)苯酚耐受性弱的細(xì)菌因難以適應(yīng)培養(yǎng)基條件而死亡，因此培養(yǎng)基上有單個(gè)的菌落。為了鑒定并觀(guān)察分離出的耐酚菌，分別將不同菌落在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基以苯酚為唯一碳源進(jìn)行馴化，培養(yǎng)基中長(zhǎng)出細(xì)菌，說(shuō)明成功分離出降解酚的細(xì)菌。鏡檢表明： 耐酚菌有多個(gè)菌屬，革蘭氏陰性、革蘭氏陽(yáng)性都存在，有球菌和桿菌。有了該實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，可一步研究?jī)?yōu)良脫酚菌的脫酚效能受溫度、DO、pH、進(jìn)水氮磷負(fù)荷等因素的影響的情況。參考文獻(xiàn)1國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局2002中國(guó)環(huán)境狀況公報(bào)R2002：3102ujang Z，Buekley CWater and Wastewater in Developing Country：P