用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)石蠟標(biāo)本中的麻風(fēng)菌DNA以提高PB

1、用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)石蠟標(biāo)本中的麻風(fēng)菌DNA以提高PB患者的確診水平溫溫 艷艷* *1 1 楊榮德楊榮德 2 2 譚福躍譚福躍2 2 邢邢 燕燕1 1 袁聯(lián)朝袁聯(lián)朝 1 1 李桓英李桓英1 1 1 1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院 北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所北京熱帶醫(yī)學(xué)研究所 100050100050 2 2 云南省文山州皮膚病防治所云南省文山州皮膚病防治所 6630006630001873，麻風(fēng)病是由感染麻風(fēng)桿菌造成的慢性傳染病,挪威 A. Hansen.從病人組織中發(fā)現(xiàn)麻風(fēng)菌1943，氨苯砜類(lèi)藥物用于麻風(fēng)病的治療1958，WHO 成立了麻風(fēng)防治機(jī)構(gòu),全球麻風(fēng)病控制工

2、作統(tǒng)一計(jì)劃1981，WHO 推薦聯(lián)合化療方案.麻風(fēng)病麻風(fēng)病 麻風(fēng)菌在人體感染的過(guò)程麻風(fēng)菌在人體感染的過(guò)程卜亞臨床感染亞臨床感染無(wú)臨床癥狀無(wú)臨床癥狀自我痊愈自我痊愈過(guò)程MBPBLLLLBLBLB BB BBTBTTTTT 亞臨床階段亞臨床階段 中間發(fā)展過(guò)程中間發(fā)展過(guò)程 臨床變化臨床變化 分型分型 目前麻風(fēng)已經(jīng)不再是一種災(zāi)難。1985年，122個(gè)國(guó)家中520萬(wàn)人感染此??；1991年WHO提出：到2000年消除麻風(fēng)作為一個(gè)公共衛(wèi)生問(wèn)題，指標(biāo)為：1/10000，世界范圍總數(shù)少于6000000個(gè)病例；2005年，全球麻風(fēng)病人降到3000000，目前，2000000病人，這主要?dú)w功于1980年推廣的MDT

3、聯(lián)合化療。存在問(wèn)題存在問(wèn)題 全球麻風(fēng)病每年病人數(shù)徘徊不變，在過(guò)去的8年，非洲、美洲和亞洲每年超過(guò)200000病人，提示：麻風(fēng)病的傳播沒(méi)有阻斷，主要障礙是在哪里發(fā)生和如何傳播的信息不清楚；不能有效的早期診斷病人。Screening T Tests sS o u r c eNo. RegisterededEffective DateEnglishChineseMicroscopyDiagnos stic Criterion for L Leprosy 2008.01-16WS 291-2008WS 291-20082008-01-162008-01-16Slit Skin Smear &

4、& Acid-fast stainingMinistry of Public Health, Beijing, BeijingHisto-pathologySkin Biopsy in Leprosy, , D.S. Ridley, , CIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandCIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandThird Edition,1990,19901990Leprosy ELISAIDRI, , Seattle, WA98104I-I-AS-0052010-12-0 06aWhole Blood (IFN-r

5、) AssayIDRI, Seattle, , W WA98104I-AS-0062006-0 01-0 05 bELISPOTT-SPOT.TB, Oxford Immunotec TH-TB-UK-V42008-04Nested-PCRThomas M.S., , J. Clin. Microbiol, 1990, 1990 Wen Yan, , Am. J. Trop. Med. Hyg., , 20132013 pp p. 1913-1917i in press2011-11-0 06Real Time PCRTruman RW, , PLoS Negl Trop Dis, 2008

6、2008 2(11):e3282(11):e3282012-10-22麻風(fēng)病早期診斷的麻風(fēng)病早期診斷的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)平臺(tái)研究背景麻風(fēng)病診斷：病理組織檢查和抗酸染色結(jié)合臨床檢查；病理學(xué)檢查包括病原學(xué)檢查抗酸菌（ AFB）、組織中病理變化；然而常規(guī)病理學(xué)檢查（HE）存在特異性、敏感性不足，特別是對(duì)查菌陰性、病理表現(xiàn)為非特異性改變的患者。 PCR技術(shù)用于皮損活檢和組織液的檢測(cè)，可檢出新鮮未固定組織標(biāo)本中的微量麻風(fēng)菌DNA，對(duì)早期和疑難病例的診斷有潛在優(yōu)勢(shì)。研究背景本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了Nested PCR和real time PCR方法：Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian

7、-Chao, Rong De Yang，F(xiàn)u Yue Tan,Ying Zhang and Li Huan-Ying. Application of RLEP Real Time PCR for detection of M.leprae DNA in Paraffin-embedded Skip Biopsy Specimens for Diagnosis of Paucibacillary leprsy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 90(3), 2014, 524529Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian-Chao, Liu Jian, Ying

8、Zhang and Li Huan-Ying. Whole-Blood Nested-PCR Amplification of M. leprae-Specific DNA for Early Diagnosis of Leprosy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 88(5), 2013, 918922 楊榮德，譚福躍，邢燕，劉健，溫艷，李桓英。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)石蠟標(biāo)本中麻風(fēng)菌DNA 中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志 2013，29（7）目的將real time PCR方法應(yīng)用于臨床初步診斷PB麻風(fēng)病患者的石蠟標(biāo)本；為形態(tài)學(xué)和臨床的麻風(fēng)病診斷提供參考依據(jù)；檢測(cè)早期和疑似麻風(fēng)病例，提

9、高對(duì)早期麻風(fēng)的診斷水平。研究對(duì)象MDT治療前后的皮損組織石蠟包埋標(biāo)本92例；BL型麻風(fēng)患者石蠟標(biāo)本2008年和2013年分別為7例和8例，共15例；2012年以來(lái)陸續(xù)收集70例臨床診斷PB麻風(fēng)病患者的石蠟包埋組織標(biāo)本。DNA提取 石蠟包埋組織標(biāo)本的DNA提取。 切厚度為8-10m 的石蠟組織10片，放入1.5ml 離心管中,為了防止標(biāo)本之間的交叉污染，在切不同的石蠟組織時(shí)，先用1摩爾的氫氧化鈉，再用75%酒精擦洗切片刀。提取DNA的過(guò)程嚴(yán)格按照DNeasy Blood & Tissue kit試劑盒（QIAGEN，Cat. NO.69504）操作手冊(cè)進(jìn)行，脫蠟選用Deparaffini

10、zation Solution 試劑盒（QIAGEN， Cat. NO.19093）。建立real time PCR 使用Taqman探針通用PCR試劑盒(ABI, P/N 4304437)。 PCR循環(huán)條件為95變性15秒，60退火/延伸60秒，共40個(gè)循環(huán)，之前包括50 2分鐘和95變性10分鐘。 在ABI，Prismer 7500型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）上進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)以及數(shù)據(jù)的采集與分析，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為101bp。 Real time PCR結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)曲線及每個(gè)檢測(cè)標(biāo)本均做復(fù)孔；初步確定取15Ct35作為陰陽(yáng)性分析結(jié)果界定值。(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒

11、光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）結(jié)果 the RLEP real-time PCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線Ten to 107 copies of the plasmid DNA were used for standard curve preparation Ct = -3.44log + 36.65; R2 = 0.9995. Amplification Curve: A: 107 copies /l plasmid; B: 106 copies /l plasmid; C: 105 copies /l plasmid; D: 104 copies /l plasmid; E: 103 copie

12、s /l plasmid; F: 102 copies /l plasmid; G: 10 copies /l plasmid.檢測(cè)結(jié)果-已確診的麻風(fēng)病患者石蠟標(biāo)本real time PCR檢測(cè)結(jié)果-臨床初步診斷PB和I型麻風(fēng)病石蠟包埋組織標(biāo)本討論 本研究對(duì)70例臨床初步診斷PB和未定類(lèi)麻風(fēng)病患者的石蠟標(biāo)本采用real time PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率為 71.4%（50/70），病理檢測(cè)陽(yáng)性率為 51.4%（36/70），兩者有顯著性差異，p 0.05。BT和TT患者中查菌陰性的和未定類(lèi)患者real time PCR檢測(cè)陽(yáng)性率均達(dá)66.7%，而病理檢測(cè)陽(yáng)性率分別為60%、22.2%和44.4%，顯然對(duì)查菌陰性患者的輔助診斷價(jià)值較高；國(guó)外報(bào)告了60%-70%的顯微鏡檢AFB陰性的標(biāo)本PCR結(jié)果陽(yáng)性，本試驗(yàn)得到了相似的結(jié)果；Real time PCR使用RLE