生物工程的滅菌技術(shù)

1、生物工程的滅菌技術(shù)麥浩榮(廣東省石油化工設(shè)計(jì)院 廣州 510130) 摘要：本文重點(diǎn)介紹了發(fā)酵工程中培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備、物料和空氣管道的滅菌技術(shù)，確保達(dá)到無(wú)菌要求，滿(mǎn)足純種發(fā)酵。并且對(duì)閥門(mén)的選用做了簡(jiǎn)單的介紹。 關(guān)鍵詞：發(fā)酵、滅菌、無(wú)菌一 前言 生物工程是當(dāng)代科技的高新技術(shù)，是21世紀(jì)最具發(fā)展?jié)摿Φ漠a(chǎn)業(yè)。生物工程最大的特點(diǎn)在于充分利用生物物質(zhì)資源，節(jié)約能源，易于實(shí)現(xiàn)潔凈生產(chǎn)，而且可以實(shí)現(xiàn)一般化工技術(shù)難于實(shí)現(xiàn)的化工過(guò)程。本人參與一項(xiàng)生物工程的設(shè)計(jì)工作，該工程是根據(jù)科研成果直接設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)化為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)裝置。所生產(chǎn)的產(chǎn)品為透明質(zhì)酸聚合物(PHA),為生物可降解塑料產(chǎn)品的添加劑。設(shè)計(jì)主要是根據(jù)中試結(jié)果

2、進(jìn)行放大設(shè)計(jì)。該生物工程包括配料、發(fā)酵、絮凝、壓濾、造粒、提取、產(chǎn)品干燥回收、溶劑回收等工序。其中配料與發(fā)酵屬于生物工程，而絮凝及后面的工序?qū)儆诨瘜W(xué)工程。這里主要介紹發(fā)酵工程的滅菌技術(shù)。常用的發(fā)酵工藝流程圖見(jiàn)圖1所示。圖1 典型的微生物分批培養(yǎng)工藝流程圖二滅菌技術(shù) 生物化學(xué)工程是運(yùn)用化學(xué)工程的原理和方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室所取得的生物技術(shù)成果加以開(kāi)發(fā)，使之成為生物反應(yīng)過(guò)程的一門(mén)科學(xué)，是以活的細(xì)胞為催化劑或由細(xì)胞提出來(lái)的酶為催化劑的反應(yīng)過(guò)程。所以必須進(jìn)行純種培養(yǎng)，也就是只允許生產(chǎn)菌存在和生長(zhǎng)繁殖，不允許其他微生物共存。因?yàn)樯锓磻?yīng)系統(tǒng)中通常會(huì)含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，易受雜菌污染，會(huì)產(chǎn)生以下不良的后果： 如果受到

3、雜菌污染，會(huì)使生物反應(yīng)基質(zhì)或產(chǎn)物因雜菌消耗而損失，造成生產(chǎn)能力下降； 由于雜菌產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，或者雜菌改變了發(fā)酵液的某些理化性質(zhì)，使產(chǎn)物的提取變得困難，造成收得率降低或使產(chǎn)品質(zhì)量下降； 污染的雜菌大量繁殖，會(huì)改變反應(yīng)介質(zhì)的pH值，從而使生物反應(yīng)發(fā)生異常變化； 發(fā)生的噬菌體污染，使生產(chǎn)菌細(xì)胞裂解，而使生產(chǎn)失敗等等。所以整個(gè)發(fā)酵過(guò)程必須強(qiáng)調(diào)無(wú)菌操作，牢固確立無(wú)菌觀念。除了設(shè)備應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定要求，保證沒(méi)有死角，沒(méi)有構(gòu)成感染可能的因素外，必須對(duì)培養(yǎng)基和生產(chǎn)環(huán)境進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌和消毒，防止雜菌和噬菌體污染，達(dá)到無(wú)菌要求。必須注意幾方面：菌體無(wú)雜菌，培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備管路徹底滅菌，設(shè)備嚴(yán)密，空氣滅菌。 2.

4、1培養(yǎng)基滅菌 培養(yǎng)基滅菌是指從培養(yǎng)基中殺滅有生活能力的細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)體及其孢子，或從中除去之。工業(yè)規(guī)模上的液體培養(yǎng)基滅菌，殺滅雜菌比除去雜菌更為常用，其中熱滅菌最為簡(jiǎn)便、有效和經(jīng)濟(jì)。 對(duì)于液體培養(yǎng)基的熱滅菌，工程上所要解決的課題是：將培養(yǎng)基中的雜菌總數(shù)N0殺滅到可以接受的總數(shù)的N，需要多高的溫度，多長(zhǎng)的時(shí)間為合理，這決定與雜菌孢子的熱死滅動(dòng)力學(xué)，反應(yīng)器的形式和操作方法，還決定于培養(yǎng)基中有效成分受熱破壞的可接收范圍。2.1.1 分批滅菌微生物受熱被殺死，主要原因是高熱能使蛋白質(zhì)變性。這種反應(yīng)屬于單分子反應(yīng)，死亡速率可視為一級(jí)反應(yīng)，即與殘存的微生物數(shù)量成正比。即： -dv/dt=kN (2.1) 式中N

5、為任一時(shí)刻的活細(xì)菌濃度，個(gè)/L；t為時(shí)間，min；k為比熱死速率常數(shù)，min-1。對(duì)式(2.1)積分，取邊界條件t0=0,N=N0，得：lnN/ N0=-kt 或 N= N0e-kt (2.2)維持滅菌溫度T不變，經(jīng)歷不同的滅菌時(shí)間，檢測(cè)相應(yīng)的N 按lnN/ N0對(duì)t作圖，如圖2 所示。直線的斜率為k，k除了決定與菌體的抗熱性能之外，還明顯地受滅菌溫度T的影響。圖2 大腸桿菌的失活細(xì)菌孢子的熱滅動(dòng)力學(xué)與營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞的有所不同。如圖3所示。 圖3 嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱死速率從圖3可以推測(cè)，細(xì)菌孢子壁具有較大的熱阻。但霉菌孢子的熱阻比細(xì)菌的小的多(見(jiàn)表1)，這可能與孢子壁的化學(xué)成分及結(jié)構(gòu)有關(guān)。當(dāng)

6、溫度超過(guò)120時(shí)，熱阻極強(qiáng)的嗜熱脂肪芽孢桿菌孢子的熱死滅動(dòng)力學(xué)也接近與一級(jí)反應(yīng)規(guī)律。表1 典型發(fā)酵環(huán)境中各種微生物對(duì)溫?zé)釡缇南鄬?duì)熱阻生物體種類(lèi)相對(duì)熱阻營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和酵母1.0細(xì)菌孢子3x106霉菌孢子210病毒與噬菌體15由表1 可以得知，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌必須以細(xì)菌孢子為殺滅對(duì)象。營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞易于受熱死亡，表明其熱死速率常數(shù)k值很高，在120滅菌，其k值可大至1010(min-1)數(shù)量級(jí)，而細(xì)菌孢子的k值在120時(shí)只有100數(shù)量級(jí)。k除了決定菌體的種類(lèi)及存在形式外，還是溫度T的函數(shù)。由于微生物的熱死滅接近于化學(xué)反應(yīng)的一級(jí)動(dòng)力學(xué)，因此，比熱死滅速率常數(shù)k與滅菌溫度常數(shù)T的關(guān)系可用阿累尼烏斯方程來(lái)表示。

7、即k=Ae-E/RT （2.3）或 lnk=lnA-E/RT （2.4）式中A為頻率因子，s-1, E是死亡活化能，J/mol；R為通用氣體常數(shù)，J/mol·K。對(duì)式（2.4）兩邊求導(dǎo)，得dlnk/dT=E/RT2 （2.5）由式（2.5）可知，反應(yīng)的E愈高，lnk對(duì)T的變化率愈大，亦即T的變化對(duì)k的影響愈大。培養(yǎng)基滅菌既要?dú)⑺离s菌的孢子，又要保存其中的有效成分。試驗(yàn)證明，細(xì)菌孢子熱死滅反應(yīng)的E很高，而有些有效成分熱破壞反應(yīng)的E較低，因而提高滅菌溫度T會(huì)加快細(xì)菌孢子的死亡速率，從而縮短高溫下的滅菌時(shí)間，由于其他有效成分的熱破壞E很低，溫度提高只能稍為增大其熱破壞程度，但滅菌時(shí)間的顯著

8、縮短，其結(jié)果是有效成分的破壞量反而大為減少。2.1.2 分批滅菌設(shè)計(jì)工程上要求絕對(duì)無(wú)菌是不可能的，但只要是培養(yǎng)基中的雜菌減低到合理的程度就可以了。對(duì)于周期長(zhǎng)，成本高的發(fā)酵，常取滅菌后一罐培養(yǎng)基中殘存的活菌孢子數(shù)N=10-3個(gè)，即滅菌103次，存活一個(gè)活菌孢子的機(jī)會(huì)為1次。N/N0是滅菌程度指標(biāo)，不同的發(fā)酵體系有不同的N/N0。在分批滅菌中，為計(jì)算方便，取ln N0/N為設(shè)計(jì)依據(jù)，如培養(yǎng)基1000m3，含菌106個(gè)/ml，要求滅菌后，活菌數(shù)N=10-3個(gè)。則N/N0=10-3/(1000x106x106)=10-18lnN/N0=41.45分批滅菌也稱(chēng)實(shí)罐滅菌，全過(guò)程包括升溫、保溫、降溫三個(gè)階段

9、。三個(gè)階段分別對(duì)孢子的死滅和培養(yǎng)基中有效成分的破壞做出大小不同的貢獻(xiàn)。其典型的T-t圖如圖4。滅菌主要在保溫過(guò)程實(shí)現(xiàn)，但升溫的后期和冷卻的初期培養(yǎng)基的溫度高，因而亦有一定的滅菌效果。圖4 分批滅菌時(shí)典型的溫度變化孢子受熱死亡規(guī)律符合-dv/dt=kN，故 lnN0/N=kt； lnN0/N=lnN0/N1+ lnN1/N2+ lnN2/NlnN0/N是由三塊面積lnN0/N1，lnN1/N2，lnN2/N合成的?？梢院侠碓O(shè)計(jì)這三塊面積的大小，使其和等于lnN0/N的預(yù)定值。然而分批滅菌的T-t過(guò)程不是任意給定的。它取決于加熱方式，換熱面積的大小，傳熱系數(shù)的高低，換熱介質(zhì)的溫度培養(yǎng)基的質(zhì)量等諸多

10、因素。要盡可能加快換熱速度，以盡可能縮短升溫和冷卻的時(shí)間，延長(zhǎng)保溫時(shí)間，以達(dá)到細(xì)菌孢子的殺滅和培養(yǎng)基中有效成分的最大保留。在本設(shè)計(jì)中，一、二級(jí)種子罐滅菌是采用實(shí)罐滅菌的方式來(lái)進(jìn)行的。2.1.3 連續(xù)滅菌連續(xù)滅菌的加熱、保溫和冷卻三個(gè)階段是分別在不同的專(zhuān)有設(shè)備中進(jìn)行。由于培養(yǎng)基能在短時(shí)間內(nèi)加熱到保溫溫度，并能很快被冷卻。因此，可在比分批滅菌更高的溫度下滅菌，滅菌時(shí)間縮短，這有利于減少營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的破壞。連續(xù)滅菌所用蒸汽壓力一般高于5x105Pa(表壓)。圖5、圖6兩種基本的滅菌裝置。圖5是由管式或板式換熱器把培養(yǎng)基間接加熱和冷卻；圖6則用蒸汽把培養(yǎng)基加熱到滅菌溫度，經(jīng)保溫后，再進(jìn)行閃急冷卻。圖5 板

11、式熱交換器連續(xù)滅菌裝置圖6 蒸汽噴射連續(xù)滅菌裝置第一種方式的特點(diǎn)是單位體積的熱交換器具有較高的傳熱面積，且可根據(jù)生產(chǎn)需要，改變其換熱面積的大小。第二種方式是用蒸汽直接噴射物料，被加熱的物料通過(guò)保溫，最后用閃急膨脹法冷卻。其特點(diǎn)是加熱、冷卻極為短暫，缺點(diǎn)是培養(yǎng)基被蒸汽的冷凝水稀釋。在本設(shè)計(jì)里，培養(yǎng)基的滅菌采用了以上兩種方式的組合形式，并加以改進(jìn)，流程見(jiàn)圖7。圖7 配料液連續(xù)滅菌流程圖1，4板式換熱器；2連消塔；3維持罐在該流程中，蒸汽直接通進(jìn)連消塔，使配料液的溫度迅速提高，并在維持罐內(nèi)保溫，既縮短了滅菌時(shí)間，也省去了閃急冷卻裝置。2.2 空氣除菌在發(fā)酵過(guò)程中，微生物的生長(zhǎng)和繁殖需要大量的氧氣，這

12、就需要輸入大量的空氣來(lái)提供氧氣。在空氣中的微生物多為細(xì)菌、細(xì)菌孢子，也有真菌、酵母和病毒。其大小從幾個(gè)微米到幾百微米不等(表2)，小的微生物附在空氣中的灰塵上，灰塵的平均尺寸約為0.1m。粗濾器可將粗的微粒除去，0.52.0m的微粒及細(xì)菌微生物由空氣過(guò)濾器除去。表2空氣中細(xì)菌及細(xì)菌孢子的代表種類(lèi)菌種寬，m長(zhǎng)，m產(chǎn)氣氣桿菌1.01.51.02.5蠟狀芽孢桿菌1.32.08.125.8地衣芽孢桿菌0.50.71.83.3巨大芽孢桿菌0.92.12.010.0枯草芽孢桿菌0.51.11.64.8金黃小球菌0.51.01.03.0普通變性桿菌0.61.20.91.7空氣中微生物的數(shù)量與溫度及其他環(huán)境條

13、件有關(guān)。城市空氣中的微生物密度比農(nóng)村和山區(qū)高。空氣中微生物數(shù)量級(jí)為103104微粒/m3,每提高2.5m，空氣中的微粒數(shù)可減少一個(gè)數(shù)量級(jí)。2.2.1 空氣除菌方法加熱滅菌 雖然細(xì)菌孢子耐熱性很強(qiáng)，但在較高的溫度時(shí)也能使之破壞?？梢岳每諝獗粔嚎s時(shí)所產(chǎn)生的熱來(lái)滅菌，為了保證壓縮后的空氣具有較高的溫度，在壓縮空氣出口管包裹保溫層。在單級(jí)絕熱壓縮機(jī)(3kg/cm2)運(yùn)轉(zhuǎn)時(shí)，吸進(jìn)的空氣為20或27時(shí)，則壓縮后出口空氣的溫度分別上升到150或270。這種滅菌方法必須保持有足夠的滅菌時(shí)間，為了徹底除菌，必須在罐前安裝一個(gè)空氣過(guò)濾器。輻射滅菌 波長(zhǎng)226.5328.7mm的紫外線對(duì)空氣中微生物的殺菌效力最強(qiáng)

14、。但設(shè)備投資高，在發(fā)酵工業(yè)中還很少應(yīng)用。化學(xué)滅菌 使空氣在殺菌劑溶液中通過(guò)或噴灑于空氣中的微生物，但必須除去帶殺菌劑的水氣和霧后才能應(yīng)用，工業(yè)生產(chǎn)中也很少應(yīng)用。靜電除塵 靜電除塵的特點(diǎn)是能量消耗少，空氣的的壓頭損失小，約為4002000Pa；對(duì)1m的塵粒捕集效率可達(dá)99%以上。缺點(diǎn)是設(shè)備龐大。介質(zhì)過(guò)濾 發(fā)酵工業(yè)制備無(wú)菌空氣廣泛采用纖維過(guò)濾器。在本工程設(shè)計(jì)中，就是采用玻璃纖維過(guò)濾器加金屬過(guò)濾器來(lái)制備無(wú)菌空氣。2.2.2 空氣除菌流程比較理想的空氣除菌流程應(yīng)具備以下特點(diǎn)。高空采風(fēng)，吸氣風(fēng)管設(shè)置在工廠上風(fēng)向高2030m處，減少吸入空氣的細(xì)菌含量。在空壓機(jī)空氣入口處安裝中效或高效前置過(guò)濾器，以減輕總過(guò)

15、濾器的負(fù)荷。采用無(wú)油潤(rùn)滑壓縮機(jī)，減少壓縮后空氣中的油霧污染，壓縮機(jī)后采用冷卻型的空氣儲(chǔ)罐，可降低空氣的溫度，同時(shí)除去部分潤(rùn)滑油。采用二級(jí)冷卻二級(jí)旋風(fēng)分離器，使油水分離較完全。采用旋風(fēng)金屬網(wǎng)除霧器，除去空氣中的霧滴。用蒸汽加熱器將空氣加熱至約50，使空氣的相對(duì)濕度低于60%，再進(jìn)入總過(guò)濾器以保證總過(guò)濾器維持干燥狀態(tài)。空氣經(jīng)總過(guò)濾器后進(jìn)入分過(guò)濾器，再進(jìn)入發(fā)酵罐，空氣的除菌程度達(dá)到99.999%。圖8是一個(gè)典型的除菌流程，在本設(shè)計(jì)中基本上采用該流程。圖8 兩級(jí)冷卻、加熱除菌流程圖1粗過(guò)濾器；2壓縮機(jī)；3貯罐；4，6冷卻器；5旋風(fēng)分離器；7絲網(wǎng)分離器，8加熱器；9總過(guò)濾器三閥門(mén)的選用發(fā)酵罐物料輸送閥門(mén)

16、的要求甚嚴(yán)，既要保證運(yùn)行時(shí)絕對(duì)不漏，否則將造成整批物料的染菌，同時(shí)要承受定期蒸汽滅菌高溫的影響。為了使管道上死角降低到最低限度，有些廠家為發(fā)酵工程設(shè)計(jì)了專(zhuān)用的抗生素二通道閥門(mén)(見(jiàn)圖9)，用于發(fā)酵罐的空氣、物料、排氣和蒸汽管道的開(kāi)啟、切斷和調(diào)節(jié)。該二通閥可根據(jù)顧客要求在閥門(mén)中開(kāi)設(shè)排氣口。在本設(shè)計(jì)中，對(duì)抗生素閥門(mén)進(jìn)行了改動(dòng)。采用不銹鋼隔膜閥，在閥的底部?jī)啥烁鏖_(kāi)一個(gè)排氣閥(見(jiàn)圖10)。這種閥在通蒸汽消毒的時(shí)候就更加靈活了，可以分別控制閥門(mén)兩側(cè)管道的消毒。隔膜閥有幾個(gè)特點(diǎn)：僅有閥體和隔膜與物流接觸，其他部分全部隔離，可用蒸汽對(duì)閥門(mén)進(jìn)行徹底滅菌；具有自身排凈能力；可在線維修；管徑范圍大（DN80DN15

17、0）,基本滿(mǎn)足生物工程領(lǐng)域的需要。由于隔膜閥中的隔膜在滅菌過(guò)程中要長(zhǎng)時(shí)間與蒸汽接觸，使其成為隔膜閥的薄弱環(huán)節(jié)。不過(guò)近年來(lái)，隔膜的穩(wěn)定性和使用壽命的提高，現(xiàn)在隔膜閥已經(jīng)是生物工程領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的閥門(mén)。在生物工程使用較多的還有球閥和蝶閥。球閥具有啟閉迅速，但由于閥芯無(wú)法徹底滅菌，故只能應(yīng)用在一些潔凈度不高的管線上。不銹鋼衛(wèi)生級(jí)蝶閥具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，外形尺寸小，重量輕的優(yōu)點(diǎn)，但由于密封材料的原因，最高使用溫度一般不超過(guò)100。四 結(jié)語(yǔ)在本工程設(shè)計(jì)中，對(duì)培養(yǎng)基及有關(guān)設(shè)備、物料和空氣管道各環(huán)節(jié)的滅菌消毒都參照了比較成熟的工藝，并根據(jù)其他一些廠家的實(shí)際使用經(jīng)驗(yàn)作出一些改進(jìn)。該廠已經(jīng)處于試產(chǎn)階段。經(jīng)過(guò)多次投料

18、生產(chǎn)，均無(wú)發(fā)生染菌現(xiàn)象。因此該設(shè)計(jì)滿(mǎn)足發(fā)酵過(guò)程達(dá)到無(wú)菌要求，做到了純種發(fā)酵，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量和數(shù)量。參考文獻(xiàn)：1. 化學(xué)工程師技術(shù)全書(shū) 上冊(cè) 2002.3. 化學(xué)工業(yè)出版社2. 化工工藝設(shè)計(jì)手冊(cè) 上冊(cè) 2003.8. 化學(xué)工業(yè)出版社3. 酶制劑工廠中管道和閥門(mén)的設(shè)計(jì) 化工設(shè)計(jì)2002年第2期4. 味精工業(yè)手冊(cè) 1995.4. 中國(guó)輕工業(yè)出版社Killing germ technology of biology engineering Mai Haorong(Guangdong Petrochemical Engineering Design Institute Guangzhou 510130)AbstractThis paper emphasizes on the killing germ technology of the cul