資料-多糖含量測(cè)定的各種方法優(yōu)缺點(diǎn)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上苯酚-硫酸法測(cè)多糖含量一、原理多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測(cè)定。二、試劑1、濃硫酸：分析純，95.5% 2、80%苯酚：80克苯酚（分析純重蒸餾試劑）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 3、6%苯酚：臨用前以80%苯酚配制。（每次測(cè)定均需現(xiàn)配） 4、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Dextran,Pharmacia）或分析純葡萄糖。 5、15%三氯乙酸（15%TCA）：15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 6、5%三氯乙酸（5%TCA）：25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。 7

2、、6mol/L 氫氧化鈉：120克分析純氫氧化鈉溶于500ml水。 8、6mol/L 鹽酸三、操作1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確稱(chēng)取標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，各以蒸餾水補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml，搖勻冷卻，室溫放置20分鐘以后于490nm測(cè)光密度，以2.0ml水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為多糖微克數(shù)，縱坐標(biāo)為光密度值，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、樣品含量測(cè)定1）取樣品1克（濕樣）加1ml 15%TCA溶液研磨，再加少許5TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升離心管中，再

3、加少許5TCA溶液研磨，倒上清液，重復(fù)3次。最后一次將殘?jiān)黄鸬饺腚x心管。注意：總的溶液不要超出10毫升。（既不要超出離心管的容量）。 2）離心，轉(zhuǎn)速3000轉(zhuǎn)/分鐘，共三次。第一次15分鐘，取上清液。后兩次各5分鐘取上清液到25毫升錐形比色管中。最后濾液保持18毫升左右。3）水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之后搖勻，在96水浴鍋中水浴2小時(shí)。 4）定容取樣。水浴后，用流水冷卻后加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液，以蒸餾補(bǔ)至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鐘以后于490nm測(cè)光密

4、度。每次測(cè)定取雙樣對(duì)照。以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。四、注意1、此法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重復(fù)性好，對(duì)每種糖僅制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，顏色持久。 2、制作標(biāo)準(zhǔn)線宜用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)多糖，如用葡萄糖，應(yīng)以校正系數(shù)0.9校正g數(shù)。 3、對(duì)雜多糖，分析結(jié)果可根據(jù)各單糖的組成比及主要組分單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線的校正系數(shù)加以校正計(jì)算。 4、測(cè)定時(shí)根據(jù)光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.10.3之間。比如：小于0.1之下可以考慮取樣品時(shí)取2克，仍取0.2ml樣品液，如大于0.3可以減半取0.1ml的樣品液測(cè)定，即可無(wú)礙。蒽酮-硫酸比色法測(cè)定多糖含量 一、實(shí)驗(yàn)原理 糖類(lèi)在較高溫度下可被濃硫酸作用而脫水生成糠醛或

5、羥甲基糖醛后，與蒽酮（C14H10O）脫水縮合，形成糠醛的衍生物呈藍(lán)綠色。該物質(zhì)在620nm處有最大吸收，在150µg/mL范圍內(nèi)，其顏色的深淺與可溶性糖含量成正比。該法有很高的靈敏度，糖含量在30µg左右就能進(jìn)行測(cè)定。 二、試劑器材 1、蒽酮試劑：精密稱(chēng)取0.1g蒽酮，加80%濃H2SO4100mL使溶解，搖勻。當(dāng)日配制使用； 2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：將無(wú)水葡萄糖置于五氧化二磷干燥器中，12hr后精密稱(chēng)取100mg，用蒸餾水定容至100ml； 3、其他器材：分析天平、分光光度計(jì)、容量瓶（100ml、50ml、10ml）、燒杯、具塞試管、移

6、液器、移液器吸頭、渦旋振蕩器和廢液缸等。 三、 操作步驟 1、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取7支具塞試管，按下表數(shù)據(jù)精密配制一系列不同濃度的葡萄糖溶液，每個(gè)濃度做23個(gè)重復(fù)：管號(hào)0123456標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液/mL00.20.40.60.81.01.2蒸餾水/mL2.01.81.61.41.21.00.8在每支試管中立即加入蒽酮試劑6mL，振蕩混勻，各管加完后一起置于沸水浴中加熱15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15min。 在625nm波長(zhǎng)下以第1管為空白，迅速測(cè)定其余各管吸光值。 以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪

7、制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2、樣品的測(cè)定 將樣品溶液糖濃度調(diào)整到測(cè)定范圍，精確吸取2mL置于干燥潔凈試管中，在每支試管中立即加入蒽酮試劑6mL，振蕩混勻，各管加完后一起置于沸水浴中加熱15min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15min，每個(gè)濃度做23個(gè)重復(fù)。 在625nm波長(zhǎng)下迅速測(cè)定各管吸光值。根據(jù)葡萄糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由樣品溶液吸光值計(jì)算各樣品溶液中糖的濃度，并計(jì)算其糖含量。 四、注意事項(xiàng) 該法的特點(diǎn)是幾乎可測(cè)定所有的碳水化合物，不但可測(cè)定戊糖與已糖，且可測(cè)所有寡糖類(lèi)和多糖類(lèi)，包括淀粉、纖維素等（因?yàn)榉磻?yīng)液中的濃硫酸可把多糖水解成單糖而發(fā)生反應(yīng)），所以用

8、蒽酮法測(cè)出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。 在沒(méi)有必要細(xì)致劃分各種碳水化合物的情況下，用蒽酮法可以一次測(cè)出總量，省去許多麻煩，因此，有特殊的應(yīng)用價(jià)值，但在測(cè)定水溶性碳水化合物時(shí)，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，否則會(huì)因?yàn)榧?xì)胞壁中的纖維素、半纖維素等與蒽酮試劑發(fā)生反應(yīng)而增加了測(cè)定誤差。 不同的糖類(lèi)與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺，故測(cè)定糖的混合物時(shí)，常因不同糖類(lèi)的比例不同造成誤差，但測(cè)定單一糖類(lèi)時(shí)則可避免此種誤差。多糖含量的測(cè)定一、原理分子量大于10,000道爾頓的多糖經(jīng)80%乙醇沉淀

9、后，加入堿性銅試劑，選擇性地從其他高分子物質(zhì)中沉淀出葡聚糖，沉淀部分與苯酚-H2SO4反應(yīng)，生成有色物質(zhì)，在485nm條件下，有色物質(zhì)的吸光度值與葡聚糖濃度成正比。二、適用范圍參照AOAC方法。適用于檢測(cè)含有分子量大于10,000道爾頓葡聚糖的樣品。三、儀器1、分光光度計(jì)2、離心機(jī)3、旋轉(zhuǎn)混勻器4、恒溫水浴鍋四、試劑除特殊說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水，試劑為分析純。1、80%乙醇：800ml無(wú)水乙醇加水200ml。2、2.5mol/L NaOH溶液：100gNaOH加蒸餾水稀釋至1L，加入固體無(wú)水硫酸鈉至飽和。3、銅貯存液：稱(chēng)取3.0g CuSO4·5H2O，30.0g檸檬酸鈉加水溶解至

10、1L。溶液可貯存2周。4、銅應(yīng)用溶液：取銅貯存液50ml，加水50ml混勻后加入無(wú)水硫酸鈉12.5 g，臨用新配。 5、洗滌液：取水50ml，加入10ml銅應(yīng)用溶液，10ml 2.5mol/L NaOH溶液，混勻。 6、1.8mol/L H2SO4：取100ml濃硫酸用水稀釋至1L。 7、20g/L苯酚溶液：稱(chēng)取2.0g苯酚，加水溶解并稀釋至100ml，混勻備用。 8、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于稱(chēng)量皿中，105干燥4h至恒重，置于裝有干燥硅膠的干燥器中冷卻。準(zhǔn)確稱(chēng)取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100m

11、l，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.0mg/ml。 9、葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液：吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)液10ml，用水稀釋10倍，葡聚糖終濃度為0.1mg/ml。五、操作方法1、樣品處理 1）樣品提?。悍Q(chēng)取樣品15g，加水100ml，沸水浴加熱2h，冷卻至室溫，定容至200ml（V1），混勻后過(guò)濾，棄初濾液，收集余下濾液。 2）沉淀高分子物質(zhì)：準(zhǔn)確吸取上述濾液100ml（V2），置于燒杯中，加熱濃縮至10ml，冷卻后，加入無(wú)水乙醇40ml，將溶液轉(zhuǎn)至離心管中以3000rpm離心5min，棄上清液，殘?jiān)?0%乙醇洗滌3次，殘?jiān)┏恋砥暇厶侵谩?#160;3）沉淀葡聚糖：上述殘?jiān)盟芙猓?/p>

12、并定容至50ml（V3），混勻后過(guò)濾，棄初始濾液后，取濾液2.0ml （V4），加入2.5mol/L NaOH 2.0ml，Cu應(yīng)用溶液2.0ml，沸水浴中煮沸2mim，冷卻后以3000rpm離心5min，棄上清液，殘?jiān)孟礈煲合礈?次，殘?jiān)y(cè)定葡聚糖之用。 4）測(cè)定葡聚糖：上述殘?jiān)?.0mL 1.8mol/L H2SO4溶解，用水定容至100mL（V5）。準(zhǔn)確吸取2.0ml（V6），置于25ml比色管中，加入1.0ml苯酚溶液，10ml濃硫酸，沸水浴煮沸2分鐘，冷卻比色。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)含量，計(jì)算粗多糖含量。 2、標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.

13、10，0.20，0.40，0.60，0.80，1.00，1.50，2.00ml（分別相當(dāng)于葡聚糖0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.15，0.20mg），補(bǔ)充水至2.0mL，加入苯酚溶液1.0ml，濃硫酸10ml，混勻，沸水浴2分鐘，混勻，沸水浴2分鐘，冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波長(zhǎng)處以試劑空白溶液為參比，測(cè)定吸光度值（A），以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo)，A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。六、計(jì)算 從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品相應(yīng)含量，計(jì)算粗多糖含量。 葡聚糖（%）=c×V5×V3×V1×0.1/V6×V4×

14、V2×m=c×250/m 公式中：c-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得樣品測(cè)定管中葡聚糖含量，mg； V1-樣品提取時(shí)定容體積，ml； V2-沉淀高分子物質(zhì)取液量，ml；V3-沉淀葡聚糖時(shí)定容量，ml； V4-沉淀葡聚糖時(shí)取液量，ml； V5-測(cè)定葡聚糖時(shí)定容體積，ml； V6-樣品比色管中取樣液體積，ml； m-樣品稱(chēng)量質(zhì)量，g； 0.1-將mg/g換算成g/100g的系數(shù)。 七、注意事項(xiàng) 1、苯酚-H2SO4溶液可以和多種糖類(lèi)進(jìn)行顯色反應(yīng)，常用于總糖的測(cè)定。所以測(cè)定過(guò)程中應(yīng)注意容器及試劑

15、中其他糖類(lèi)的干擾。 2、苯酚-H2SO4溶液和不同類(lèi)的糖反應(yīng)，顯色的強(qiáng)度略有不同，反映在標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率不同。如果已知樣品中糖的結(jié)構(gòu)，應(yīng)盡量以同類(lèi)糖的純品做標(biāo)準(zhǔn)品，或以含有已知濃度的同類(lèi)產(chǎn)品做對(duì)照品進(jìn)行檢測(cè)分析；如果樣品中糖的類(lèi)型未知或結(jié)構(gòu)多樣，則只能以葡萄糖計(jì)或其他糖計(jì)報(bào)告結(jié)果。 3、試驗(yàn)證明葡萄糖、果糖等單糖，蔗糖、乳糖等雙糖、低聚糖-棉子糖，淀粉、糊精等多糖及甜味劑糖精不干擾粗多糖測(cè)定。 4、本方法由北京市衛(wèi)生防疫站建立，經(jīng)中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生研究所驗(yàn)證。黑木耳多糖的提取、分離、純化及初步測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)真菌多糖的提取方法2、掌握測(cè)定多糖組

16、成、總糖含量的基本方法3、掌握柱層析技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理 通過(guò)水提法浸提出木耳中的多糖，經(jīng)過(guò)有機(jī)溶劑脫脂，Sevage脫蛋白，透析除去無(wú)機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)，經(jīng)干燥得粗多糖。粗多糖經(jīng)酸水解后通過(guò)紙層析或薄層層析測(cè)出多糖的單糖組成。經(jīng)酚硫酸法測(cè)得總糖含量。獲得粗多糖經(jīng)G-100純化，獲得較純多糖樣品，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。三、設(shè)備及試劑1、設(shè)備：721型分光光度計(jì)、回流裝置、臺(tái)式離心機(jī)、電熱恒溫水浴鍋、真空干燥箱、恒溫磁力攪拌器、柱層析系統(tǒng)、層析缸、布氏漏斗2、材料：黑木耳，使用前烘干、粉碎，過(guò)80目篩，得木耳粉3、試劑：苯酚、硫酸、無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚、乙酸、正丁醇、鄰苯二甲酸、CPC、P2O5、Na

17、SO4、NaCL、NaOH、BaCO3、石油醚、氯仿、粉末狀活性炭、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖甘露糖、半乳糖、葡萄糖四、步驟1、提取1）取50g粉末，用石油醚回流脫脂2h，反復(fù)兩次，抽濾，取殘?jiān)?）殘?jiān)?jīng)80%乙醇除去低聚糖后，熱水浴浸提4h，重復(fù)一次，六層紗布粗濾，抽濾，取濾液。3）向?yàn)V液中加入1%粉末活性炭，磁力攪拌器攪拌15min，抽濾除凈活性炭。4）濃縮至80ml左右，加入糖液總體積的1/4 Sevage試劑（正丁醇:氯仿=1:4），充分?jǐn)嚢?h，靜置，離心，取上清液重復(fù)，至無(wú)游離蛋白為止。5）將清液裝入透析袋，流水透析過(guò)夜。6）將袋內(nèi)溶液轉(zhuǎn)移至250ml燒杯中，加入三倍體積95%乙醇沉淀多糖，靜置30min。7）4000rpm離心10min。8）棄上清液，沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿洗滌。9）將沉淀置于通風(fēng)櫥內(nèi)揮凈有機(jī)溶劑。10）60真空干燥過(guò)夜，得粗多糖干品。2、G-100柱純化3、酚硫酸法測(cè)總糖含量1）稱(chēng)量提取出來(lái)的多糖粗品100mg，定容于1000ml容量瓶。2）6g苯酚蒸餾水定容于100ml容量瓶中，得6%苯酚。3）分別取1中母液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml分別加蒸餾水定容到50ml。4）分別從3中每管精確取2.0ml溶液，置于有塞試管中，分別加1ml 6%苯酚溶液