布魯克液質(zhì)聯(lián)用操作規(guī)程

1、布魯克液質(zhì)聯(lián)用儀操作規(guī)程1操作前檢查1.1 檢查液氮罐和高純氮的出口壓力，保證在正常范圍1.2檢查洗針溶液和流動(dòng)相1.3 流動(dòng)相須現(xiàn)配并超聲，緩沖鹽溶液過(guò)0.22m微孔濾膜（或者使用色譜純的鹽溶液和酸溶液）1.4 如使用溶融石英進(jìn)樣管，操作前應(yīng)檢查石英管是否拉長(zhǎng)，確保其未超出ESI探針尖端。1.5 檢查系統(tǒng)真空度，電離真空計(jì)讀數(shù)（分析儀區(qū)域）應(yīng)小于5×10-6 Torr。1.6 檢查廢液液位，及時(shí)清空廢液。1.7 檢查液氮罐和氦氣鋼瓶是否有一定壓力，以便為測(cè)試樣品提供符合流速 和壓力要求的氮?dú)猓▏婌F氣體和干燥氣體）和氦氣（碰撞氣體）。2操作步驟及注意事項(xiàng)1檢查并打開(kāi)干燥氣 (Dry

2、gas) 和霧化氣 (Nebulizer Gas)所需的氮?dú)庠矗?) 如配備液氮罐，則需打開(kāi)增壓閥及供氣閥閥門(mén)， 使罐體壓力保持在100 psi 以上，并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至 0.6 Mpa；2) 如配備氮?dú)獍l(fā)生器，則提前半小時(shí)打開(kāi)氮?dú)獍l(fā)生器電源，以便使氮?dú)饽軌蜻_(dá)到99.99%以上的純度，再調(diào)節(jié)氮?dú)饬髁恐?20 L/min；2檢查并打開(kāi)碰撞氣 (Collision Gas) 高純氮?dú)釴2或高純氬氣Ar鋼瓶（純度要求99.999%），并調(diào)節(jié)減壓閥出氣口壓力至 0.4 Mpa；3檢查機(jī)械泵泵油的水平線， 需在小窗口的 1/22/3 之間；4打開(kāi)計(jì)算機(jī)，顯示器電源；5打開(kāi)質(zhì)譜儀主機(jī)電源（儀器左側(cè)最

3、下方）；6啟動(dòng) micrOTOFcontrol 控制軟件，務(wù)必保持儀器一直處在shutdown狀態(tài)，待真空度達(dá)到 1×10e-6mbar后，才可切換至standby狀態(tài)待機(jī)；為了保證良好穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，待真空度下降至 10e-7mbar以下后，再operate儀器開(kāi)始測(cè)試。2.2 新建液相方法打開(kāi)hystar軟件，選擇method，然后輸入新建方法的名字，點(diǎn)擊open，開(kāi)始方法的新建。在彈出的對(duì)話框中選擇edit，然后點(diǎn)擊“wizard”進(jìn)行設(shè)置。液相方法包括梯度、流速、柱溫、樣品盤(pán)溫度、時(shí)間、進(jìn)樣針吸樣速度等，可依次設(shè)置即可，全部設(shè)置好之后，將。2.3 新建質(zhì)譜方法方法一：在oto

4、fcontrol中，打開(kāi)method，按照自己待檢測(cè)物的分子量范圍及正負(fù)偏向性選擇合適的質(zhì)譜方法，小分子有對(duì)應(yīng)的small molecular方法，蛋白質(zhì)組有專(zhuān)門(mén)的proteomics方法。方法二（非專(zhuān)業(yè)人員不推薦）：在otofcontrol中，打開(kāi)method，選擇new，即可新建質(zhì)譜方法?？梢孕薷牡膮?shù)包括以下幾個(gè)方面：（1）mode中的Focus為active，line spectra calculation為use sum intensity，ion polarity 為pos或neg，mass range調(diào)到待檢測(cè)物合適的分子量范圍。（2）source中capillary pos：4

5、500V，neg：3500。Divert valve：source1-2進(jìn)質(zhì)譜；source1-6為discard to fluid（3）Tune中collision RF 小分子調(diào)到1000-1500，大分子調(diào)到2000-2500；low mass視目標(biāo)物分子量大小截留（例如目標(biāo)分子為500，可調(diào)為300，去掉小分子區(qū)域的雜峰）。（4）MS/MS中如果想檢測(cè)二級(jí)，可以勾選auto MS/MS；precursor ions中 cycle time 正常下為3s（5）chromatogram中選擇BPC根據(jù)待檢測(cè)物的分子量大小和正負(fù)偏向性，先在軟件自帶的質(zhì)譜方法中選擇相應(yīng)的方法，再在此方法的基礎(chǔ)

6、上進(jìn)行優(yōu)化及分段（如含鹽的樣品截掉前2-5分鐘，1-6 waste）。儀器在操作狀態(tài)下<Operation> 穩(wěn)定 20-30 分鐘后即可開(kāi)始儀器質(zhì)量準(zhǔn)確度校正。2.4儀器質(zhì)量準(zhǔn)確度校正2.2.1. 藥物和酶解多肽樣品，選用甲酸鈉溶液作為校正標(biāo)準(zhǔn)液。覆蓋質(zhì)量范圍m/z 90-1200；校正模式選用 <Enhanced Quadratic>。2.2.2. 蛋白質(zhì)類(lèi)樣品選用三氟乙酸鈉溶液作為校正標(biāo)準(zhǔn)液。覆蓋質(zhì)量范圍m/z 200-2000；校正模式選用 <Quadratic>。2.2.3. 校正液配制甲酸鈉校正液：溶劑：異丙醇:水溶液= 1:1 并含有 0.2%

7、甲酸10mM 甲酸鈉校正液： 1ml 1M NaOH + 99ml 溶劑三氟乙酸鈉校正液：溶劑： 50%乙氰含有 0.1%三氟乙酸鈉(TFA)2.2.3. <Calibration> 校正界面3.測(cè)樣方式3.1 直接進(jìn)樣測(cè)定對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品或相對(duì)較純或混合組分較少并且不含鹽的藥物樣品， 如果僅需要進(jìn)行鑒定，可以采用直接進(jìn)樣方法測(cè)定。3.1.1 樣品用標(biāo)準(zhǔn)溶劑（50%H2O，50%乙腈或甲醇，0.1%甲酸）溶解或稀釋3.1.2 將配好的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品吸入進(jìn)樣器（針），將進(jìn)樣器（針）放置于進(jìn)樣泵中。 注意：進(jìn)樣器（針）內(nèi)不能有氣泡3.1.3 將進(jìn)樣器（針）直接與離子源連接（如圖）注意毛細(xì)管與注

8、射器之間需緊密連接。進(jìn)樣器內(nèi)不能有氣泡3.1.4 設(shè)置進(jìn)樣泵的流速為 120180 微升/小時(shí)。3.2 液質(zhì)聯(lián)用（ LC/MS）測(cè)定樣品采用常規(guī)液相色譜系統(tǒng)（色譜柱 2.1x150mm；流速 200-300uL/min）。 啟動(dòng)Hystar 軟件，打開(kāi)hystar軟件，在sample table中選擇相應(yīng)的文件并打開(kāi)，然后復(fù)制一個(gè)之前做過(guò)的樣品，對(duì)復(fù)制后的新的一行進(jìn)行文件名，存儲(chǔ)路徑和液相質(zhì)譜方法的修改（改完之后再檢查一遍）。 注：如果是新建sample table，可以打開(kāi)一個(gè)新的復(fù)制一行粘貼到新建里，因?yàn)樾陆ǖ淖詣?dòng)進(jìn)樣的不對(duì)。4. 輸入下列參考參數(shù)4.1. 直接進(jìn)樣： （低流速）大約在 1

9、20180 微升/小時(shí) 離子源： Nebulizer 0.4 bar Dry Gas 4.0 L/min Dry Temp 1804.2. 藥物小分子樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在 200-300 uL/min離子源： Nebulizer 0.8 bar Dry Gas 6-8 L/min Dry Temp 1804.3. 酶解多肽樣品液質(zhì)聯(lián)用：平均流速大約在 200-300 nL/min離子源： Dry Gas 3.0 L/min Dry Temp 1605. 手動(dòng)獲得一個(gè) MS/MS 圖譜打開(kāi) MS/MS 界面，選擇 MRM-> 輸入 <Parent Condition>

10、列表，激活 Scan Mode。6. 后期處理6.1 打開(kāi)分析文件6.1.1. 在任務(wù)欄中或者在工具欄中選擇按鈕 均可切換到數(shù)據(jù)分析程序(DataAnalysis)，讀取所獲得的數(shù)據(jù)文件6.1.2. 讀取數(shù)據(jù)文件被可選擇 File 菜單下的 open 對(duì)話框， 所需要的顯示窗口將被程序自動(dòng)打開(kāi)。6.1.3. 在文件對(duì)話框中選擇目錄 d:datastart 用鼠標(biāo)鍵雙擊 test0000.d，test0001.d， test0002.d 來(lái)打開(kāi)數(shù)據(jù)文件；按住 shift 鍵來(lái)標(biāo)記所有文件并點(diǎn)擊回車(chē)鍵來(lái)一次全部打開(kāi)所選文件。6.1.4. 質(zhì)譜圖與色譜圖按文件名讀取并顯示在 File 菜單下。在分析

11、清單窗口下選擇所需的文件，選擇后圖譜在各自的窗口下顯示。6.2 質(zhì)譜圖6.2.1. 在分析清單窗口下選擇的結(jié)果在質(zhì)譜圖窗口顯示。6.2.2. 通過(guò) Masslist 參數(shù)對(duì)話框改變離子檢測(cè)參數(shù)6.2.3. 下列對(duì)話框被用來(lái)在圖譜中設(shè)置新的離子檢測(cè)參數(shù)6.2.4. 對(duì)下一步的 Method 參數(shù)設(shè)置參見(jiàn) Bruke Daltonics DataAnalysis Reference Manual6.3 色譜數(shù)據(jù)6.3.1. 完整色譜圖1. 讀取數(shù)據(jù)文件（ e.g. test0001.d），顯示 TIC（ Total Ion Chromatogram）2. 讀取某一個(gè)離子的色譜數(shù)據(jù)可以打開(kāi) Edit

12、 Chromatogram Traces 對(duì)話框3. 通過(guò) Edit 菜單下選擇 Chromatogram 選項(xiàng)來(lái)打開(kāi) Traces 對(duì)話框如下圖所示，選擇質(zhì)荷比為622的離子。6.3.2. 獲得各組分的質(zhì)譜圖（ Compound spectra）使用 Find > Compound 功能鍵，快速有效的產(chǎn)生各組分的質(zhì)譜圖；1 ）功能鍵 <Compounds-Chromatogram> 產(chǎn)生色譜分離過(guò)程中所有組分的質(zhì)譜圖。打開(kāi) Compound Spectra 窗口時(shí)，可以看到各組分的質(zhì)譜圖。2）功能鍵 <Compounds-MS(n)> 產(chǎn)生所有采用 MS(n)步

13、驟采集的圖譜。3） <Compounds-AutoMS(n)> 產(chǎn)生 MS-和 MS/MS 圖7. 報(bào)告有幾種可用的報(bào)告形式來(lái)輸出數(shù)據(jù)，一種報(bào)告僅有質(zhì)譜圖，另一種報(bào)告則只有色譜圖，還有一種兩種圖譜都保留。7.1. 直接打?。捍蛴℃I ；或者打開(kāi) File 菜單，選擇 Print；或者通過(guò)打印預(yù)覽打印，選擇打印預(yù)覽鍵 或在 File 菜單選擇 Print Preview，然后在打印預(yù)覽窗口下選擇打印鍵7.1.1 報(bào)告內(nèi)容下拉菜單包含了所有可選的報(bào)告內(nèi)容7.1.2. 獲得參數(shù)報(bào)告選擇此內(nèi)容的報(bào)告中包含了獲得所選分析結(jié)果的參數(shù)7.1.3. 顯示報(bào)告選擇此內(nèi)容將完全按照顯示窗口打?。òㄉV窗口、質(zhì)譜顯示窗口、混合物質(zhì)譜窗口、質(zhì)譜窗口）7.2 質(zhì)譜圖報(bào)告內(nèi)容中幾種可選的質(zhì)譜圖形式7.2.1. 質(zhì)譜清單報(bào)告報(bào)告中含所選的質(zhì)譜圖的 peak 清單7.2.2. 質(zhì)譜圖報(bào)告報(bào)告中含所選的質(zhì)譜圖報(bào)告7.3 色譜圖報(bào)告內(nèi)容中幾種可選的色譜圖形式7.3.1 色譜清單報(bào)告 報(bào)告中含所選的色譜圖的色譜峰清單7.3.2 色譜圖報(bào)告報(bào)告中