細(xì)胞工程習(xí)題-第九章

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上第九章復(fù)習(xí)題一、從培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法、培養(yǎng)設(shè)備上比較分析植物細(xì)胞培養(yǎng)與微生物細(xì)胞培養(yǎng)的異同。1、植物細(xì)胞與微生物細(xì)胞對(duì)比： 細(xì)菌、真菌、植物細(xì)胞都有細(xì)胞壁。 細(xì)菌無(wú)成形的細(xì)胞核，真菌、植物細(xì)胞有成形的細(xì)胞核。 細(xì)菌只有核糖體一種細(xì)胞器。 植物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大（10200微米，30-100倍）。 植物細(xì)胞很少以單一細(xì)胞形式懸浮生長(zhǎng)，通常以一定細(xì)胞數(shù)的非均相細(xì)胞團(tuán) 方式存在。 植物細(xì)胞具有纖維素細(xì)胞壁和大的液泡，很容易被剪切力損傷。 植物細(xì)胞生長(zhǎng)速度慢，操作周期長(zhǎng)（2-3周甚至2-3個(gè)月）。 植物細(xì)胞培養(yǎng)基成分豐富而復(fù)雜，適合微生物生長(zhǎng)，因此防止污染更困難。 植物細(xì)胞培養(yǎng)

2、一般需要光照。2、培養(yǎng)基對(duì)比： 植物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素、植物生長(zhǎng)激素、有機(jī)酸和一些復(fù)合物質(zhì)組成。目前應(yīng)用廣泛的基礎(chǔ)培養(yǎng)基有：MS、B5、N6等無(wú)機(jī)鹽：大量元素N/S/P/K/Ca/Mg等、微量元素有機(jī)物：糖類、氨基酸、維生素等調(diào)節(jié)物質(zhì)：激素 與微生物培養(yǎng)基相比：需要大量無(wú)機(jī)鹽，多種維生素和激素，一般采用無(wú)機(jī)氮源，一般以蔗糖為碳源。3、培養(yǎng)方法對(duì)比：植物細(xì)胞：經(jīng)酶解法或愈傷組織法得單細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)；方法有看護(hù)培養(yǎng)、飼養(yǎng) 層培養(yǎng)、固體培養(yǎng)、細(xì)胞懸液培養(yǎng)微生物細(xì)胞：固體斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)4、培養(yǎng)設(shè)備：植物細(xì)胞：細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，一般都有三部分組成：反應(yīng)罐、控制系統(tǒng)、檢

3、 測(cè)分析系統(tǒng)。微生物細(xì)胞：傳統(tǒng)微生物發(fā)酵罐二、請(qǐng)分析限制植物細(xì)胞培養(yǎng)大規(guī)模生產(chǎn)有價(jià)值次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響因素。 次級(jí)代謝產(chǎn)物（Secondary metabolites） 是通過(guò)次級(jí)代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。影響因素：1、生物因素細(xì)胞株：穩(wěn)定、高產(chǎn)、生長(zhǎng)速度快的細(xì)胞株是細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的前提。在進(jìn)行植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)有價(jià)值的代謝產(chǎn)物時(shí)必須弄清楚產(chǎn)物的合成部位，也就是應(yīng)該考慮到不同部位來(lái)源細(xì)胞的特性。細(xì)胞凋亡：是植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中不可避免的現(xiàn)象，保證充足的營(yíng)養(yǎng)供給以及避免有害代謝產(chǎn)物的積累，可以減少細(xì)胞凋亡。細(xì)胞團(tuán)：細(xì)胞團(tuán)的形成

4、影響穩(wěn)定的懸浮體系的維持，同時(shí)造成了培養(yǎng)物的顯著異質(zhì)性，細(xì)胞團(tuán)表面與內(nèi)部的細(xì)胞存在營(yíng)養(yǎng)吸收和代謝產(chǎn)物分泌的差異。此外，細(xì)胞團(tuán)容易受剪切力影響而破碎，引起培養(yǎng)液粘度增加，致使氣體交換與傳遞受到影響。要保持反應(yīng)器良好的混合效果。適當(dāng)大小的細(xì)胞團(tuán)有利于代謝產(chǎn)物積累。生物合成機(jī)制：次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成不同于蛋白質(zhì)合成，涉及多基因參與（基因簇），機(jī)制非常復(fù)雜，影響因素非常多。結(jié)合目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行生物合成機(jī)制研究，揭示代謝途徑及誘導(dǎo)合成機(jī)制是細(xì)胞培養(yǎng)的重要生物學(xué)問(wèn)題，有利于指導(dǎo)建立優(yōu)化的培養(yǎng)工藝與技術(shù)。2、化學(xué)因素：營(yíng)養(yǎng)鹽：一方面是保證植物細(xì)胞生物量的增長(zhǎng)；另外一方面是要保證細(xì)胞能合成和積累次級(jí)代謝產(chǎn)物。前

5、體（precursor ）：缺乏某一種前體時(shí)細(xì)胞就不能合成某一種代謝物。如果在培養(yǎng)基中加入外源前體將會(huì)有助于合成該代謝產(chǎn)物或使其產(chǎn)量增加。誘導(dǎo)子：狹義誘導(dǎo)子：是指那些能夠與細(xì)胞發(fā)生相互作用，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，作用于與細(xì)胞次生代謝相關(guān)的基因表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)胞次生代謝相關(guān)酶的活力，最終使細(xì)胞次生代謝水平發(fā)生改變的物質(zhì)。廣義誘導(dǎo)子：是指所有能夠提高細(xì)胞次生代謝相關(guān)酶活力，進(jìn)而提高細(xì)胞次生代謝水平的外界因素。溫度、光照、紫外線、紅外線等都是廣義誘導(dǎo)子。反饋抑制：植物次級(jí)代謝產(chǎn)物在培養(yǎng)系統(tǒng)的積累有時(shí)會(huì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的合成具有反饋抑制?？梢圆捎昧骷?半連續(xù)培養(yǎng)、兩相培養(yǎng)等工藝技術(shù)克服。3、物理因

6、素：光照：光對(duì)細(xì)胞代謝產(chǎn)物的合成有很重要的影響。光照時(shí)間長(zhǎng)短、光質(zhì)、光強(qiáng)等都會(huì)對(duì)代謝產(chǎn)物合成和積聚產(chǎn)生作用。光對(duì)許多酶有誘導(dǎo)或抑制作用。溫度：溫度會(huì)影響酶的活性。細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)溫度緊密相關(guān)。植物細(xì)胞培養(yǎng)一般在25左右進(jìn)行。pH：會(huì)影響培養(yǎng)液的滲透壓、酸堿度，酶的活性，從而影響細(xì)胞代謝。植物細(xì)胞液體培養(yǎng)的pH 變化范圍在56 之間，最佳的起始pH在5.55.8 之間。4、工程技術(shù)問(wèn)題培養(yǎng)液的流變特性：由于植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中容易結(jié)團(tuán)，同時(shí)，不少細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中容易分泌粘多糖等物質(zhì)，從而使傳氧速率降低，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。粘度變化可以由細(xì)胞本身或其分泌物等引起。前者包括細(xì)胞濃度、年齡、大小、結(jié)團(tuán)情況

7、等。氣體傳遞：與微生物不同，植物細(xì)胞培養(yǎng)一般需要光照，通過(guò)光合作用合成有機(jī)物，因此氧氣和CO2的含量與傳遞對(duì)培養(yǎng)過(guò)程影響較大。氧的傳遞與通氣速率、培養(yǎng)液混合程度、培養(yǎng)液流變特性、氣液界面面積等因素有關(guān)；而氧的吸收與反應(yīng)器類型、細(xì)胞生長(zhǎng)速率、溫度、pH、營(yíng)養(yǎng)組成、細(xì)胞濃度等相關(guān)。攪拌與剪切力：為了加強(qiáng)氣液固之間的傳質(zhì)，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時(shí)需要混合攪動(dòng)。植物細(xì)胞雖然有較硬的細(xì)胞壁，但是細(xì)胞壁很脆弱，對(duì)攪拌的剪切力很敏感。由于剪切力比較大，細(xì)胞會(huì)自溶，次級(jí)代謝產(chǎn)物合成會(huì)降低。泡沫與器壁表面粘附性：與微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡更大，而且由于培養(yǎng)液含有蛋白質(zhì)或粘多糖，粘度大，細(xì)胞很容易被

8、包埋在泡沫里，造成非均相培養(yǎng)，也可從營(yíng)養(yǎng)液中帶出來(lái)，造成損失或污染。因此，必須對(duì)泡沫進(jìn)行消除。消泡劑、機(jī)械去除。5、提高次級(jí)代謝產(chǎn)物產(chǎn)量的途徑：培養(yǎng)設(shè)備：選擇或設(shè)計(jì)合適的生物反應(yīng)器。培養(yǎng)工藝：誘導(dǎo)子添加、前體喂養(yǎng)、添加競(jìng)爭(zhēng)途徑代謝產(chǎn)物抑制劑、培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、環(huán)境條件）優(yōu)化與控制、流加培養(yǎng)。培養(yǎng)技術(shù)：固定化培養(yǎng)技術(shù)、兩相培養(yǎng)技術(shù)、兩步法培養(yǎng)（第1步細(xì)胞生長(zhǎng)；第2步產(chǎn)物積累）。三、查閱文獻(xiàn)，通過(guò)一個(gè)例子詳細(xì)說(shuō)明通過(guò)植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)生產(chǎn)次級(jí)代謝產(chǎn)物的應(yīng)用。毛狀根生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展長(zhǎng)春花毛狀根培養(yǎng)及抗癌生物堿產(chǎn)生的研究 植物作為天然藥物、香料、色素、以及農(nóng)藥和工業(yè)原料等重要來(lái)源，是工業(yè)生產(chǎn)中不可或缺的資源。利用生物技術(shù)生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物主要有兩種方法，即植物細(xì)胞培養(yǎng)和植物器官培養(yǎng)。由于毛狀根具有激素自養(yǎng)、生長(zhǎng)迅速、生長(zhǎng)周期短等特點(diǎn)，同時(shí)由于它是分化程度很高的器官培養(yǎng)物，代謝通路能夠比較完整地表達(dá)，尤其是一些特殊的次生代謝產(chǎn)物的高效合成較為穩(wěn)定，為大量生產(chǎn)提供了有用的手段。 為建立長(zhǎng)春花毛狀根轉(zhuǎn)化體系，從毛狀根中獲得生物堿，用發(fā)根農(nóng)桿菌A4和R1000菌株分別感染長(zhǎng)春花的不同外植體獲得毛狀根，并對(duì)毛狀根的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。 采用A4感染葉片，分別預(yù)、共培養(yǎng)2d及添加100mg/