質(zhì)粒DNA提取及純化.羅云鵬

1、2016DNA的提取和純化小量制備大量制備堿裂解小量制備法氯化銫/溴化乙錠平衡力新法堿裂解法制備粗制裂解物煮沸小量制備法名詞解釋1.質(zhì)粒質(zhì)粒zhl（Plasmid）是附加到細(xì)胞中的非細(xì)胞的染色體或核區(qū)DNA原有的能夠自主復(fù)制的較小的DNA分子（即細(xì)胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的質(zhì)粒雖然都是環(huán)狀構(gòu)型，它存在于許多細(xì)菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的線粒體等胞器中。然而，1984年，在Streptomyces coelicoler（天藍(lán)色鏈霉菌）等放線菌以及在Borrelia hermsii（赫氏蜱疏螺旋體）等原核生物中，又相繼發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。2.基因工程基因工程（genetic engineer

2、ing）又稱基因拼接技術(shù)和DNA重組技術(shù)。所謂基因工程是在分子水平上對(duì)基因進(jìn)行操作的復(fù)雜技術(shù)，是將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)，使這個(gè)基因能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)的操作。它是用人為的方法將所需要的某一供體生物的遺傳物質(zhì)DNA大分子提取出來(lái)，在離體條件下用適當(dāng)?shù)墓ぞ呙高M(jìn)行切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來(lái)，然后與載體一起導(dǎo)入某一更易生長(zhǎng)、繁殖的受體細(xì)胞中，以讓外源物質(zhì)在其中“安家落戶”，進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新技術(shù)。它克服了遠(yuǎn)緣雜交的不親和障礙。溶液一50mmol/L葡萄糖 ，25mmol/L Tris-Cl10mmol/LEDTATris-ClT

3、ris-HCl緩沖液（0.05mol/L，25），中文別名：三（羥甲基）氨基甲烷；氨丁三醇；緩血酸銨；三羥甲基氨基甲烷；Tris，英文名稱：Tris(hydroxymethyl)aminomethane分子式：C4H11NO3分子量：121.14CAS號(hào)：77-86-1密度：1.353熔點(diǎn)：167-172沸點(diǎn)：219-220 (10 mmHg)閃點(diǎn)：100水溶性：550 g/L (25)外觀：白色結(jié)晶 水溶性：無(wú)色，澄清毒性：毒性低，可致癌，不要直接接觸皮膚。用途Tris緩沖液不僅被廣泛用作核酸和蛋白質(zhì)的溶劑，還有許多重要用途。Tris被用于不同pH條件下的蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)。Tris緩沖液的低離

4、子強(qiáng)度特點(diǎn)可用于線蟲（C. elegans）核纖層蛋白（lamin）的中間纖維的形成。Tris也是蛋白質(zhì)電泳緩沖液的主要成分之一，其在電泳緩沖液中與甘氨酸構(gòu)成緩沖體系，穩(wěn)定電泳過(guò)程中的PH。此外，Tris還是制備表面活性劑、硫化促進(jìn)劑和一些藥物的中間物。Tris也被用作滴定標(biāo)準(zhǔn)物。 作為蛋白緩沖液時(shí)，若后續(xù)工作需要質(zhì)譜，則不適宜用Tris，最好換成其他質(zhì)譜儀可耐受的緩沖液。蘇寧易購(gòu)寶寶知道拇指醫(yī)生百度知道首頁(yè) 電腦版 反饋詞條由網(wǎng)民創(chuàng)作并享有版權(quán)，請(qǐng)保護(hù)版權(quán)歸屬了解更多Tris-HCl 用百度知道詞條目錄百科名片概述簡(jiǎn)介用途EDTA溶液乙二胺四乙酸能與Mg2+、Ca2+、Mn2+、Fe2+等二

5、價(jià)金屬離子結(jié)合的一種螯合劑。由于多數(shù)核酸酶類和有些蛋白酶類的作用需要Mg2+，故常用做核酸酶、蛋白酶的抑制劑；也可用于去除重金屬離子對(duì)酶的抑制作用。用途EDTA是一種重要的絡(luò)合劑。EDTA用途很廣，可用作彩色感光材料沖洗加工的漂白定影液，染色助劑，纖維處理助劑，化妝品添加劑，血液抗凝劑，洗滌劑，穩(wěn)定劑，合成橡膠聚合引發(fā)劑，EDTA是螯合劑的代表性物質(zhì)。能和堿金屬、稀土元素和過(guò)渡金屬等形成穩(wěn)定的水溶性絡(luò)合物。溶液一的作用溶液 50mM 葡萄糖 / 10mM EDTA / 25mM Tris-HCl,pH=8.0葡萄糖增稠,使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性

6、.這一步溶液中還可以加入RNase,不受EDTA影響,并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液二200mmol/LNaOH1/100SDS(臨用前配置)SDSSDS（全稱為sodium dodecyl sulfate,sodium salt）是一種化學(xué)品，中文名為十二烷基硫酸鈉。主要成分： 純品外觀與性狀： 白色粉末。理化熔點(diǎn)()： 204-207沸點(diǎn)()： 無(wú)資料相對(duì)密度(水=1)： 1.09溶解性： 溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。主要用途： 用作洗滌劑原料、印染工業(yè)的勻染劑、礦物的浮選劑。還可作為表面活性劑，起到助溶作用。溶液三由醋酸以及鉀鹽所形成，前者在于中和堿性，后者有利于染色體DNA的沉淀

7、。質(zhì)粒是一種獨(dú)立于染色體DNA之外的能自主復(fù)制的雙鏈，閉合，環(huán)裝小分子的DNA ，其大小范圍從1kb200kb以上不等。廣泛存在于細(xì)胞中，在一些動(dòng)，植物細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的存在。目前提純質(zhì)粒的方法比較多，如堿裂解法，煮沸法和SDS法等。最常用的是堿裂解法，其優(yōu)點(diǎn)為效率高，價(jià)廉簡(jiǎn)單易學(xué)等。堿裂解分離質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與變性與質(zhì)粒DNA的復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在PH12.012.6的堿性環(huán)境中，宿主的染色體DNA變性（是氫鍵斷裂，破壞堿基配對(duì)），蛋白質(zhì)變性。質(zhì)粒DNA的堿基對(duì)也被破壞，閉環(huán)的DNA鏈處在纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。加入乙酸鉀緩沖液中和后，PH調(diào)至中性，小分子的變性質(zhì)粒D

8、NA迅速?gòu)?fù)性為可溶狀態(tài)，而變性的染色體DNA因分子量巨大而難以復(fù)性，隨同高分子量RNA以及K+/SDS/蛋白質(zhì)/膜復(fù)合物形成沉淀，故經(jīng)離心，即可將染色體DNA和質(zhì)粒DNA分離。在實(shí)驗(yàn)步驟中，加入溶解液1的目的主要是將細(xì)菌團(tuán)塊重新懸浮于緩沖溶液中。溶液2含有SDS和NaOH，前者可將細(xì)菌溶解，后者可將DNA變性。溶液3由醋酸及鉀鹽所形成，前者在于中和堿性，后者則由于DNA的沉淀。加入溶液3后離心，大部分蛋白質(zhì)和染色體DNA沉在下面，而上清液中所含的質(zhì)粒DNA可繼續(xù)進(jìn)行純化。純化質(zhì)粒采用氯化鋰沉淀和聚乙二醇沉淀的方法。進(jìn)一步用RNA酶消化可去除殘余的RNA。用酚：氯仿：異戊醇抽提可除去PEG和殘余

9、的蛋白質(zhì)。在經(jīng)乙醇沉淀和離心回收，即可得到高度純化的質(zhì)粒DNA。制備的質(zhì)粒DNA可用于酶切，連接，轉(zhuǎn)化，以及PCR等。質(zhì)膜微囊通常直徑約50-100nm，富含膽固醇、鞘磷脂（sphingomyelin）和鞘糖脂（glycosphingolipids），并形成一個(gè)去垢劑不溶性的膜區(qū)域，以存在caveolin蛋白分子為特征。質(zhì)膜微囊大量存在于內(nèi)皮細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)質(zhì)膜微囊參與許多細(xì)胞生命活動(dòng)，例如細(xì)胞內(nèi)吞（endocytosis）、膽固醇運(yùn)輸、細(xì)胞膜組裝、信號(hào)傳導(dǎo)和腫瘤生成，并參與許多致病性細(xì)菌和病毒的內(nèi)吞過(guò)程。恒溫?fù)u床 普通離心

10、機(jī) 臺(tái)式高速離心機(jī) 漩渦振蕩器 -20度冰箱 三角燒瓶 燒杯 量筒 刻度吸管 制冰機(jī) Eppendorf管架 Tip頭 保溫瓶 可調(diào)式移液器（020ul,0200ul,201000ul） 試管架 紙巾或吸水紙(1)溶液一：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-Cl(PH=8.0),10mmol/LEDTA(2)溶液二：200mmol/LNaOH,1/100SDS(臨用前配制)(3)溶液三：5mmol/L乙酸鉀，冰乙酸，水按6:1.15:2.85混合而成，所配溶液對(duì)鉀是3mol/L，對(duì)乙酸根是 5mol/L(4)STE溶液：0.1mol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl(P

11、H=8.0),1mmol/LEDTA(5)TE緩沖液：10mmol/LTris-Cl(PH=8.0),1mmol/LEDTA(6)3mol/L乙酸鈉(PH5.2)(7)5mol/LiCl(8)1.6mol/L NaCl ,13/100PEG：將3.9g聚乙二醇溶于20ml1.6mol/LNaCl中，再加1.6mol/LNaCl定容至30ml過(guò)濾除菌，置4攝氏度保存。(9)飽和酚(10)氯仿：異戊醇(24:1) (11)RNnase A溶液(10mg/ml),無(wú)水乙醇，異丙醇(12)LB培養(yǎng)基(含100mlug/ml氨芐青霉素)：稱取胰蛋白胨5g，酵母提取物2.5g,NaCl5g,加雙蒸水400

12、ml溶解，用5mol/LNaCl調(diào)至PH=7.4，定容至500ml，在103.4kpa下高壓滅菌20min大腸桿菌JM103(pUC19),大腸桿菌JM103(pUC19-cTnI)1. 細(xì)菌繁殖：LB培養(yǎng)基，2 ml/20 ml，37，200 rpm，搖一搖，過(guò)夜。 2. 離心10 min，5 000 rpm， 4；棄上淸液。 3. 沉淀（菌體細(xì)胞）預(yù)冷的TES緩沖液洗滌，離心10 min，5 000 rpm， 4，加入預(yù)冷的1 ml Solution I，冰浴10 min。 4. 重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min。 5. 加入1.2 ml Solution II，

13、冰浴5 min。 6. 加入0.9 ml預(yù)冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12 000 rpm，4。 7. 加入1.5 ml異丙醇，-20冰箱內(nèi)放置15 min。 8. 離心10 min，12 000 rpm，4。 9. 取沉淀，懸于400 ul TE緩沖液中。 10. 加入40 ul，3 M NaAc。 11. 酚/氯仿，抽提，乙醇沉淀。 12. 離心10 min，12 000 rpm，4。 13. 取沉淀，冷凍干燥，再懸浮于50 ul TE緩沖液中。 14. 電泳檢測(cè)提取DNA的質(zhì)量。1.原理大量堿裂解方法不僅相當(dāng)快捷可靠，而且可獲得相當(dāng)純凈的粗制DNA，煮沸法的大量制備也簡(jiǎn)單易行。但得

14、到的DNA比較粗制，高純度的質(zhì)粒DNA可通過(guò)氯化銫或溴化乙錠平衡離心法或?qū)游龇ㄟM(jìn)一步純化，促使DNA得到。2材料含有氨芐青霉素或其他適當(dāng)?shù)倪x擇性試劑的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基帶有質(zhì)粒的大腸桿菌菌株。葡萄糖溶液/Tris/EDTA溶液卵清溶菌酶3mol/l的乙酸鉀溶液（PH約5.5）異丙醇70/100乙醇約20ml容量的高速離心管步驟1.往5ml的含選擇性試劑（通常是氨芐青霉素）的LB培養(yǎng)基或豐富培養(yǎng)基接種單菌落。于37攝氏度及劇烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。2.往2L燒瓶加入500ml含有適當(dāng)抗生素的LB培養(yǎng)基，然后將1ml過(guò)夜培養(yǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物，在與37攝氏度培養(yǎng)至飽和狀態(tài)注意：以提高產(chǎn)量，應(yīng)采用表面積較

15、大及帶折流板的燒瓶以增大通氣度，振搖速度大于400r/min3于4攝氏度，6kg離心10min4用4mlGTE重懸沉淀并轉(zhuǎn)移到一個(gè)容積大于等于20ml的高速離心管中5加入1ml新配的含25mg/ml溶菌酶的GTE溶液徹底重懸沉淀，于室溫放置10min注意：如果DNA要用層析法純化，加入5微克/毫升的RNA酶A以降解RNA6加入10ML新配置的NaOH/SDS溶液，并且輕輕混勻至溶液變得均一清亮粘稠10min7就加入7.5ml3mol/L乙酸鉀溶液，用吸管輕輕絞拌至粘稠度下降并形成大量沉淀，放于冰上放置10min8于4攝氏度，2萬(wàn)克離心十分鐘，將上清輕輕倒入另一個(gè)干凈的離心管中，如果有可見的漂浮物，可用數(shù)層紗布過(guò)濾。9加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室內(nèi)放置510分鐘，10.室溫，15000克離心十分鐘。棄上清，加入2ml 70/100乙醇，輕輕洗滌沉淀。11室溫，15000克短暫快速離心，吸去乙醇并真空干燥，4攝氏度無(wú)限期保存。正常質(zhì)粒是閉合的雙鏈DNA。在電泳過(guò)程中可能使質(zhì)粒發(fā)生開環(huán)，或者由開環(huán)解開螺旋變成線形。這三種形態(tài)電泳時(shí)的分離率不同，分離速度不同，分成三帶。閉環(huán)（超螺旋），開環(huán)，線形的螺旋率依次降低。（開環(huán)質(zhì)粒是指雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒DNA有部分解鏈，因此電泳速度最慢）三種構(gòu)像的質(zhì)粒在瓊脂糖電泳的