正交設(shè)計重復實驗法優(yōu)選丹參骨寶酸提取工藝的最佳條件

1、正交設(shè)計重復實驗法優(yōu)選丹參骨寶酸提取工藝的最佳條件                           作者：劉力名，呂應年，崔燎，吳鐵【摘要】  目的采用正交實驗考察丹參骨寶的酸提取液制備工藝的最佳條件。方法以丹參素鈉與丹酚酸B含量之比作為評價指標，對溶劑（A）、溶劑量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）等4個因素的3個水平

2、進行L9(34)正交實驗。結(jié)果直觀分析和方差分析顯示酸提取工藝因素的影響大小依次是：溶劑>溶劑量>提取時間>提取次數(shù)，最佳提取工藝條件為A3B2C1D3，即5 g丹參粗粉加4%鹽酸50 ml回流提取0.5 h，共提取3次。結(jié)論通過正交實驗篩選出了丹參骨寶最佳的酸提條件。 【關(guān)鍵詞】  丹參骨寶正交設(shè)計 高效液相色譜法Abstract：ObjectiveTo obtain the optimization condition for preparation of Danshen Gubao acid extraction solution using orthogon

3、al design.MethodsUsing the ratio of  contents of DanshensuNa and Salvianolic Acid B as an evaluation standard,the L9(34) experiment was carried out in consideration of 3 levels of 4 factors including solvent(A),dosage of solvent(B),extraction time(C,h),number of extraction times(D).ResultsThe o

4、ptimized extraction conditions calculated by the intuitive analysis and ANOVA was A3B1C1D3,5 g SM power was added in 50 ml 4% hydrochloric acid water solution，backstreaming and boiling for 0.5 h. The gruffs was extracted three times according to above procedure.ConclusionThe optimization conditions

5、for acid extraction of Danshen Gubao was sieved by orthogonal test.Key words： Danshen Gubao;   Orthogonal design;  HPLC    丹參(Radix Salviae Mihiorrhiza,SM)為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的干燥根及根莖，具有祛淤止痛，活血通經(jīng)，清心除煩的功效1。丹參的主要成分按照極性可分為脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的酚酸類化合物。丹參水溶性有效成分一般采用傳

6、統(tǒng)的水煎煮法提取，提取液中一般含有較多的丹酚酸B（約為生藥量的2.7%），而丹參素的含量則較少（約為生藥量的0.4%），此外還含有原兒茶醛等有效成分2。    近年來，我們課題組發(fā)現(xiàn)丹參水溶性有效成分尤其是丹參素和丹酚酸B及原兒茶醛可促進成骨細胞活性從而有效預防糖皮質(zhì)激素引起的大鼠骨質(zhì)疏松3，4。進一步的體外研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的水提法制備的丹參提取液相比，通過酸提法制備的丹參骨寶提取液對成骨細胞的活性顯著增強5。    目前丹參水溶性成分的提取方法主要有水煎回流法、超聲提取法等，通過這些提取方法制備的提取液中丹酚酸B的含量均比丹參素的含

7、量高。通過解析丹酚酸B和丹參素的化學結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B為三分子丹參素與一分子咖啡酸的縮合物6。前期實驗發(fā)現(xiàn)，長時間加熱或者酸性環(huán)境均會使丹酚酸B水解，導致丹酚酸B含量降低而丹參素含量增加。從節(jié)省時間考慮，本實驗采用酸回流提取法制備丹參骨寶提取液。    為了保證丹參骨寶提取液中丹參素與丹酚酸B的含量相當以及提取工藝的穩(wěn)定性，本實驗采用有重復的L9(34)正交實驗設(shè)計，以丹參素與丹酚酸B含量之比為評價指標，考察溶劑、溶劑加入量、提取時間、提取次數(shù)對評價指標的影響，確定了丹參骨寶提取液的合理可行的酸提取制備工藝。1  材料與儀器1.1  藥品與試劑

8、 丹參素鈉（批號110855200507）、丹酚酸B對照品（批號111562200403），由藥品生物制品檢定所提供，供含量測定用；丹參飲片（產(chǎn)地河北，湛江市恒生藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純（天津四友試劑公司）；水為實驗室自制三蒸水；其余試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1  色譜條件色譜柱為Thermo Hypersil C18(5 m，4.6 mm×250 mm);流動相為以甲醇（A相）1%冰醋酸水溶液（V/V，B相）為流動相進行線性梯度洗脫:09 min:10%A，927 min:10%A64%A,2730 min:64% A10%A，流速為1 ml

9、83;min-1，檢測波長為280 nm；柱溫30。2.2  對照品溶液的制備精密稱取丹參素鈉對照品0.001 5 g，丹酚酸B對照品0.002 5 g，溶于2 ml 20%甲醇水溶液中，超聲助溶5 min，即得儲備液，其中丹參素鈉及丹酚酸B濃度分別為0.75 mg·ml-1，1.25 mg·ml-1。2.3  供試品溶液的制備丹參飲片放烘箱于60干燥12 h后粉碎成40目粗粉。稱取5 g丹參粉，加入適量的溶劑，置于電熱恒溫加熱套上回流加熱，提取結(jié)束后過濾，濾液用蒸餾水適當稀釋，0.45 m濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。2.4  線性關(guān)系

10、的考察將儲備液用20%甲醇水溶液逐次等倍稀釋，配制成一系列含有丹參素鈉和丹酚酸B的標準溶液。精密吸取上述標準溶液各20 l，注入高效液相色譜儀。以標準溶液中對照品濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，丹參素鈉的回歸方程為：Y=13.018X-22.913（r=1），表明丹參素鈉在8.4750 g·ml-1之間有良好的線性關(guān)系。丹酚酸B的回歸方程為：Y=18.028X-61.656（r=0.999 9），說明丹酚酸B在9.81.25 g·ml-1之間有良好的線性關(guān)系。1         

11、2.5  精密度試驗精密吸取同一對照品溶液20 l,連續(xù)進樣6次，以峰面積精密度，丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為1.8%，2.1%。2.6  重復性實驗將正交實驗2號平行6份,制成供試品溶液,測定峰面積并計算濃度，丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為2.0%，0.58%。2.7  穩(wěn)定性實驗取正交實驗2號樣品，分別于0，2，4，8，10 h測定丹參素鈉及丹酚酸B峰面積并計算濃度。丹參素鈉和丹酚酸B的RSD分別為3.14%，0.93%。結(jié)果表明樣品在10 h內(nèi)穩(wěn)定。2.8  加樣回收率實驗取已知含量的供試品溶液，分別添加丹參素鈉及丹酚酸B對照品溶液，同法制備

12、成供試品溶液并按上述色譜條件測定其丹參素鈉及丹酚酸B濃度，計算加樣回收率為分別為97.1%，98.1%。結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。2.9  正交實驗設(shè)計與結(jié)果采用正交實驗法，選取溶劑（A）、溶劑加入量（B）、提取時間（C）、提取次數(shù)（D）等4個因素進行考察，各因素為3水平。實驗因素與水平見表1，正交實驗結(jié)果及方差分析見表23。表1  丹參酸提取實驗影響因素與水平（略）表2  L9(34)正交試驗結(jié)果（略）表3  方差分析（略）    表2及表3顯示，以丹參素鈉與丹酚酸B含量之比為考察指標，4個因素的影響大小依次為A&g

13、t;B>C>D；方差分析表明只有溶劑因素對該指標的影響有顯著性意義。從專業(yè)上看最佳條件為A3B2C1D3，即5 g丹參粉，加入到4%鹽酸50 ml中，回流加熱煮沸30 min，提取3次。2.10  重復驗證實驗準確稱取10 g丹參粉，按照A3B2C1D3最佳條件重復實驗3次。結(jié)果見表4。實驗結(jié)果表明本次實驗得到的最佳組合條件與試驗結(jié)果一致，可實際應用。表4  重復驗證實驗結(jié)果（略）3  討論    采用傳統(tǒng)的水煎煮法或回流提取法制備的丹參水提液中，丹參素的含量較低，丹酚酸B的含量則較高，因此不能制備出二者含量相當?shù)奶崛∫?。本研究?chuàng)新之處在于采用酸回流提取的方法，分解一定量的丹酚酸B，使丹參素的含量較水提取增加3倍左右，最終與丹酚酸B含量相當，從而達到防治骨質(zhì)疏松的最佳藥效?！尽?#160; 1國家藥典委員會.藥典，部S. 北京:化學出版社，2005: 52.2劉敏彥，趙韶華，蓋瀟樺，等. 丹參不同提取方法中水溶性成分含量的比較研究J. 時珍國醫(yī)國藥,2007,18(5):1186.3崔燎， 鄒麗宜，