ELISA實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)儀洗板機(jī)的原理和使用

1、.1ELISAELISA實(shí)驗(yàn)、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)實(shí)驗(yàn)、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)的原理和使用的原理和使用.2酶標(biāo)（酶標(biāo)（ELISA） ELISAELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。的簡(jiǎn)稱。 以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)異性反應(yīng)與酶對(duì)底物的高效催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù)合起來的一種敏感性很高的試驗(yàn)技術(shù) 自上世紀(jì)自上世紀(jì)7070年代初問世以來

2、，發(fā)展十分迅年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。的許多領(lǐng)域。.31.ELISA的原理的原理2.ELISA的類型的類型3.試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備酶底物的準(zhǔn)備 4.對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 .4ELISAELISA是一種免疫測(cè)定。是一種免疫測(cè)定?；A(chǔ)基礎(chǔ): :抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)

3、物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.ELISA的原理的原理.5ELISA技術(shù)原理技術(shù)原理 1. 1. 抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記?？乖蚩贵w的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 2. 2. 結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性。性。 3. 3. 酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。的活性。 4. 4. 受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。再加受檢標(biāo)本與固相載體表面的抗原或抗體起反

4、應(yīng)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體入酶標(biāo)記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。上。 5. 5. 此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。例。 6. 6. 加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。測(cè)定方法具有很高的敏感度（感度（pg-ng/mlpg-ng/ml水平），并且重復(fù)性好。水平），并

5、且重復(fù)性好。.61.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表示：表示：K=AgK=AgAbAbAgAb ,AgAgAb ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有關(guān)。值有關(guān)。高親高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者

6、結(jié)合牢固，不易解離。適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離后的抗原或抗體均解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。.71.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。.81.1.31.1.3最適比例最適比例 .91.1.41.1.4敏感性敏感性化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平

7、水平酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達(dá)，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml0.1ng/ml。.102 2ELISAELISA的類型的類型 ELISAELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：方法中有三個(gè)必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，

8、即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反應(yīng)的底物。）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 .11雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于用

9、于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法。而建立此法。樣品（抗原）樣品（抗原）酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體底物底物酶標(biāo)儀測(cè)定酶標(biāo)儀測(cè)定OD值值終止終止液液.12雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAgHBsAg的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)

10、的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。適的標(biāo)記方法。.133. ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。底物。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；A（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）； B（3 3）酶的底物；）酶的底物； C（4 4）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；）陰性對(duì)照品和陽性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋

11、液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液.143.1 ELISA3.1 ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備 A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度吸附性能好，空白值低，孔底透明度高高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。性能相近。 將抗原或抗體固定在過程稱為將抗原或抗體固定在過

12、程稱為包被包被(coating(coating) )。 封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再是繼包被之后用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，包被的過程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。 常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（比較價(jià)廉，可以高濃度使用

13、（5%5%）。）。 洗滌液：洗滌液：在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷磷酸鹽緩沖液。酸鹽緩沖液。.153.2 ELISA3.2 ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備 B B 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試劑中關(guān)鍵的試劑 1. 1. 酶的催化活性酶的催化活性 2. 2. 抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的免疫活性 3. 3. 含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4. 4. 結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。.

14、16酶酶 純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。 酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。 在在ELISAELISA中，中，HRPHRP（辣根過氧化物酶），（辣根過氧化物酶），APAP（堿性磷酸酶），葡萄糖氧（堿性磷酸酶），葡萄糖氧化酶，化酶，-D-D-半乳糖苷酶和脲酶等。半乳糖苷酶和脲酶等。HRPHRP是一種糖蛋白，含糖量

15、約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一種復(fù)合酶，由，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行

16、反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISAELISA中中用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是用酶標(biāo)抗原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度抗原必須是高純度的。的。.173.3 3.3 試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備 C C 酶的底物酶的底物 DHDH2 2+ H+ H2 2O O2 2 D+ 2H D+ 2H2 2O O DH DH2 2為供氧體，為供氧體， H H2 2O O2 2為受氫體。為受氫體。 DHDH2 2一般為無色化合物，經(jīng)一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。酶作用后成為有色的產(chǎn)物。 DHDH2 2如：如：鄰苯二胺鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和A

17、BTSABTS 。 OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm492nm處有最高吸處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是收峰，靈敏度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)合物最常用的底物。結(jié)合物最常用的底物。 TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為在比色計(jì)中定

18、量，最適吸收波長(zhǎng)為450nm450nm。 ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。E3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物 HRP HRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H H2 2O O2 2、小分醇的過氧、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物化物和尿素過氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 .18 AP AP的底物為磷酸酯酶，一般采用的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯對(duì)硝基苯磷酸酯作為作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在底物

19、。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm405nm波長(zhǎng)處有吸收波長(zhǎng)處有吸收峰。用峰。用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。APAP也有也有發(fā)發(fā)熒光底物（磷酸熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮），甲基傘酮），可用于可用于ELISAELISA作熒光作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。3.3.2 AP的底物的底物3.3.3 酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)終止液常用的常用的HRPHRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式色液的最終體積而異，在板式ELISAELISA中一般采用

20、中一般采用2mol/L2mol/L。.193.4 3.4 對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定 陽性對(duì)照品陽性對(duì)照品(positive control)(positive control)和陰性對(duì)照品和陰性對(duì)照品(negative (negative control)control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。的對(duì)照。陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含陽性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；在測(cè)定中

21、得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。質(zhì)的量。.20參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的4-54-5個(gè)個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中. .陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢測(cè)的陰檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含性對(duì)照品中

22、不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。.21酶標(biāo)基本步驟酶標(biāo)基本步驟用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法用于檢測(cè)未知抗原的雙抗體夾心法: : 1. 1. 包被：包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為110gml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。(簡(jiǎn)稱洗滌，下同)。 2. 2. 加樣：加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37孵育1小時(shí)。然后洗滌。(同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔)。 3. 3. 加酶標(biāo)抗體：加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入

23、新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37孵育0.51小時(shí)，洗滌。 4. 4. 加底物液顯色：加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml 371030分鐘。 5. 5. 終止反應(yīng)：終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。 6. 6. 結(jié)果判定：結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELX808酶標(biāo)儀上，于450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。.

24、22.23加樣加樣 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马?xiàng)：基本操作注意事項(xiàng)：基本操作：基本操作： 加樣；加樣； 溫育；溫育； 洗滌；洗滌； 讀板；讀板；.24溫育溫育 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過程稱為溫育(incubation)(incubation)。 溫育常采用的溫度有溫育

25、常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度）（冰箱溫度）等。等。3737是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。結(jié)合的合適溫度。.25洗滌洗滌 洗滌在洗滌在ELISAELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。 目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)目的是洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì) 洗滌步驟：洗滌步驟： 1. 1. 吸干孔內(nèi)反應(yīng)液；吸

26、干孔內(nèi)反應(yīng)液； 2. 2. 將洗滌液注滿板孔；將洗滌液注滿板孔； 3. 3. 放置放置2min2min，略作搖動(dòng)；，略作搖動(dòng)； 4. 4. 吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為的次數(shù)一般為3 34 4次，有時(shí)甚至需洗次，有時(shí)甚至需洗5 56 6次。次。.26洗板機(jī)洗板機(jī) 手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間，目前市手工洗滌流速較難控制，步驟繁瑣且耗費(fèi)時(shí)間，目前市面上多種洗板機(jī)可供選擇，其中以美國(guó)寶特的面上多種洗板機(jī)可供選擇，其中以美國(guó)寶特的BIO-TEK BIO-TEK ELX50 ELX50 洗板機(jī)最為突出洗板機(jī)最為突出

27、 洗板機(jī)優(yōu)勢(shì)：洗板機(jī)優(yōu)勢(shì)： 自動(dòng)化控制自動(dòng)化控制 精確度高精確度高 速度快（最快小于速度快（最快小于20S20S每板每板/ /每循環(huán)）每循環(huán)）細(xì)胞包被層細(xì)胞包被層ELx50ELx50洗滌洗滌速度可調(diào)、角度最佳速度可調(diào)、角度最佳手工洗滌或一般機(jī)器洗滌手工洗滌或一般機(jī)器洗滌角度不好，速度太快角度不好，速度太快.27洗板機(jī)使用注意事項(xiàng) 1 1、 有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效有一定地洗滌次數(shù)：多次洗滌有利于取得好的效果，一般不超過果，一般不超過6 6次。次。 2 2、 注意每孔的加液量：以加滿為宜，但不可溢出，注意每孔的加液量：以加滿為宜，但不可溢出，一般為每控一般為每控300300微升

28、。微升。 3 3、 建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，建議在洗滌前進(jìn)行位置調(diào)節(jié)，吸針要到微孔底部，以降低殘留量。因?yàn)橐话阋越档蜌埩袅?。因?yàn)橐话鉋LISAELISA實(shí)驗(yàn)洗滌結(jié)束后要求實(shí)驗(yàn)洗滌結(jié)束后要求扣板，但此步驟在扣板，但此步驟在PCR-ELISAPCR-ELISA中易造成污染，故殘留中易造成污染，故殘留量應(yīng)盡量減少。不能象一般量應(yīng)盡量減少。不能象一般ELISAELISA操作一樣用力扣板。操作一樣用力扣板。 4 4、 建議用戶采用兩點(diǎn)吸液與底部沖洗方式，以得到建議用戶采用兩點(diǎn)吸液與底部沖洗方式，以得到好的洗滌效果。好的洗滌效果。 5 5、 如果作如果作PCR-ELISAPCR-ELI

29、SA液罐應(yīng)加有液罐應(yīng)加有1%1%次氯酸鈉，加入次氯酸鈉，加入的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。每天使用完畢后應(yīng)用的量不得少于產(chǎn)生廢液的量。每天使用完畢后應(yīng)用1%1%次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。次氯酸鈉沖洗管路及清洗頭，然后用雙蒸水沖洗管路。 6 6、 定期維護(hù)、檢修儀器及配件。定期維護(hù)、檢修儀器及配件。 .28洗板機(jī)的應(yīng)用范圍洗板機(jī)的應(yīng)用范圍 所有涉及到所有涉及到9696孔板換液、孵育、洗滌的實(shí)驗(yàn)：孔板換液、孵育、洗滌的實(shí)驗(yàn)： ELISAELISA 熒光熒光ELISAELISA 細(xì)胞洗滌細(xì)胞洗滌 In Cell WesternIn Cell Western .29顯色顯色 顯色是酶

30、催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。顯色是酶催化無色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。 反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速持無色，而陽性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。顯色進(jìn)行。比色比色/ /讀板讀板 將將9696孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（孔板正確放入酶標(biāo)比色儀中，以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以

31、生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸本作全過程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。 結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplical densityoplical density，OD/OD/吸光度（吸光度（absorbenceabsorbence，A A）表）表示，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于示，兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A A字母的右下字母的右下角，如角，如OPDOPD的

32、吸收波長(zhǎng)為的吸收波長(zhǎng)為492nm492nm，表示方法為，表示方法為A492nmA492nm或或OD492nmOD492nm。.30酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀 酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISAELISA光度計(jì)。光度計(jì)。美國(guó)寶特美國(guó)寶特BioTek ELX800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀全自動(dòng)酶標(biāo)儀鍵盤格式.31酶標(biāo)儀的檢測(cè)原理酶標(biāo)儀的檢測(cè)原理 酶標(biāo)儀測(cè)定的原理是在特定波長(zhǎng)下，檢測(cè)被測(cè)物的吸酶標(biāo)儀測(cè)定的原理是在特定波長(zhǎng)下，檢測(cè)被測(cè)物的吸光值。光值。 檢測(cè)單位：檢測(cè)單位： 光通過被檢測(cè)物，前后的能量差異即是被檢測(cè)物吸收掉的能量，特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量特定

33、波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系關(guān)系。 檢測(cè)單位用OD值表示， OD是optical delnsity（光密度）的縮寫，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度， OD1og（1trans），其中trans為檢測(cè)物的透光值。 在特定波長(zhǎng)下測(cè)定每一種物質(zhì)都有其特定的波長(zhǎng)在特定波長(zhǎng)下測(cè)定每一種物質(zhì)都有其特定的波長(zhǎng)，在此波長(zhǎng)下，此物質(zhì)能夠吸收最多的光能量。如果選擇其它的波長(zhǎng)段，就會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，在測(cè)定檢測(cè)物時(shí)，我們選擇特在測(cè)定檢測(cè)物時(shí)，我們選擇特定的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，稱為測(cè)量波長(zhǎng)定的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，稱為測(cè)量波長(zhǎng)。 .32酶標(biāo)儀配件酶標(biāo)儀配件 光源：光源： 氙閃燈（波譜寬、低熱輻射、壽命

34、長(zhǎng)，但是可見氙閃燈（波譜寬、低熱輻射、壽命長(zhǎng)，但是可見區(qū)能量低）區(qū)能量低） 鹵素?zé)簦ú荒苡糜谧贤鈪^(qū)，可見區(qū)能量強(qiáng)鹵素?zé)簦ú荒苡糜谧贤鈪^(qū)，可見區(qū)能量強(qiáng)）ELx800光源：鹵鎢燈光源.33酶標(biāo)儀配件酶標(biāo)儀配件 濾光片和單色器：濾光片和單色器：濾光片和單色器各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇濾光片還是單色器和具體的實(shí)濾光片和單色器各有優(yōu)缺點(diǎn)，選擇濾光片還是單色器和具體的實(shí)驗(yàn)要求有關(guān)。驗(yàn)要求有關(guān)。光吸收光吸收ELISA： 單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴?qiáng)大，兩者的靈敏度不相上下，單色器優(yōu)于濾光片，由于鹵素?zé)艄鈴?qiáng)大，兩者的靈敏度不相上下，單色器更為靈活、方便使用。單色器更為靈活、方便使用。熒光檢測(cè)熒光檢測(cè)ELISA 各有優(yōu)缺點(diǎn)，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特各有優(yōu)缺點(diǎn)，單色器靈活，但是靈敏度低、特異性差；濾光片特異性好、靈敏度高，但靈活性不足。一般異性好、靈敏度高，但靈活性不足。一般ELISA都是使用常用的都是使用常用的熒光素，對(duì)科研工作者來講濾光片較好。熒光素，對(duì)科研工作者來講濾光片較好。ELx800 標(biāo)配濾光片405, 450, 490, 630 nm連續(xù)波長(zhǎng)(采用單色器).34 MD MD 公司：公司：業(yè)界老大，產(chǎn)品質(zhì)量過硬，做工精細(xì)。但對(duì)中國(guó)支持服務(wù)較