瓊脂糖凝膠電泳解讀

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上瓊脂糖凝膠電泳1.原理瓊脂糖凝膠電泳是用作支持介質的一種方法。其分析原理與其他支持物電泳最主要區(qū)別是：它兼有“”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡結構，物質分子通過時會受到，大分子物質在涌動時受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當大，對大多數(shù)來說其微不足道，現(xiàn)廣泛應用于的研究中。蛋白質和核酸會根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個原理可將其分開。的pH在69之間，0.020.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠

2、約可區(qū)分相差100bp的DNA片段，其分辨率雖比低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達107bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。2操作流程準備干凈的配膠板和電泳槽瓊脂糖凝膠電泳：水平電泳注意污染的儀器可能會降解DNA，造成條帶信號弱、模糊甚至缺失的現(xiàn)象。(1)電泳方法一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；如果需要分辨率高的電泳

3、，特別是只有幾個bp的差別應該選擇；用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應該使用脈沖凝膠電泳。注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導致缺帶。(2)凝膠濃度對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.52%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。低濃度膠易碎，小心操作和使用質量好的瓊脂糖是解決辦法。注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。(3)緩沖液常用的緩沖液有和，而比有著更好的。電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。三羥甲基

4、氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般簡稱為Tris）是一種有機化合物，其分子式為(HOCH2)3CNH2。Tris被廣泛應用于生物化學和分子生物學實驗中的緩沖液的制備。例如，在生物化學實驗中常用的TAE和TBE緩沖液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。(4)電壓和溫度電泳時電壓不應該超過20V/cm，電泳溫度應該低于30，對于巨大的DNA電泳，溫度應該低于15。注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。特別是電壓太大可能導致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象(5)DNA樣品的純度和狀態(tài)注意樣品中含鹽量太高和含雜質蛋白均可

5、以產生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。注意變性的DNA樣品可能導致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mM NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。(6)DNA的上樣正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。注意太多的DNA上樣量可能導致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導致帶信號弱甚至缺失。(7)Marker的選擇DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。Marker應該選擇在目標片段大小附近ladder較密的，這樣對目標片段大小的估計才比較準確。需要注意的是Mar

6、ker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標準。如果選擇DNA/HindIII或者DNA/EcoRI的酶切Marker，需要預先65加熱5min，冰上冷卻后使用。從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。(8)凝膠的染色和觀察實驗室常用的核酸染色劑是（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。注意觀察凝膠時應根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。3回收(1)DNA片段的膠回收方法電泳洗脫法低熔點瓊脂糖凝膠電泳挖塊法凍融回收法玻璃奶回收法柱回收法(2)膠回收注意事項a.將電泳槽用dd

7、H2O反復清洗干凈，倒入新鮮配制的滅菌電泳緩沖液；b.根據(jù)點樣量制備合適厚度的瓊脂糖凝膠板；c.切膠時盡可能切掉不含DNA片段的凝膠；d.要盡量減少DNA在紫外下的照射時間以減少對DNA的損傷；e.熔膠要完全。loading bufferloading buffer 的中文名字叫上樣，6*的緩沖液中可以顯示兩條帶，前面的紫蘭色的條帶是，在0.6%、1%、1.4%和2%瓊脂糖凝膠電泳中，溴酚蘭的遷移率分別與1Kb、0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的雙鏈線性DNA片段大致相同；后面的蘭色條帶是二甲苯青，它在1%和1.4%瓊脂糖中電泳時，其遷移速率分別與2Kb和1.6Kb的雙鏈線性DNA大致相似

8、。而對于PAGE膠他們的遷移速率也分別不同。1.主要用途loading buffer的功能主要有兩個：第一，里邊的指示劑和二甲苯青FF起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便我們適時終止電泳；第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會寫明。SDS主要是促使變性，因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鏈上影響它的。細胞裂解后的裂解液，加loading 100加熱，也是為了中止酶促反應，防止提取的。2.制備方法 loading buffer 一般配置：(1) 6×Loading buffer

9、:30mM EDTA36%(v/v) Glycerol0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF0.05%(w/v) Bromophenol Blue主要用于DNA電泳(2) 10×Loading buffer:30mM EDTA50%(v/v) Glycerol0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF0.25%(w/v) Bromophenol Blue主要用于RNA電泳注：（1）10×loading buffer中僅有色素溴酚藍（Bromophenol Blue)一種染料（濃度0.05%）； （2）6×loading buffer中含

10、色素溴酚藍（Bromophenol Blue)、二甲苯青藍FF（Xylene Cyanol FF)兩種染料（濃度都是0.05%） 在瓊脂糖凝膠（0.5% 1.4%）中溴酚藍（Bromophenol Blue）約與300 bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，二甲苯腈藍FF則與4 kbp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等。6×loading buffer是用來上樣的；10×loading buffer是stop buffer，是停止酶促反應的，如果一定要用10×loading buffer的上樣當然也可以，唯一要注意的是：10×loading buffer中多了

11、一樣SDS，它會使酶類如taq酶變性，以PCR產物為例，在電泳泳道上會產生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來一條帶沒有什么區(qū)別（大概1000bp左右）。(3) 5×SDS-PAGE Loading Buffer配制方法組份濃度：250mM （pH6.8）10%（W/V） SDS0.5%（W/V） BPB50%（V/V） 甘油5%（W/V） 配制量： 5mL配制方法：1.量取下列試劑，置于10mL塑料離心管中。1M Tris-HCl 1.25mLSDS（ 十二烷基硫酸鈉 ） 0.5gBPB（溴酚藍） 25mg甘油 2.5mL2.加入去離子水溶解后定容至

12、5mL。3.小份（500l/份）分裝后，于保存。4.使用前將25l的2-ME加到每小份中。5.加入2-ME的Loading Buffer可在下保存一個月左右16S 核糖體RNA1.簡介16S （16S ribosomal RNA，或簡稱為 ）是1 分。16S rRNA的長度約為1,542 nt。一個細菌的細胞中可包含多種具有不同序列的16S rRNA已知16S rRNA具有如下幾項功能：16S rRNA具有與原核生物核糖體大亞基中的23S rRNA相似的結構決定功能，可作為核糖體蛋白質結合的架構。在足量Mg2+存在下分離到的16S rRNA處于緊密狀態(tài)，其空間結構

13、與30S 亞基的大小和形狀十分相似。16S rRNA的3'端含有能與mRNA上游AUG起始密碼子通過氫鍵結合的反夏因-達爾加諾序列。另有發(fā)現(xiàn)表明，16S rRNA中1,5051,539的CCUCC序列與mRNA的相應序列有互補關系。16S rRNA能通過氫鍵與23S rRNA結合，增強原核生物70S 核糖體一大一小兩個亞基（50S 亞基與30S 亞基）結合時的穩(wěn)定性。16S rRNA能通過其1,492及1,493的腺嘌呤殘基（參見嘌呤分子結構圖解）的N1原子與mRNA骨架上的2'OH基團之間產生氫鍵，使核糖體A位密碼子反密碼子的堿基互補配對穩(wěn)定化。2.通用前體由于不同種的真細菌

14、與古細菌間的16S rRNA基因（16S rDNA）是高度保守的，16S rDNA常被用于對各種生物進行的系統(tǒng)發(fā)育學方面的研究這種運用16S rRNA對生物進行系統(tǒng)發(fā)育學研究的方法由卡爾·沃斯（Carl Woese）開創(chuàng)。另外，線粒體和葉綠體中的rRNA也都被擴增了。 在獲得能提供系統(tǒng)發(fā)育學信息的16S rRNA分子時需要利用通用PCR引物對16S rRNA分子進行擴增。 16S rRNA序列的對比分析需要在這類“通用引物”的脫氧核糖核酸分子的輔助下完成，這類分子具有如下序列：8UA正向：5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3'519B反向：5

15、-GTA TTA CCG CGG CKG CTG-3'反向：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT這類引物因并未在近期發(fā)現(xiàn)的幾種屬于納古菌門（Nanoarchaeota）的熱液古菌中分離識別出來，也被稱為準通用引物。3.進化指征在眾多的生物大分子中，最適合于提示各類生物親緣關系的是rRNA,尤其是16S rRNA被普遍認為是一把好的譜系的“分子尺”這是因為：（1） rRNA參與生物蛋白質的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進化的漫長經歷中其可能保持不變。（2）在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于

16、進化距離不同的各類生物。（3） 16S rRNA相對分子質量大小適中，便于分析。在5S rRNA、23S rRNA和16S rRNA三種分子中，5S rRNA包含120個核苷酸，雖然它也可以作為一種信息分子加以利用，但由于其信息量小應用上受到限制。23S rRNA蘊含著大量的信息，但序列測量和分析比較的工作量較大。而16S rRNA相對分子質量大小適中（約含1540個核苷酸）含有比較廣泛的的生物信息量，加上rRNA在細胞中含量大（約占細胞中RNA的90%）也易于提取。4. 16S rRNA普遍存著于真核生物和原核生物中，真核生物中其同源分子是18S rRNA。專心-專注-專業(yè) 讀書的好處1、行萬里路，讀萬卷書。2、書山有路勤為徑，學海無涯苦作舟。3、讀書破萬卷，下筆如有神。4、我所學到的任何有價值的知識都是由自學中得來的。達爾文5、少壯不努力，老大徒悲傷。6、黑發(fā)不知勤學早，白首方悔讀書遲。顏真卿7、寶劍鋒從磨礪出，梅花香自苦寒來。8、讀書要三到：