臨床檢驗標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法

1、臨床檢驗標(biāo)本的處理保臨床檢驗標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法存及核酸提取方法第一頁，共56頁。臨床標(biāo)本的正確采集、運送、保存臨床標(biāo)本的正確采集、運送、保存的重要性的重要性l臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)臨床檢驗的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)l解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一解決涉及實驗室檢驗的醫(yī)患糾紛的方法之一第二頁，共56頁。核酸提取的重要性核酸提取的重要性l核酸提取是臨床PCR檢驗最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分l核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗的正確與否l臨床PCR檢驗操作中最易出問題的環(huán)節(jié)第三頁，共56頁。標(biāo)本采集標(biāo)本采集l標(biāo)本采集時間對擴增檢測結(jié)果的影響 l標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 l標(biāo)本的

2、類型和采集量 l采樣質(zhì)量的評價 l采樣及運輸容器 l標(biāo)本采集中的防污染 第四頁，共56頁。標(biāo)本運送標(biāo)本運送 l樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測實驗室。l樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運送或郵寄。l實驗室應(yīng)根據(jù)待測靶核酸的特性，對各種臨床樣本的運送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。第五頁，共56頁。臨床標(biāo)本的處理和保存臨床標(biāo)本的處理和保存l血清（漿）l全血l外周血單個核細胞l痰l棉拭子l膿液l體液l乳汁l組織第六頁，共56頁。血清（漿）血清（漿）lDNA測定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對測定影響不大。lRNA測定

3、，標(biāo)本的獲取和保存方式對測定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴禁使用肝素，因其對PCR擴增有抑制，且很難在核酸提取過程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時內(nèi))分離血清，標(biāo)本的短期（12周）保存可在-20下，較長期保存應(yīng)在-70下。 第七頁，共56頁。全血全血l以全血作為待測標(biāo)本時,必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。l全血樣本如用于DNA提取檢測,可4下短期保存,如用于RNA檢測，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA 。第八頁，共56頁。外周血單個核細胞外周血單個核細胞 l外周血單個核細胞可從抗凝全血制備，主

4、要有兩條途徑，一是使用淋巴細胞分離液分離制備；二是使用紅細胞裂解液,裂解全血中的紅細胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個核細胞。l外周血單個核細胞如暫不提取核酸,可保存于-70下.第九頁，共56頁。痰痰l痰屬于分泌物,臨床上常用作為結(jié)核桿菌DNA測定標(biāo)本。l痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時,需對樣本進行初步處理，即用1 mol/L NaOH或變性劑液化。l如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 l液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下。第十頁，共56頁。痰標(biāo)本處

5、理的基本模式痰標(biāo)本處理的基本模式l通用模式l簡單模式第十一頁，共56頁。痰標(biāo)本處理通用模式痰標(biāo)本處理通用模式l試劑：（1）通用標(biāo)本處理（Universal sample processing, USP）溶液：由4-6 mol/L鹽酸胍（GuHCl），50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和0.10.2 mol/L -巰基乙醇。（2）0.05%Tween 80。（3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)第十二頁，共56頁。第十三頁，共56頁。痰標(biāo)本處理簡單模式痰標(biāo)

6、本處理簡單模式 l試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1 mol/L NaOH、50g蛋白酶K和0.05% Triton X-100第十四頁，共56頁。第十五頁，共56頁。痰標(biāo)本處理中要注意的問題痰標(biāo)本處理中要注意的問題l痰標(biāo)本在沒有加入內(nèi)標(biāo)以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采用這種方法提取，有可能會在提取過程中，出現(xiàn)一種可修飾DNA的酶，在最后一步提取中，與核酸一起洗提出來，從而抑制其后的擴增。l在PCR主反應(yīng)混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此類抑制物產(chǎn)生的效果。 第十六頁，共56頁。棉拭子棉拭子l在使用PCR方法檢測性病病原體

7、時,臨床標(biāo)本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置510分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。l如不立即用于核酸提取,則需保存于-70下.第十七頁，共56頁。膿液膿液l膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測定的標(biāo)本,粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗23次后,即可用于DNA提取。l對于用于非分枝桿菌測定的膿液標(biāo)本,如過于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。l沉淀

8、標(biāo)本的保存條件同樣為-70。第十八頁，共56頁。體液體液l臨床體液標(biāo)本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。第十九頁，共56頁。乳汁乳汁l 乳汁有時也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測。 第二十頁，共56頁。乳汁中布魯菌乳汁中布魯菌DNA的提取的提取l試劑準(zhǔn)備 NET緩沖液: 50mmol/L NaCl, 125mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl pH7.6; 24%十二烷基硫酸鈉（SDS）; 蛋白酶K; RNase。 第二十一頁，共56頁。第二十二頁，共56

9、頁。乳汁中分枝桿菌乳汁中分枝桿菌DNA的提取的提取l試劑準(zhǔn)備 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 異硫氰酸胍鹽（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸鈉。 玻璃珠：（直徑：425-600um）第二十三頁，共56頁。第二十四頁，共56頁。組織組織 l組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加

10、入適量的生理鹽水,然后,邊搖邊加入無水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日,4可保存6年。l石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進行DNA提取。第二十五頁，共56頁。臨床標(biāo)本的濾紙上保存臨床標(biāo)本的濾紙上保存l臨床標(biāo)本置于經(jīng)過處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。 l保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時間長，還可因為標(biāo)本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對后面的擴增檢測造成影響。 l不管是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。 第二十六頁，共56頁。臨床標(biāo)本中

11、臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物反應(yīng)抑制物l內(nèi)源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。 l外源性的 :如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。 第二十七頁，共56頁。肝素的作用機理肝素的作用機理 l肝素對MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ DNA聚合酶均很強的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。l對標(biāo)本進行煮沸、凝膠過濾、酸堿處理后凝膠過濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。

12、l每g核酸標(biāo)本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。l在標(biāo)本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 2小時) 可去除肝素的抑制作用。第二十八頁，共56頁。血紅蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin）l血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細胞和白細胞內(nèi)的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。l抑制機制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）亞鐵血紅素(Heme)可通過返饋抑

13、制調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性及協(xié)調(diào)紅細胞內(nèi)血紅蛋白成分的合成。也觀察到，氯化高鐵血紅素通過直接作用于DNA聚合酶，與成為一個與靶DNA競爭的抑制劑和核苷酸的非競爭性抑制劑 。（3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有機物質(zhì)包裹所致，使得靶DNA不能接觸DNA聚合酶。第二十九頁，共56頁。血紅蛋白血紅蛋白l1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，與Mg2+濃度無關(guān)。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反應(yīng)混合液中可以進行擴增，加入1U單鏈DNA結(jié)合蛋白T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情況下，仍可擴增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可實現(xiàn)從臨床標(biāo)本不提取純

14、化核酸直接擴增靶DNA。l不同的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶對臨床標(biāo)本中的抑制物的敏感性不一樣 。第三十頁，共56頁。IgG lIgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用 l使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動,將增強IgG對PCR反應(yīng)的抑制 第三十一頁，共56頁。去除或減輕抑制的一些方法去除或減輕抑制的一些方法lNaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的Taq DNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標(biāo)本，因為NaOH處理可使DNA大量丟失。第三十二頁，共56頁。去除或減輕抑制的一些方法去除或減輕抑制的一些方法l加入0.6% (wt/vol)牛血

15、清白蛋白（BSA）可降低血液對Taq DNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴增，而通常血液含量只能是0.2%。lBSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的擴增能力，使其對糞便和肉類標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。l單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類似BSA的增強效應(yīng)。第三十三頁，共56頁。核酸純化l核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。l傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。 第三十四頁，共56頁。一般核酸提取試劑促

16、使靶核酸從細胞內(nèi)釋出的原理l靶核酸可以與宿主細胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細胞內(nèi)，如測定的是病原微生物,則靶核酸存在于細菌、病毒、原蟲或真菌細胞內(nèi)，如果上述細胞破裂,則靶核酸亦可存在于細胞外。 l一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細胞內(nèi)釋放出來。第三十五頁，共56頁。核酸的分離純化核酸的分離純化 l核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類等干擾核酸擴增的物質(zhì)去除。 l經(jīng)典方法l硅吸附法l對于商品核酸提取試劑盒，臨床實驗室在使用前，必須對其核酸提取純度和效率進行評價。 第三十六頁，共56頁。DNA提取的經(jīng)典方

17、法l即所謂的”酚-氯仿提取法” 第三十七頁，共56頁。第三十八頁，共56頁。RNA提取的獨特性提取的獨特性l臨床標(biāo)本及實驗室環(huán)境中,存在大量對RNA具有強烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。l如何避免RNase對標(biāo)本的污染及防止RNase對提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。 第三十九頁，共56頁。 RNA提取所用器皿的處理提取所用器皿的處理l經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA. l實驗室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180干烤8小時以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(

18、DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。lDEPC是RNase的強烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37下放置2小時，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過羧甲基化作用對RNA的嘌呤堿基進行修飾。第四十頁，共56頁。RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備提取所用溶液的準(zhǔn)備 l對于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過的藥匙稱取試劑,將溶液裝入無RNase的玻璃器皿。可能的話,溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37至少處理12小時,然后于100加熱15分鐘或高壓蒸汽滅

19、菌15分鐘。l須注意的是,DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來處理含有Tris一類的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開封的Tris試劑以制備無RNase的溶液。第四十一頁，共56頁。RNA提取中提取中RNase 污染的控制污染的控制l實驗操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來源。 l策略是： 在準(zhǔn)備用于RNA純化的實驗材料和溶液時,以及在涉及RNA的整個提取操作過程中,都應(yīng)戴一次性手套。 在RNA提取實驗中，應(yīng)勤換手套。第四十二頁，共56頁。RNA提取的常用方法提取的常用方法 l表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。l胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。l胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸

20、浮吸附法等。第四十三頁，共56頁。異硫氰酸胍（異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿）結(jié)合氯仿-酚提取法酚提取法 第四十四頁，共56頁。核酸提取的改良方法核酸提取的改良方法 l旋轉(zhuǎn)離心柱（SPIN COLUMN）方法l玻璃粉吸附法 l二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 l微量全血核酸提取法 ：NaI 方法l其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自動核酸純化儀第四十五頁，共56頁。旋轉(zhuǎn)離心柱（旋轉(zhuǎn)離心柱（SPIN COLUMN）l屬于硅吸附方法的一種。在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€部分：第一部分是利用裂解液促使細胞破碎，使細胞中的核酸釋放出來；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對核酸有較強的親和力和吸附力而對其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來，從而得到純化的核酸。 第四十六頁，共56頁。第四十七頁，共56頁。第四十八頁，共56頁。玻璃粉吸附法玻璃粉吸附