臨床檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法

1、臨床檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保臨床檢驗(yàn)標(biāo)本的處理保存及核酸提取方法存及核酸提取方法第一頁(yè)，共56頁(yè)。臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存臨床標(biāo)本的正確采集、運(yùn)送、保存的重要性的重要性l臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)臨床檢驗(yàn)的質(zhì)量保證關(guān)鍵性環(huán)節(jié)l解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一解決涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的醫(yī)患糾紛的方法之一第二頁(yè)，共56頁(yè)。核酸提取的重要性核酸提取的重要性l核酸提取是臨床PCR檢驗(yàn)最為關(guān)鍵的部分，亦是手式操作的主要部分l核酸提取的成敗關(guān)系到臨床PCR檢驗(yàn)的正確與否l臨床PCR檢驗(yàn)操作中最易出問(wèn)題的環(huán)節(jié)第三頁(yè)，共56頁(yè)。標(biāo)本采集標(biāo)本采集l標(biāo)本采集時(shí)間對(duì)擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果的影響 l標(biāo)本采集部位的準(zhǔn)備 l標(biāo)本的

2、類(lèi)型和采集量 l采樣質(zhì)量的評(píng)價(jià) l采樣及運(yùn)輸容器 l標(biāo)本采集中的防污染 第四頁(yè)，共56頁(yè)。標(biāo)本運(yùn)送標(biāo)本運(yùn)送 l樣本一經(jīng)采集，則應(yīng)盡可能快的送至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室。l樣本中如加入了適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑,如用于RNA測(cè)定加入GITC的血清(漿)樣本和用于DNA測(cè)定的EDTA抗凝血等,則可在室溫下運(yùn)送或郵寄。l實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)待測(cè)靶核酸的特性，對(duì)各種臨床樣本的運(yùn)送條件作出相應(yīng)的規(guī)定。第五頁(yè)，共56頁(yè)。臨床標(biāo)本的處理和保存臨床標(biāo)本的處理和保存l血清（漿）l全血l外周血單個(gè)核細(xì)胞l痰l棉拭子l膿液l體液l乳汁l組織第六頁(yè)，共56頁(yè)。血清（漿）血清（漿）lDNA測(cè)定，可按照一般的血清標(biāo)本處理程序，對(duì)測(cè)定影響不大。lRNA測(cè)定

3、，標(biāo)本的獲取和保存方式對(duì)測(cè)定結(jié)果，可能有決定性影響。最好是使用EDTA抗凝(嚴(yán)禁使用肝素，因其對(duì)PCR擴(kuò)增有抑制，且很難在核酸提取過(guò)程中完全去除)全血標(biāo)本，抗凝后6小時(shí)內(nèi)分離血漿，如使用血清標(biāo)本，則需盡快(2小時(shí)內(nèi))分離血清，標(biāo)本的短期（12周）保存可在-20下，較長(zhǎng)期保存應(yīng)在-70下。 第七頁(yè)，共56頁(yè)。全血全血l以全血作為待測(cè)標(biāo)本時(shí),必須注意抗凝劑的選擇,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸鈉,不可使用肝素。l全血樣本如用于DNA提取檢測(cè),可4下短期保存,如用于RNA檢測(cè)，則應(yīng)在取血后，盡快提取RNA 。第八頁(yè)，共56頁(yè)。外周血單個(gè)核細(xì)胞外周血單個(gè)核細(xì)胞 l外周血單個(gè)核細(xì)胞可從抗凝全血制備，主

4、要有兩條途徑，一是使用淋巴細(xì)胞分離液分離制備；二是使用紅細(xì)胞裂解液,裂解全血中的紅細(xì)胞,經(jīng)生理鹽水?dāng)?shù)次洗滌,即可得到單個(gè)核細(xì)胞。l外周血單個(gè)核細(xì)胞如暫不提取核酸,可保存于-70下.第九頁(yè)，共56頁(yè)。痰痰l痰屬于分泌物,臨床上常用作為結(jié)核桿菌DNA測(cè)定標(biāo)本。l痰標(biāo)本中含有大量粘蛋白和雜質(zhì),故在核酸提取時(shí),需對(duì)樣本進(jìn)行初步處理，即用1 mol/L NaOH或變性劑液化。l如用于非結(jié)核桿菌如肺炎支原體的PCR檢測(cè)，痰標(biāo)本只能室溫懸浮于生理鹽水中，充分振蕩混勻，促使大塊粘狀物下沉，取上清離心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 l液化標(biāo)本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下。第十頁(yè)，共56頁(yè)。痰標(biāo)本處

5、理的基本模式痰標(biāo)本處理的基本模式l通用模式l簡(jiǎn)單模式第十一頁(yè)，共56頁(yè)。痰標(biāo)本處理通用模式痰標(biāo)本處理通用模式l試劑：（1）通用標(biāo)本處理（Universal sample processing, USP）溶液：由4-6 mol/L鹽酸胍（GuHCl），50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和0.10.2 mol/L -巰基乙醇。（2）0.05%Tween 80。（3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20)第十二頁(yè)，共56頁(yè)。第十三頁(yè)，共56頁(yè)。痰標(biāo)本處理簡(jiǎn)單模式痰標(biāo)

6、本處理簡(jiǎn)單模式 l試劑：（1）裂解液:含終濃度0.1 mol/L NaOH、50g蛋白酶K和0.05% Triton X-100第十四頁(yè)，共56頁(yè)。第十五頁(yè)，共56頁(yè)。痰標(biāo)本處理中要注意的問(wèn)題痰標(biāo)本處理中要注意的問(wèn)題l痰標(biāo)本在沒(méi)有加入內(nèi)標(biāo)以控制假陰性的情況下，不能采用異硫氰酸胍鹽（GuSCN）方法提取。采用這種方法提取，有可能會(huì)在提取過(guò)程中，出現(xiàn)一種可修飾DNA的酶，在最后一步提取中，與核酸一起洗提出來(lái)，從而抑制其后的擴(kuò)增。l在PCR主反應(yīng)混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此類(lèi)抑制物產(chǎn)生的效果。 第十六頁(yè)，共56頁(yè)。棉拭子棉拭子l在使用PCR方法檢測(cè)性病病原體

7、時(shí),臨床標(biāo)本一般為棉拭子,可將棉拭子置于適量生理鹽水中,充分震蕩洗滌后,室溫靜置510分鐘,待大塊狀物下沉后,取上清立即離心,其后的沉淀即可用于DNA提取。l如不立即用于核酸提取,則需保存于-70下.第十七頁(yè)，共56頁(yè)。膿液膿液l膿液的處理依情況而定,如用于分枝桿菌(如結(jié)核桿菌)核酸測(cè)定的標(biāo)本,粘稠的膿液可采用痰標(biāo)本的處理模式，先進(jìn)行液化，再離心取沉淀提取DNA；水樣的膿液則直接離心,沉淀用生理鹽水洗23次后,即可用于DNA提取。l對(duì)于用于非分枝桿菌測(cè)定的膿液標(biāo)本,如過(guò)于粘稠,則加入適量生理鹽水,充分振蕩后,靜置,取上清立即離心,沉淀用于DNA提取;如為水樣,則按上述直接離心取沉淀即可。l沉淀

8、標(biāo)本的保存條件同樣為-70。第十八頁(yè)，共56頁(yè)。體液體液l臨床體液標(biāo)本包括胸水,腹水,腦脊液,尿液等,可按水樣標(biāo)本的方式離心取沉淀后,提取核酸。沉淀樣本的保存同上。第十九頁(yè)，共56頁(yè)。乳汁乳汁l 乳汁有時(shí)也可作為標(biāo)本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、結(jié)核分枝桿菌和布魯氏菌等的PCR檢測(cè)。 第二十頁(yè)，共56頁(yè)。乳汁中布魯菌乳汁中布魯菌DNA的提取的提取l試劑準(zhǔn)備 NET緩沖液: 50mmol/L NaCl, 125mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl pH7.6; 24%十二烷基硫酸鈉（SDS）; 蛋白酶K; RNase。 第二十一頁(yè)，共56頁(yè)。第二十二頁(yè)，共56

9、頁(yè)。乳汁中分枝桿菌乳汁中分枝桿菌DNA的提取的提取l試劑準(zhǔn)備 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 異硫氰酸胍鹽（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸鈉。 玻璃珠：（直徑：425-600um）第二十三頁(yè)，共56頁(yè)。第二十四頁(yè)，共56頁(yè)。組織組織 l組織有新鮮組織塊和石蠟切片。新鮮組織塊的處理步聚首先用生理鹽水洗兩次,然后將其搗碎或切碎，加入生理鹽水后劇烈震蕩混勻,離心，棄上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鮮組織最好是保存于50%乙醇中,具體作法是，先用生理鹽水將組織洗一次,切成寬度小于1cm的小片,加

10、入適量的生理鹽水,然后,邊搖邊加入無(wú)水乙醇至終濃度為50%.這樣固定的組織標(biāo)本室溫下可保存數(shù)日,4可保存6年。l石蠟切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脫蠟,再用蛋白酶K消化后即可進(jìn)行DNA提取。第二十五頁(yè)，共56頁(yè)。臨床標(biāo)本的濾紙上保存臨床標(biāo)本的濾紙上保存l臨床標(biāo)本置于經(jīng)過(guò)處理的濾紙片上，如靶核酸為DNA，可室溫保存數(shù)月至數(shù)年，如靶核酸為RNA，則可穩(wěn)定數(shù)周。 l保存在濾紙上的標(biāo)本，保存時(shí)間長(zhǎng)，還可因?yàn)闃?biāo)本中的PCR抑制物如血紅蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于濾紙上，而不對(duì)后面的擴(kuò)增檢測(cè)造成影響。 l不管是全血、血清（漿）。還是尿液、糞便、分泌物等均可此種方法。 第二十六頁(yè)，共56頁(yè)。臨床標(biāo)本中

11、臨床標(biāo)本中PCR反應(yīng)抑制物反應(yīng)抑制物l內(nèi)源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血紅素及其代謝產(chǎn)物、白細(xì)胞內(nèi)的乳鐵蛋白、肌紅蛋白、脂類(lèi)、粘蛋白、尿素、離子、膽鹽、多糖等。 l外源性的 :如肝素抗凝劑、纖維素和硝酸纖維素、過(guò)度UV照射后的礦物油、手套滑石粉、標(biāo)本容器或采樣器材上含有的抑制物。 第二十七頁(yè)，共56頁(yè)。肝素的作用機(jī)理肝素的作用機(jī)理 l肝素對(duì)MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和TAQ DNA聚合酶均很強(qiáng)的抑制作用，如果臨床標(biāo)本為肝素抗凝，則在核酸純化過(guò)程中，標(biāo)本中的肝素可結(jié)合于DNA和RNA上，盡管肝素和核酸本身都帶正電荷。l對(duì)標(biāo)本進(jìn)行煮沸、凝膠過(guò)濾、酸堿處理后凝膠過(guò)濾、反復(fù)乙醇沉淀等均不能去除肝素的這種干擾作用。

12、l每g核酸標(biāo)本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。l在標(biāo)本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 2小時(shí)) 可去除肝素的抑制作用。第二十八頁(yè)，共56頁(yè)。血紅蛋白、乳鐵蛋白（lactoferrin）l血紅蛋白和乳鐵蛋白分別是紅細(xì)胞和白細(xì)胞內(nèi)的主要PCR抑制物,它們均含有鐵。l抑制機(jī)制可能是：（1）與這些蛋白釋放鐵離子至PCR混合物中有關(guān)。研究鐵的抑制效應(yīng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其干擾DNA合成，而且膽紅素、膽鹽和氯化高鐵血紅素（Hemin）等血紅蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）亞鐵血紅素(Heme)可通過(guò)返饋抑

13、制調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性及協(xié)調(diào)紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白成分的合成。也觀察到，氯化高鐵血紅素通過(guò)直接作用于DNA聚合酶，與成為一個(gè)與靶DNA競(jìng)爭(zhēng)的抑制劑和核苷酸的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 。（3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有機(jī)物質(zhì)包裹所致，使得靶DNA不能接觸DNA聚合酶。第二十九頁(yè)，共56頁(yè)。血紅蛋白血紅蛋白l1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，與Mg2+濃度無(wú)關(guān)。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反應(yīng)混合液中可以進(jìn)行擴(kuò)增，加入1U單鏈DNA結(jié)合蛋白T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情況下，仍可擴(kuò)增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可實(shí)現(xiàn)從臨床標(biāo)本不提取純

14、化核酸直接擴(kuò)增靶DNA。l不同的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶對(duì)臨床標(biāo)本中的抑制物的敏感性不一樣 。第三十頁(yè)，共56頁(yè)。IgG lIgG的抑制作用是由于其與單鏈DNA的相互作用，使得靶DNA不能與DNA聚合酶相互作用 l使用煮沸作為標(biāo)本處理方法或使用PCR前的熱啟動(dòng),將增強(qiáng)IgG對(duì)PCR反應(yīng)的抑制 第三十一頁(yè)，共56頁(yè)。去除或減輕抑制的一些方法去除或減輕抑制的一些方法lNaOH處理可中和臨床標(biāo)本中的Taq DNA聚合酶抑制劑，但這種方法不適用于DNA含量低的標(biāo)本，因?yàn)镹aOH處理可使DNA大量丟失。第三十二頁(yè)，共56頁(yè)。去除或減輕抑制的一些方法去除或減輕抑制的一些方法l加入0.6% (wt/vol)牛血

15、清白蛋白（BSA）可降低血液對(duì)Taq DNA聚合酶的抑制效應(yīng)，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功擴(kuò)增，而通常血液含量只能是0.2%。lBSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的擴(kuò)增能力，使其對(duì)糞便和肉類(lèi)標(biāo)本中抑制物的抵抗能力分別提高10和20倍。l單鏈DNA結(jié)合T4基因32蛋白（gp32）有類(lèi)似BSA的增強(qiáng)效應(yīng)。第三十三頁(yè)，共56頁(yè)。核酸純化l核酸分離純化技術(shù)起源于二十世紀(jì)五十年代，在七十年代和八十年代中傳統(tǒng)的核酸沉淀溶解分離純化方法得到了普遍的應(yīng)用和推廣。l傳統(tǒng)的核酸提取方法常涉及去垢劑裂解、蛋白酶處理、有機(jī)溶劑提取及乙醇沉淀等步驟。 第三十四頁(yè)，共56頁(yè)。一般核酸提取試劑促

16、使靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋出的原理l靶核酸可以與宿主細(xì)胞整合，核內(nèi)游離及胞漿內(nèi)各種構(gòu)形存在于細(xì)胞內(nèi)，如測(cè)定的是病原微生物,則靶核酸存在于細(xì)菌、病毒、原蟲(chóng)或真菌細(xì)胞內(nèi)，如果上述細(xì)胞破裂,則靶核酸亦可存在于細(xì)胞外。 l一般均使用去垢劑(如Triton-100)裂解細(xì)胞，用一種蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化結(jié)合于核酸的蛋白質(zhì)，從而將靶核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來(lái)。第三十五頁(yè)，共56頁(yè)。核酸的分離純化核酸的分離純化 l核酸的分離純化就是要將蛋白、脂類(lèi)等干擾核酸擴(kuò)增的物質(zhì)去除。 l經(jīng)典方法l硅吸附法l對(duì)于商品核酸提取試劑盒，臨床實(shí)驗(yàn)室在使用前，必須對(duì)其核酸提取純度和效率進(jìn)行評(píng)價(jià)。 第三十六頁(yè)，共56頁(yè)。DNA提取的經(jīng)典方

17、法l即所謂的”酚-氯仿提取法” 第三十七頁(yè)，共56頁(yè)。第三十八頁(yè)，共56頁(yè)。RNA提取的獨(dú)特性提取的獨(dú)特性l臨床標(biāo)本及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中,存在大量對(duì)RNA具有強(qiáng)烈降解作用的RNase，而RNase較耐高溫,不易失活。l如何避免RNase對(duì)標(biāo)本的污染及防止RNase對(duì)提取的RNA的降解,是保證RNA成功提取的關(guān)鍵之所在。 第三十九頁(yè)，共56頁(yè)。 RNA提取所用器皿的處理提取所用器皿的處理l經(jīng)高壓滅菌的一次性使用的塑料制品如試管,離心管等基本上無(wú)RNase,可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA. l實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿經(jīng)常有RNase污染,使用前必須于180干烤8小時(shí)以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(

18、DEPC)的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯,試管和其它用品。lDEPC是RNase的強(qiáng)烈抑制劑。灌滿DEPC的器皿于37下放置2小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100干烤15分鐘，最后高壓蒸汽下15分鐘。上述處理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通過(guò)羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。第四十頁(yè)，共56頁(yè)。RNA提取所用溶液的準(zhǔn)備提取所用溶液的準(zhǔn)備 l對(duì)于RNA提取所需溶液的配制,必須用高壓滅菌的水和RNA研究專(zhuān)用的化學(xué)試劑配制溶液,用干烤過(guò)的藥匙稱(chēng)取試劑,將溶液裝入無(wú)RNase的玻璃器皿?？赡艿脑?溶液均應(yīng)用0.1%DEPC于37至少處理12小時(shí),然后于100加熱15分鐘或高壓蒸汽滅

19、菌15分鐘。l須注意的是,DEPC可與胺類(lèi)迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng),因此不能用來(lái)處理含有Tris一類(lèi)的緩沖液,因此可存幾瓶新的,未開(kāi)封的Tris試劑以制備無(wú)RNase的溶液。第四十一頁(yè)，共56頁(yè)。RNA提取中提取中RNase 污染的控制污染的控制l實(shí)驗(yàn)操作人員的手是RNase污染最主要的潛在來(lái)源。 l策略是： 在準(zhǔn)備用于RNA純化的實(shí)驗(yàn)材料和溶液時(shí),以及在涉及RNA的整個(gè)提取操作過(guò)程中,都應(yīng)戴一次性手套。 在RNA提取實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)勤換手套。第四十二頁(yè)，共56頁(yè)。RNA提取的常用方法提取的常用方法 l表面活性劑加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。l胍鹽提取結(jié)合氯仿-酚抽提法。l胍鹽提取結(jié)合玻璃粉、二氧化硅等顆粒懸

20、浮吸附法等。第四十三頁(yè)，共56頁(yè)。異硫氰酸胍（異硫氰酸胍（GuSCN）結(jié)合氯仿）結(jié)合氯仿-酚提取法酚提取法 第四十四頁(yè)，共56頁(yè)。核酸提取的改良方法核酸提取的改良方法 l旋轉(zhuǎn)離心柱（SPIN COLUMN）方法l玻璃粉吸附法 l二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 l微量全血核酸提取法 ：NaI 方法l其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自動(dòng)核酸純化儀第四十五頁(yè)，共56頁(yè)。旋轉(zhuǎn)離心柱（旋轉(zhuǎn)離心柱（SPIN COLUMN）l屬于硅吸附方法的一種。在原理上現(xiàn)行的旋轉(zhuǎn)離心柱系統(tǒng)通?？煞譃槿齻€(gè)部分：第一部分是利用裂解液促使細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的核酸釋放出來(lái)；第二部分是把釋放的核酸特異地吸附在特定的硅載體上，當(dāng)然這種載體只對(duì)核酸有較強(qiáng)的親和力和吸附力而對(duì)其它的生化組分如蛋白質(zhì)、多糖、脂類(lèi)則不相親和也不吸附；第三部分是把吸附在特定載體上的核酸洗脫下來(lái)，從而得到純化的核酸。 第四十六頁(yè)，共56頁(yè)。第四十七頁(yè)，共56頁(yè)。第四十八頁(yè)，共56頁(yè)。玻璃粉吸附法玻璃粉吸附