兔冬眠心肌模型骨髓干細(xì)胞動(dòng)員及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá)

1、兔冬眠心肌模型骨髓干細(xì)胞動(dòng)員及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的基因表達(dá) 08-10-15 13:58:00 作者：趙慶斌 編輯：studa20【摘要】 目的: 探討兔冬眠心肌模型外周血骨髓干細(xì)胞的變化及缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子基因表達(dá)的變化. 方法: 選用雄性日本大耳白兔為研究對(duì)象，通過(guò)開胸不全結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支方法建立冬眠心肌動(dòng)物模型. 將成功制備的24只兔模型隨機(jī)分為4組，即缺血3 d組、缺血7 d組、缺血28 d組和假手術(shù)對(duì)照組. 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組模型動(dòng)物外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞百分率，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)定各組動(dòng)物模型缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)

2、. 結(jié)果: 兔冬眠心肌模型于手術(shù)后出現(xiàn)骨髓干細(xì)胞動(dòng)員，1 wk內(nèi)達(dá)高峰，隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減弱；同時(shí)相應(yīng)地出現(xiàn)手術(shù)后1 wk內(nèi)缺血心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)明顯升高，隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)逐漸降低. 結(jié)論: 冬眠心肌可通過(guò)組織局部血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)增高而動(dòng)員骨髓干細(xì)胞進(jìn)入外周血. 【關(guān)鍵詞】 心肌頓抑 骨髓干細(xì)胞 動(dòng)員 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子0引言干細(xì)胞治療缺血性心臟病在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和小規(guī)模臨床試驗(yàn)均取得了很大進(jìn)展1-2. 目前這方面的研究主要集中在兩方面，即急性心肌梗死和心肌梗死后慢性心衰，這兩方面均屬于冠心病的嚴(yán)重類型和晚期階段. 冬眠心肌屬于存活心肌，大多存在于冠心病的早期階段即未發(fā)生心肌梗死時(shí)

3、，此時(shí)同樣存在心肌缺血和局部微環(huán)境的改變. 本研究以兔冬眠心肌模型為研究對(duì)象，探討心肌冬眠狀態(tài)下外周血骨髓干細(xì)胞的變化及心肌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因表達(dá)的變化，為干細(xì)胞移植治療冬眠心肌提供理論基礎(chǔ).1材料和方法1.1材料兔淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于北京普利萊基因技術(shù)有限公司；CD34單克隆抗體及陰性對(duì)照購(gòu)于B.D公司；RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司；SYBR ExScriptTM RTPCR Kit(Perfect Real Time)試劑盒購(gòu)自TaKaRa大連寶生物工程有限公司；Trizol購(gòu)于

4、Invitrogen公司. Beckman Coulter公司流式細(xì)胞儀和美國(guó)BioRad公司iQ5型 Real Time PCR儀分別由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心和第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科提供. 選用雄性日本大耳白兔30只，體質(zhì)量23 kg，購(gòu)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心. 實(shí)驗(yàn)前，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)1 wk.1.2方法0無(wú)損傷帶針縫合線穿過(guò)左前降支下方，將直徑分別為0.8 mm和0.1 mm的粗、細(xì)絲線各一根置于左前降支前緣，將絲線與左前降支一起結(jié)扎，隨后迅速抽出細(xì)絲線，相當(dāng)于血管90%狹窄. 觀察左前降支遠(yuǎn)端血管充盈不明顯，左心室前壁和心尖部心肌顏色稍變暗，表明結(jié)扎成功. 假手術(shù)

5、組將縫合線穿過(guò)左前降支下方，但不結(jié)扎. 術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)，肌肉注射青霉素（40萬(wàn)U/只）3 d預(yù)防感染. 術(shù)中及術(shù)后2 d內(nèi)共死亡6只，均為模型組，原因?yàn)闅庑睾褪а^(guò)多. 術(shù)后第3 d對(duì)實(shí)驗(yàn)兔行超聲心動(dòng)圖檢查，觀察左室前壁出現(xiàn)節(jié)段性運(yùn)動(dòng)障礙，未出現(xiàn)心肌梗死征象，提示手術(shù)成功. 將存活的24只兔隨機(jī)分為缺血3 d組，缺血7 d組、缺血28 d組和假手術(shù)組，每組6只.GGC AGA AGA AGG AGA CAA TAA ACC3， 下游引物為5CAG AGG CAC GCA GGA AGG3，產(chǎn)物大小361 bp；管家基因actin上游引物為5CCA TCT ACG AGG GCT ACG C3，下

6、游引物為5CGG CTG TGG TCA CGA AGG3，產(chǎn)物大小397 bp. （2）標(biāo)本采集和總RNA提取：各組每只兔按各自觀察時(shí)間點(diǎn)處死，取出心臟，切取左室前壁缺血心肌迅速置于液氮中保存. 取新鮮組織樣品100 mg剪碎，加入1 mL Trizol 裂解細(xì)胞，勻漿后進(jìn)行總RNA的提取. 對(duì)所有提取的總RNA進(jìn)行紫外分光光度定量，測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260 nm和280 nm處的吸收值，計(jì)算A260/A280值，均在1.82.0之間. （3）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行. 在20 L反應(yīng)體系中分別加入：樣本RNA模板0.5 g，隨機(jī)六聚體引物(0.2 g/L)1 L,

7、加入去RNA酶水至12 L, 70孵育5 min；然后加入5反應(yīng)緩沖液4 L,RNase 抑制劑（20 u/L）1 L,10 mmol/L dNTP 混合液2 L，25孵育5 min；最后加入RevertAidTM MMuLV反轉(zhuǎn)錄酶（200 u/L）1 L，總體積為20 L. 混勻后置于下列條件反應(yīng)：42 60 min，70 10 min，產(chǎn)物即為cDNA. （4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR：反應(yīng)體系在美國(guó)iQ5 RealTime PCR儀上進(jìn)行,采用25 L反應(yīng)體系，其中含SYBR GREEN PCR mix 12.5 L,去離子水10.5 L，cDNA 1 L（50 ng）,引物（5 mmol/

8、L）各1 L. PCR擴(kuò)增條件為：95 10 s預(yù)變性；95 5 s，57 15 s，72 10 s，共40個(gè)循環(huán). 取待測(cè)cDNA樣品，按10倍濃度梯度稀釋，在同樣反應(yīng)條件下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制作目的基因和管家基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)擴(kuò)增效率.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用GraphPad Prism 4.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析. 計(jì)量資料以xs表示，組間比較采用單因素方差分析及LSDt檢驗(yàn)，P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1各組模型兔外周血CD34+細(xì)胞百分率的變化冬眠心肌模型兔于術(shù)前、術(shù)后3,7,28 d各時(shí)間點(diǎn)外周血中CD34+細(xì)胞百分率分別為2.660.34, 5.160.61, 8.690.34, 2.730.57. 術(shù)后3 d組和7 d組外周血CD34+細(xì)胞百分率高于術(shù)前和術(shù)后28 d組（P0.01）；術(shù)后7 d組較3 d組為高（P0.05）.2.2各組模型兔冬眠心肌組織中VEGF mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量分析法中比較2-CT法，利用公式F=2-CT得到VEGF mRNA表達(dá)的相對(duì)量. 假手術(shù)和術(shù)后3，7，28