味地黃方對慢性鋁暴露癡呆大鼠記憶功能保護作用的研究

1、味地黃方對慢性鋁暴露癡呆大鼠記憶功能保護作用的研究    【摘要】&nbsp;    目的 研究六味地黃方對慢性鋁暴露癡呆大鼠記憶功能的保護作用及其機制。方法 采用胃腸道慢性染鋁的方法制備記憶功能障礙大鼠模型，用Morris水迷宮實驗檢測大鼠空間學習記憶能力，并通過對血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的測定，研究慢性鋁暴露導致大鼠記憶功能損害及六味地黃方的干預機制。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組大鼠學習記憶能力降低(P<0.01，P<0.05)，血漿MDA水平增加而SOD活性減低(

2、P<0.01，P<0.05)。與慢性鋁暴露模型組相比，六味地黃方能提高大鼠血漿中SOD活性，降低MDA含量，改善了慢性鋁暴露大鼠學習記憶功能(P<0.01，P    【關(guān)鍵詞】&nbsp; 六味地黃方;慢性鋁暴露;老年性癡呆;脂質(zhì)過氧化;水迷宮    Effects of Liuweidihuang on memory function of rat with chronic aluminum exposureLIU YanHui，TIAN Xin.Department of Biolog

3、y Medical Engineering，Tianjin Medical University，Tianjin 300070, China【Abstract】 Objective To explore the effects of Liuweidihuang on memory function of rat with chronic aluminum exposure and its mechanism. Methods Aluminum toxic model rats were produced by gastrointestinal tract of AlCl3.Morris wat

4、er maze test，plasma chemistry index superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) were used to measure the memory function and its mechanism. Results Compared with control group, the memory function decreased, the MDA level was increased and the SOD activity was decreased in model group. Comp

5、ared with model group, SOD activity was increased and MDA level was decreased, the memory function was improved in Liuweidihuang group. Conclusions Liuweidihuang can prevent the rat from chronic aluminum damage by increasing antioxidation enzyme activity and decreasing neuronal lipid peroxidation re

6、action.【Key words】 Liuweidihuang;Chronic aluminum exposure;Alzheimer&prime;s disease (AD);Superoxide dismutase (SOD);Malondialdehyde (MDA) 阿爾茨海默病(AD)，是老年期最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病癥之一，主要表現(xiàn)為學習記憶功能障礙和行為異常。近年研究證實，慢性鋁暴露是導致AD的主要環(huán)境因素之一1。自由基所造成的脂質(zhì)過氧化損傷可能就是慢性鋁暴露發(fā)揮神經(jīng)毒性作用的重要途徑2。因此具有抗氧化功能的藥物常被用來對抗鋁中毒導致的神經(jīng)損傷。但是常用的合成抗氧化

7、劑在動物模型實驗中被發(fā)現(xiàn)有毒副作用，所以尋找安全、有效的抗氧化干預手段成為防治鋁中毒的研究熱點。六味地黃方為歷代醫(yī)家用于延緩衰老的代表藥，其單味藥中含有較強的抗氧化成分。因此，開發(fā)利用以六味地黃方為代表的天然植物藥作為抗氧化劑，可能是防治慢性鋁暴露導致AD的有效途徑。本實驗通過觀察六味地黃方對慢性鋁暴露癡呆大鼠血漿中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量及Morris水迷宮空間學習記憶的行為學影響，為抗氧化類天然植物藥治療AD提供實驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 動物和試劑 健康清潔級雄性SD大鼠40只，鼠齡10個月，體重450550 g(由中國人民解放軍軍事科學院實驗動物中心提供)。A

8、lCl3&middot;6H2O(MV254，由天津市耀華化工廠提供)，檸檬酸三鈉(MV294.10，由天津市化學試劑一廠提供)，SOD、MDA(由南京建成生物工程研究所提供)，Morris水迷宮測試系統(tǒng)(RB100A，由北京新天地科技有限公司提供)。1.2 動物分組及模型的制備 將大鼠按體重隨機分為4組：正常對照組、模型組、六味地黃方低濃度組(低濃度組)、六味地黃方高濃度組(高濃度組)，每組10只大鼠。正常對照組大鼠每天自由攝食普通飼料，其余大鼠每日攝取的鼠糧為普通飼料中加入結(jié)晶氯化鋁，劑量為Al3+10 mg/kg。為促進鋁的吸收，加鋁飼料中按111加入檸檬酸三鈉。為排除檸檬酸鹽的

9、影響，正常對照組大鼠進食的普通飼料中也加入等量檸檬酸鹽。取熟地黃24 g、山藥12 g、山茱萸12 g、澤瀉9 g、茯苓9 g、牡丹皮9 g，制成濃度為1.0 g/ml的六味地黃生藥。正常對照組大鼠與模型組大鼠每天2 ml/只生理鹽水灌胃，六味地黃方低濃度組大鼠每天2 ml/只六味地黃生藥灌胃，六味地黃方高濃度組大鼠每天4 ml/只生藥灌胃。各組大鼠均喂養(yǎng)6個月。1.3 大鼠血漿SOD和MDA水平的測定 大鼠喂養(yǎng)6個月后，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血0.2 ml，離心取上清液，所測指標按南京建成生物工程研究所提供的試劑盒說明書進行測定。1.4 大鼠空間學習記憶功能的Morris水迷宮行為學檢測 Morris

10、水迷宮為一個直徑150 cm、高50 cm的黑色圓形鐵桶，注水至深度16.5 cm左右，實驗過程中水溫保持在(26&plusmn;1)。因測試對象為白色SD大鼠，測試環(huán)境背景為黑色，因此在水中放入碳素墨水，混勻，使水不透明。在水池內(nèi)設(shè)兩條虛擬垂直線，將水池均分為4個象限，分別為NE(第)、SE(第)、SW(第)及NW(第)象限，在SW(第象限)正中距池壁30 cm處放一個直徑10 cm、高15 cm的圓形黑色平臺，平臺平面低于水平面1.5 cm左右，Morris水迷宮實驗分為定位航行實驗和空間探索實驗兩類。定位航行實驗用于檢測大鼠的學習能力，連續(xù)訓練4 d。訓練第一天，撤掉水池中平臺，

11、讓大鼠自由游泳(NE象限入水)2 min，觀察大鼠游泳的速度及姿勢，剔除不合格的大鼠。從第2天起放入平臺，每天分上午、下午兩個時間段(間隔8 h)對每只大鼠分別進行訓練。分別從4個坐標象限內(nèi)標定的入水點將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(即逃避潛伏期)及直線搜索策略變化的趨勢?？臻g探索實驗考察大鼠對平臺位置的記憶能力。定位航行實驗后，即在第5天上午，撤去平臺，取NE(第)象限為入水點，將大鼠面向池壁放入水中，記錄其在120 s內(nèi)游泳時各象限的記憶頻度、時間分布及第一環(huán)點數(shù)。1.5 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均用SPSS15.0統(tǒng)計軟件包進行處理，數(shù)據(jù)以x&plusm

12、n;s表示。2 結(jié) 果2.1 大鼠血漿SOD活性、MDA含量的測定結(jié)果 見表1，與正常對照組比較，模型組大鼠血漿SOD活性明顯下降、MDA含量顯著增高(均P<0.01);與模型組比較，六味地黃方低濃度組、高濃度組SOD活性增高，MDA含量明顯下降(均P<0.05);與正常對照組比較，六味地黃方低濃度組及高濃度組大鼠SOD活性下降、MDA的含量增加(P<0.01，2)P<0.05;與模型組比較：3)P<0.052.2 Morris水迷宮定位航行實驗結(jié)果 表2顯示各組大鼠在定位航行實驗中的潛伏期變化過程。在整個訓練過程中，正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠學

13、習能力始終好于模型組。表2 各組大鼠定位航行實驗潛伏期比與正常對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01;與模型對照組比較：3)P<0.05，4)P<0.01，下表同在訓練的第一時段各組大鼠逃避潛伏期沒有顯著差別，隨著訓練次數(shù)的增加，正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠潛伏期呈現(xiàn)穩(wěn)定性下降，并且趨勢明顯。模型組大鼠潛伏期下降趨勢緩慢，而且在訓練過程中潛伏期下降有波動。全部大鼠在最后三個時間段潛伏期趨于穩(wěn)定。比較各個時間段潛伏期的均值，從第二個訓練時段開始模型組大鼠的逃避潛伏期明顯高于正常對照組，兩組差異有顯著性(P<0.01);六味地黃方低濃度組和高濃

14、度組大鼠與慢性鋁暴露模型組大鼠比較也有明顯差異(P<0.05，P<0.01)。與正常對照組相比，六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠逃避潛伏期時間延長(P<0.05)。全部大鼠在第4天都可在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺。以上實驗結(jié)果表明，慢性鋁暴露損害了大鼠學習功能，六味地黃方可以改善慢性鋁中毒對大鼠學習功能的損害。大鼠訓練過程中搜索策略的變化趨勢見表3，六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠學習能力明顯好于模型組。正常對照組、六味地黃方低濃度組和六味地黃方高濃度組大鼠出現(xiàn)直線式搜索策略的時間較早，在訓練的第3個時段，正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠已多次直線航行，而此時模型組大鼠直

15、線搜索策略不明顯。全部大鼠在第4天均能在規(guī)定時間內(nèi)找到平臺，分析各個訓練時間段大鼠直線搜索的平均次數(shù)，正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠比模型組大鼠增多，差異有顯著性(P<0.05，P<0.01)。說明在學習訓練過程中，正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠學習記憶能力好于慢性鋁暴露模型組。2.3 大鼠空間探索實驗結(jié)果 各組大鼠在4個象限游泳的時間及所在象限百分比，見表4。正常對照組、六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠在平臺象限游泳點數(shù)及所占時間百分比高于模型組，差異有顯著性(P<0.01)。與正常對照組相比，六味地黃方低濃度組和高濃度組大鼠在平臺象限游泳點數(shù)及

16、所占時間百分比有所下降(P<0.05)。與模型組大鼠(1.83&plusmn;0.83)相比，六味地黃方低濃度組(10.67&plusmn;2.67)和高濃度組(9.33&plusmn;2.78)大鼠在第一環(huán)的游泳點數(shù)顯著高于模型組(P<0.01)。與正常對照組(13.50&plusmn;1.33)相比，六味地黃方低濃度組和六味地黃方高濃度組第一環(huán)游泳點數(shù)下降(P3 討 論慢性鋁暴露是導致AD的主要環(huán)境因素之一，鋁對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷與其促進脂質(zhì)過氧化反應(yīng)有關(guān)3。慢性鋁暴露導致記憶功能障礙的機制可能與鋁增強過渡態(tài)金屬對機體的氧化損傷有關(guān)4。鋁可以與Fe2

17、+競爭性地和鐵蛋白及載鐵蛋白結(jié)合，而使細胞中游離的Fe2+增加，F(xiàn)e2+可使細胞膜的脂質(zhì)過氧化增加，SOD減少，特別是增強鐵催化的活性氧類(ROS)自由基的生成和脂質(zhì)過氧化過程，對神經(jīng)細胞產(chǎn)生毒性作用，導致神經(jīng)系統(tǒng)細胞結(jié)構(gòu)和功能受損，從而影響學習和記憶功能5。長期以來，傳統(tǒng)中醫(yī)藥學在防治疾病和健身益壽方面發(fā)揮了積極的作用，六味地黃方為歷代醫(yī)家用于延緩衰老的代表藥。六味地黃方的單味藥中含有較強的抗氧化成分，如丹皮中主要含有丹皮酚和多種苷，山茱萸中苷類含量較高，茯苓中含大量糖類，而酚類、苷類、糖類為天然植物中抗氧化活性較強的物質(zhì)，因而六味地黃方具有較強的抗氧化能力6。六味地黃方的降血脂、清除自由基

18、的作用已初步顯示了對神經(jīng)損傷的防治作用。六味地黃丸可減少老年小鼠腦部MDA的含量，六味地黃煎劑可使家蠅腦中脂褐素含量降低，SOD和蛋白質(zhì)含量升高，顯著延長家蠅的壽命。六味地黃方劑可明顯增強小鼠血中SOD和GSHPx活性，使脂質(zhì)過氧化反應(yīng)下降。另外，長期給予六味地黃丸可提高快速老化模型小鼠記憶獲得和保持能力，改善其空間記憶能力。六味地黃丸還能明顯提高小鼠血漿VitC含量，間接地幫助機體修復由各種原因生成過多的生物分子自由基。同時由于VitC能使VitE恢復原來活性，從而可以協(xié)同維持膜結(jié)構(gòu)的完整性，流動性以及穩(wěn)定性7。本研究中，六味地黃方可顯著提高大鼠血中SOD活性，并使MDA含量明顯下降。結(jié)果證

19、實六味地黃方可以增強機體對自由基的清除能力，由此阻斷自由基的連鎖反應(yīng)，預防自由基的損傷，六味地黃方能明顯減少大鼠血漿中MDA含量，其作用途徑除了抑制自由基反應(yīng)外，還可能與該方促進GSHPx催化分解脂質(zhì)過氧化物有關(guān)。通過以上作用，六味地黃方減輕了自由基對機體的損害，保證了生物膜的完整性、通透性，從而對防治神經(jīng)退行性病變起到了十分重要的作用?？傊兜攸S方可以改善慢性鋁暴露對大鼠學習記憶的損害，通過縮短學習過程，促進記憶保持、改善搜索策略，來彌補慢性鋁暴露對大鼠智能的損害。本研究認為，開發(fā)利用以六味地黃方為代表的天然植物藥作為抗氧化劑是防治慢性鋁暴露導致記憶損害的有效途徑。    【參考文獻】&nbsp; 1 Rodella LF，Ricci F，Borsani E，et al.Aluminum exposure induces Alzheimers diseaselike histopathological alterations in mouse brainJ.Histol Histopathol，2008;23(4)：4339.2 Philip T，Michael F.A revi